Abstract
NKX2-1
, som koder for en homeobox transkripsjonsfaktor, forsterkes i omtrent 15% av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), hvor det er tenkt å drive kreftcellevekst og overlevelse. Men virkningsmekanismen fortsatt i stor grad ukjent. For å identifisere relevante nedstrøms transkripsjons mål, her har vi gjennomført en kombinert NKX2-1 transkriptomet (NKX2-1 knockdown etterfulgt av RNAseq) og cistrome (NKX2-1 bindingsseter med ChIPseq) analyse i fire
NKX2-1 Anmeldelser – forsterkede humane NSCLC cellelinjer. Mens NKX2-1 regulerte gener skilte mellom de fire cellelinjer analysert, dukket celleproliferasjon som et felles tema. Videre, i 3 av de 4 cellelinjer, epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) var blant de øverste NKX2-1 oppregulert mål, som vi bekreftet på proteinnivået ved western blot. Interessant, EGFR knockdown førte til oppregulering av NKX2-1, noe som tyder på en negativ feedback loop. I samsvar med dette funnet, kombinert knockdown av NKX2-1 og EGFR i NCI-H1819 lungekreftceller redusert celleproliferasjon (så vel som MAP-kinase og PI3-kinase signale) mer enn knockdown av enten alene. Likeledes NKX2-1 knockdown forbedret vekst-hemmende effekt av EGFR-inhibitor erlotinib. Til sammen våre funn implisere EGFR som en nedstrøms effektor av NKX2-1 i
NKX2-1
forsterket NSCLC, med mulige kliniske implikasjoner, og gir en rik datasett for å undersøke ytterligere formidlere av NKX2-1 drevet onkogenese.
Citation: Clarke N, Biscocho J, Kwei KA, Davidson JM, Sridhar S, Gong X, et al. (2015) Genomics impliserer EGFR som Nedstrøms megler i
NKX2-1
Amplified ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 10 (11): e0142061. doi: 10,1371 /journal.pone.0142061
Redaktør: Jen-Tsan Ashley Chi, Duke University, USA
mottatt: 26 januar 2015; Godkjent: 16 oktober 2015; Publisert: 10.11.2015
Copyright: © 2015 Clarke et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: Den komplette datasettet av rå RNAseq og ChIPseq leser er tilgjengelig på NCBI Sequence Les Archive (Tiltredelse SRP045118)
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av en bevilgning fra Tobakks Related Disease Research Program (21XT-0054). NC ble støttet av stipend fra Gates Millennium Foundation og Stanford Cancer Biology Program, og JMD fra Stanford Tumor biologi Training Program. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lung kreft står for det største antallet kreftdødsfall i USA [1]. Det er to hovedklasser, småcellet lungekreft og ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), sistnevnte som representerer ca 85% av tilfellene, og inkludert adenokarsinom, plateepitelkarsinom, og store cellekreft histologier [2]. Blant NSCLCs, anerkjente kreftDriverne inneholder aktive mutasjoner i
EGFR
,
KRAS
,
BRAF Kjøpe og
ErbB2
(HER2), samt rearrangements av
ALK Hotell og
ROS1 product: [3]. Noen av disse, bare nylig identifisert, er nå verdifulle terapeutiske mål, og understreker viktigheten av å definere nye molekylære mål og mekanismer.
NKX2-1 plakater (også kalt
TITF1
og
TTF-en
) koder for et homeobox transkripsjonsfaktor, og er funnet forsterkes ved cytoband 14q13 i ca 15% av NSCLCs (hovedsakelig adenokarsinomer) [4, 5]. Forstå dens mekanismer kan gi ny innsikt i lunge kreftutvikling, og nye strategier for terapi. NKX2-1 er uttrykt i den normale utvikling av lunge (så vel som skjoldbruskkjertelen og forhjernen) [6], hvor det er essensielt for organogenese. I voksen lunge, er NKX2-1 uttrykk begrenset til klubbens celler (Clara) og type II pneumocytes, hvor det regulerer surfactant produksjon.
I mange år har NKX2-1 uttrykk blitt brukt av patologer å utlede en lunge opprinnelsen til Kreftsvulster [7]. Nylig,
NKX2-1
har vært knyttet mer direkte til lungekreft, hvor genet locus er forsterket i noen tilfeller fører til økt lungecancer celleproliferasjon og overlevelse [8-11]. Mens sine dobbeltroller i kjøre lunge utvikling og differensiering på den ene siden, og lungekreft (ofte sett på som de-differensiering) på den andre virke paradoksalt, passer NKX2-1 godt inn i en ny klasse av «avstamning-overlevelse» onkogener-ofte mestre transkripsjons regulatorer av normal celle avstamning som blir deregulert i kreft som stammer fra at avstamning [12]. Andre eksempler inkluderer androgen reseptor (AR) i prostata cancer, og MITF i melanoma.
Nyere studier har identifisert kandidat nedstrøms mediatorer og samarbeidspartnere av NKX2-1 onkogenese, inkludert ROR1 [13] og LMO3 [14]. Likevel, de mekanismer som NKX2-1 bidrar til lunge kreft fortsatt i stor grad ukjent. Faktisk, i noen sammenhenger (hovedsakelig i mus), synes Nkx2-1 å fungere mer som en tumor suppressor, begrenser Kras-drevet lungekreft og lungekreft metastase [15, 16]. Her, for å avdekke onkogene mekanismer i menneske lungekreft, gjennomførte vi en kombinert transkriptomet (NKX2-1 knockdown etterfulgt av RNAseq) og cistrome (NKX2-1 bindingssteder av Chip-seq) analyse i
NKX2-1
forsterkede NSCLC cellelinjer. Blant funnene våre, identifiserer vi EGFR som en nedstrøms effektor av NKX2-1 drevet celleproliferasjon. Våre resultater gir ny innsikt i mekanismene for NKX2-1 mediert lungekreft, og et datasett for videre leting.
Materialer og metoder
Cell kultur
NCI-H1819, NCI-H661, HCC1195 og HCC1833 cellelinjer ble oppnådd fra Dr. John Minna (University of Texas Southwestern Medical Center) [17-20], hvor de ble godkjent av kort tandem repeat analyse. Alle cellelinjer ble dyrket ved 37 ° C i RPMI-1640 medium med L-glutamat, supplert med 10% (volum /volum) føtalt bovint serum og 1 x Pen /Strep.
NKX2-1 isoform uttrykk
En full-lengde NKX2-1 cDNA-klon (i pOTB7) ble hentet fra Origene. DNA-konstruksjoner som tilsvarer NKX2-1 transkripsjon variant 1 (NM_001079668.2, som koder for 401 aminosyrer) og NKX2-1 transkripsjon variant 2 (NM_003317; som koder for 371 aminosyrer, fraværende de N-terminale 30 aminosyrer av isoform 1) ble PCR forsterket fra Origene plasmid mal, sekvens-verifisert, og deretter subklonet inn i BamHI og Xhol områder av pCDNA6 (Invitrogen). PCR-primere var: variant 1-F TCGAGGATCCCATGTGGTCCGGAGGCAG; variant 2-F TCGAGGATCCCATGTCGATGAGTCCAAAGCAC; variant 1/2-R GATCCTCGAGTCACCAGGTCCGACCG. Expression konstruksjonene ble transfektert inn 293T celler (American Type Culture Collection) ved hjelp Lipofectamine 2000 (Life Technologies) etter produsentens protokoll, og cellelysater samlet 48 timer senere.
siRNA transfeksjon
For siRNA transfeksjon , 25,000-100,000 celler per seks-brønns plate vel eller 750,000-1,500,000 celler per 10cm plate var seeded og transfektert hjelp Lipofectamine 2000 (Life Technologies) etter produsentens protokoll. Alle sirnas var On-TARGETplus bassenger kjøpt fra Dharmacon /GE Healthcare (tabell A i S1 File) og transfekterte på en endelig siRNA konsentrasjon av 50 nM (med mindre annet er spesifisert) for 16 timer.
Western blot
Celler ble lysert i RIPA-buffer (Millipore) supplementert med 1 mM natriumortovanadat, 5 mM NaF, 1 mM PMSF, og 1X protease inhibitor cocktail (Roche). Deretter 40 pg Lysatet ble kjørt på en 4-12% polyakrylamidgel (Biorad) og overført til PVDF-membran (Biorad). Primære antistoffer som ble brukt var NKX2-1 (Santa Cruz Biotechnology, H-190, 1: 200), EGFR (Cell Signaling, D38B1, 1: 1000), MAPK (ERK1 /2) (Cell Signaling, 137F5, 1: 1000), p-MAPK (ERK1 /2) (Thr202 /Tyr204) (Cell Signaling, D12.14.4E, 1: 1000), AKT (Cell Signaling, C67E7, 1: 1000), p-AKT (Ser473) (Cell Signaling, D9E , 1: 1000), og α-tubulin (Santa Cruz Biotechnology, 1: 1000). Alle sekundære antistoffer var HRP-konjugert og SuperSignal West Pico Chemiluminescence (Pierce) som brukes for deteksjon. Western blot ble kvantifisert ved hjelp ImageJ. Alle vestlige blot resultatene er representative for flere uavhengige eksperimenter.
Celleproliferering /levedyktighet analysen
Celleproliferering /levedyktighet ble kvantifisert 0, 24, 48, 72 og 96 timer etter transfeksjon av kolorimetrisk analyse basert på den metabolske spaltning av tetrazoliumsaltet WST-1 i levedyktige celler, i henhold til produsentens protokoll (Roche). I noen eksperimenter, ble erlotinib (Santa Cruz Biotechnology) tilsatt ved indikerte konsentrasjoner (eller bærerkontroll). IC
50 verdier ble bestemt ved å tilpasse en ikke-lineær log (inhibitor) versus responskurve ved hjelp GraphPad Prism.
RNAseq
Cellelinjer ble transfektert med enten en NKX2-1 målretting siRNA basseng eller et ikke-måls kontroll (NTC) siRNA basseng i 16 timer. Total protein (for å bekrefte NKX2-1 knockdown) og RNA (av Qiagen RNAeasy Mini) ble samlet 40 timer etter transfeksjon. QRT-PCR ble utført først for å verifisere redusert transkripsjon for NKX2-1, samt en kjent NKX2-1 regulert gen, SFTPB [21]. For Q-RT-PCR, ble cDNA gjort ved hjelp av Superscript II (Life Technologies), og deretter qPCR ble gjort i det minste ved hjelp av triplikate TaqMan reagenser (Applied Biosystems) på en ABS Fast 7500 instrument. Relative transkripsjonsnivåer ble beregnet ved den ΔCT metode, og normalisert til GAPDH. Primere som brukes er oppført i tabell B i S1 fil. Strek cDNA bibliotek ble så fremstilt fra total RNA ved hjelp av Illumina TruSeq RNAseq kit, og sekvensert (single-end 36-bp leser) på en Illumina HiSeq instrument til en dybde på 24-63 millioner leser per prøve (Stanford Senter for Genomics og personlig medisin) (tabell C i S1 File). Sequence leser ble kartlagt til RefSeq transkriptom og transkripsjoner kvantifisert som leser per kilobase per million leser (RPKM) med DNAnexus. Påfølgende analyse ble begrenset til tilstrekkelig uttrykt transkripsjoner, definert som RPKM ≥1 i både NKX2-1 og kontrollknockdowns. Gene Set Enrichment analyse ble gjort ved hjelp av skrivebordet pakken [22]. Den komplette datasettet av rå RNAseq leser er tilgjengelig på NCBI Sequence Les Archive (Tiltredelse SRP045118).
Q-RT-PCR
For utvalgte gener, RNAseq resultater ble senere bekreftet av Q-RT -PCR. Revers transkripsjon ble utført ved hjelp av Super II reagenser som per produsentens protokoll (Life Technologies). qPCR ble gjort i minst tre eksemplarer bruker TaqMan eller SYBR Grønn reagenser (Applied Biosystems) på en ABS Fast 7600 instrument. Relative transkripsjonsnivåer ble beregnet ved den ΔCT metode, og normalisert til GAPDH. Primere som brukes er oppført i tabell B i S1 File.
Chromatin immunoprecipitation (chip) seq
Fem millioner celler per immunoprecipitation (IP) eller Ctrl-inngang prøven ble tverrbundet i 1% formaldehyd ved 25 ° C i 10 min, vasket i iskald PBS, lysert i cellelyseringsbuffer (5 mM PIPES (pH 8), 85 mm KCl, 1% Igepal, 1X Roche Complete mini Protease Inhibitor Cocktail) ved 4 ° C i 15 minutter, homogenisert mekanisk med 25 slag i en Dounce-homogenisator, lysert i kjernelyseringsbuffer (50 mM Tris (pH 8), 10 mM EDTA (pH 8), 1% (vekt /volum) SDS, 1 x Roche Complete mini Protease Inhibitor Cocktail) 30 min og sonikert med en Bioruptor XL for å få 200-600bp kromatin fragmenter. Sonikerte fragmenter ble fortynnet 10 ganger i IP-buffer (20 mM Tris (pH 8), 2 mM EDTA (pH 8), 2% Triton X-100, 0,2% natriumdeoksykolat, 200 mM NaCl) og inkubert over natten med en 1: 1 blanding av protein A /Protein G perler blokkert (5 mg /ml BSA, 1X Roche Komplett Mini proteasehemmer Cocktail) og pre-inkubert med 5 ug anti-NKX2-1 antistoff (Santa Cruz Biotechnology, H-190). Til spon-PCR eksperimenter, ble kanin-IgG (Santa Cruz Biotechnology, sc-2027) anvendt som en negativ kontroll. Prøvene ble vasket 3 ganger i IP-vaskebuffer (50 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl, 0,05% Triton X-100), en gang i TE-buffer, og eluert fra kulene til IP-elueringsbuffer (1% SDS, 100 mM NaHCO
3) ved 65 ° C i 1 time. Tverrbindinger ble reversert ved inkubering ved 65 ° C i 16 timer i modifisert elueringsbuffer (1% SDS, 100 mM NaHCO
3, 200 mM NaCl). ChIP’ed DNA ble renset ved hjelp av en Qiagen PCR rydde opp kit. For å validere første ChIP antistoffspesifisitet, ble qPCR utført med tilpassede TaqMan prober utformet til en kjent NKX2-1 bindingssete (
SFTPB
promoter) [21], sammenlignet med en negativ kontroll (et irrelevant genet,
WNT5A
), og normalisert til GAPDH. Primere som brukes er oppført i tabell B i S1 fil. Strekkode Chip og innspill DNA-bibliotekene ble deretter utarbeidet etter den Illumina TruSeq ChIPseq kit, og deretter sekvensert (single-end 36-bp leser) på en Illumina HiSeq instrument til en dybde på 18-60 millioner leser per prøve (Stanford Senter for Genomics og personlig Medicine) (tabell C i S1 File). Sequence leser ble kartlagt for det menneskelige genom (NCBI36, hg18) og vesentlige forpliktende toppene kalles bruker DNAnexus. Bindende topper ble kommentert i nærmeste genet (innen 100kb) ved hjelp av en tilpasset Perl-skript. MEME [23] ble brukt for
de novo
motiv skanning av NKX2-1 bindende topper (100bp sentrert på de 500 bindende topper assosiert med gener). Anrikning av kanoniske trasé ble evaluert ved Molecular signaturdatabase [24] «beregne overlapping» -funksjon. Den komplette datasettet av rå ChIPseq leser er tilgjengelig på NCBI Sequence Les Archive (Tiltredelse SRP045118).
Integrasjon av TCGA data
Behandlet TCGA lunge adenokarsinom [25] (n = 488) data, inkludert DNA kopiantall (Affymetrix SNP 6,0) og transkripsjonsnivåer (RNAseq), ble tilgjengelig fra Broad Firehose rørledningen. Saker med
NKX2-1
forsterkning ble definert av
NKX2-1
tumor /normal forholdstall 1,5, og fravær av amplifisering av tumor /normal 1,1. NKX2-1 høy-uttrykk ble definert som de 25 persentil av prøver. Gener som uttrykkes differensielt mellom
NKX2-1
amplifisert /høyt uttrykte (n = 30) og ikke-forsterket /høyt uttrykte (n = 60) ble identifisert ved to-klasse SAM-analyse [26], ved anvendelse av en falske funnrate (FDR) 0,05
Resultater
RNAseq analyse av NKX2-1 regulert transkriptomet
for å undersøke mekanismene for NKX2-1 mediert onkogenese, vi først. søkt å identifisere NKX2-1 regulerte gener i
NKX2-1
forsterket NSCLC cellelinjer. Vi har tidligere karakteriserte to NSCLC-cellelinjer, HCC1195 og HCC1833, som havn
NKX2-1
forsterkning og er avhengig av NKX2-1 (basert på studier knockdown) for celleproliferasjon [10]. Her undersøkte vi flere NSCLC linjer [19, 27], og identifisert to mer
NKX2-1
forsterket og avhengige linjer, H1819 og H661, for totalt fire cellelinjer (fig 1). Tre av de fire cellelinjer avledet fra lunge adenokarsinomer (H1819, HCC1195, HCC1833), mens den fjerde (H661) er av stor celle karsinom opprinnelse. Analyse av to linjer (HCC1195 og HCC1833) indikerte at den korteste av to rapporterte NKX2-1 isoformer (med variant N-termini) [6] var det en overveiende uttrykt (figur A i S2 File).
( A) Effektiv siRNA-mediert NKX2-1 knockdown i fire NSCLC-cellelinjer, demonstrert ved western blot. NTC, ikke-måls kontroll. α-tubulin tjener som en lasting kontroll. (B) NKX2-1 knockdown fører til betydelig redusert celleproliferasjon, målt ved hjelp av WST-1 levedyktighet assay. ***,
P
-verdi 0.001 (tosidige t-test).
For å identifisere NKX2-1 regulert gener i hver av de fire cellelinjer, transfektert vi cellene med en On-TARGETplus siRNA bassenget for å slå ned NKX2 -1, eller en ikke-måls kontroll (NTC) siRNA bassenget. (Fordi vi hadde tidligere vist at uavhengige sirnas målgruppe NKX2-1 utstilt NKX2-1 knockdown og redusert celleproliferasjon kan sammenlignes med NKX2-1 siRNA bassenget [10] (figur B, paneler A, B og C i S2 File), de fleste eksperimenter ble gjort ved hjelp av siRNA bassenget, med påfølgende validering av utvalgte sentrale funn ved hjelp av uavhengige siRNAs.) Vi deretter analysert resulterende transkriptom endringer ved RNAseq, sammenligne kontroll og NKX2-1 knockdown celler. Transcriptomes ble analysert 40 timer legge siRNA-transfeksjon, et tidspunkt ved hvilket vi har observert knockdown av både NKX2-1 transkripsjon og protein, så vel som redusert transkripsjon av overflateaktivt protein B (SFTPB), en kjent NKX2-1 regulert target [21 ] (fig 2A)
(A) Validating tilnærming. NKX2-1 knockdown fører til redusert uttrykk (med Q-RT-PCR) av den kjente NKX2-1 regulert målet, SFTPB. ***,
P
-verdi 0.001 (to tailed t-test). (B) Overlapping blant de fire NSCLC cellelinjer av gener betydelig (≥25%) ned eller oppregulert etter NKX2-1 knockdown. (C) over fire NSCLC cellelinjer, avslører GSEA betydelig berikelse av spredning gensettene; representant GSEA tomten vist (se også tabell G i S1 File). (D) Heatmap av topp nedregulert (blå) og oppregulert (røde) gener, følgende NKX2-1 knockdown i de fire NSCLC-cellelinjer. Legg merke til de delte downregulated uttrykk mønstre i H1819, H661 og HCC1195 (markert med grønn boks). ***,
P
-verdi 0,01; ***,
P
-verdi 0.001 (Pearson korrelasjon
P
-verdi, korrigert for flere test sammenligninger).
Avgrense analysen til godt målt gener (RPKM ≥1), ca 10 000 gener ble uttrykt i hver av cellelinjer, med 9,041 gener felles for alle fire cellelinjer (figur C, Panel A i S2 Fil, og tabell D i S1 File). Antallet gener vesentlig endret ved NKX2-1 knockdown, definert som minst 25% redusert eller økt uttrykk, varierte fra 1160 til 1615 blant de fire cellelinjer (figur C, Panel B i S2 Fil, og tabell E i S1-fil) . Til tross for dette, var noen gener ved at kriteriet gående forandret på tvers av alle fire cellelinjer. Ved NKX2-1 knockdown, ble bare fire gener konsekvent nedregulert (
NBL1
,
UNC84B
,
RRBP1
, og
FA2H
), og bare 9 gener ble konsekvent oppregulert (
C7ORF60
,
CHD7
,
HIST1H2BC
,
HIST1H2BD
,
HIST1H2BE
,
ID3
,
PIK3CB
,
TP53INP1
,
ZBTB4
) (figur 2B). Disse genene har forskjellige cellulære roller (tabell F i S1 File), hvorav RRBP1 funksjoner i endoplasmatisk retikulum stress respons og har blitt funnet oppregulert i lungekreft [28], og overekspresjon av ID3 transcriptional repressor har blitt rapportert å redusere lungekreft vekst
in vivo product: [29].
For å utforske temaer framfor enkeltgener, vi også gjennomført en to-klasse genet sett berikelse analyse (GSEA) [24], sammenligne transkripsjonsnivåer (over alle fire cellelinjer) følgende NKX2-1 knockdown
vs
. non-targeting kontroll. Den øverste anriket koniske veier inkludert flere knyttet til cellesyklus og celleproliferering (figur 2C, og tabell G i S1 File), i samsvar med den kjente rollen til NKX2-1 i celleproliferasjon [10, 30]. GSEA vurdering av hver cellelinje viste individuelt også berikelse av biologi knyttet til celleproliferasjon (tabell H i S1 File).
Selv om få gener møtte strenge terskelen for endret uttrykk på tvers av alle fire cellelinjer (kun 4 konsekvent downregulated og 9 oppregulert gener), vi undersøkt om flere gener kan vise en tilsvarende trend. Undersøke de 100 downregulated og oppregulert gener i hver cellelinje (tabell I i S1 File), en heatmap visualisering (Fig 2D) viste felles uttrykk mønstre blant 3 av de 4 cellelinjer (H1819, HCC1195 og H661), særlig blant gener downregulated med NKX2-1 knockdown. Dette funnet, underbygget av korrelasjonsanalyse (figur 2D), antydet at disse tre cellelinjene kanskje beste modellen
NKX2-1
forsterket NSCLC.
Med fokus på de tre cellelinjer (H1819, HCC1195 og H661) med felles uttrykk mønstre, ble 69 gener konsekvent nedregulert (minst 25%) ved NKX2-1 knockdown (fig 2B, og tabell J i S1 File), noe som indikerer at NKX2-1 positivt regulerer deres uttrykk. Selv om flere var mulige biologisk interesse, kjent blant dem var epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), rangert henholdsvis 8
th (av 763), 68
th (over 504), og 18
th (av 708) blant gener nedregulert ved NKX2-1 knockdown i de tre cellelinjer. Redusert ekspresjon av EGFR, samt andre utvalgte gener (for å underbygge resultatene RNAseq), ble verifisert ved Q-RT-PCR (figur C, Panel C i S2-fil). To uavhengige sirnas målretting NKX2-1 hver også redusert EGFR transkripsjonsnivåer (ved Q-RT-PCR, figur B, Panel D i S2 File) og protein nivåer (ved western blot, figur B, Panel E i S2 File), støtter EGFR reduksjon for å være en on-target RNA-interferens fenotype; andre kandidat NKX2-1 regulert gener ble ikke på samme måte evaluert. Vi hadde ikke tidligere klart å redde NKX2-1 knockdown ved ektopisk uttrykk for NKX2-1 (upublisert), muligens på grunn av ikke-optimale NKX2-1 uttrykk nivåer. Derfor kan vi ikke forsøker å ytterligere bekrefte on-target RNA interferens ved å redde den NKX2-1 knockdown effekt på EGFR nivåer.
ChIPseq analyse av NKX2-1 cistrome
Mens de ovennevnte strategi (NKX2-1 knockdown kombinert med RNAseq) viste NKX2-1 regulerte gener, det gjorde ikke skille direkte fra indirekte NKX2-1 transkripsjons mål. Derfor parallelt, gjennomførte vi kromatin immunoprecipitation (chip) -seq å definere NKX2-1 genombindingsseter og tilknyttede gener i samme fire
NKX2-1
forsterket /avhengige NSCLC cellelinjer. ChIP-PCR av
SFTB
promoter ble gjort før chip seq å validere spesifisitet av anti-NKX2-1 antistoff for ChIP (fig 3A).
(A) Validere NKX2-1 antistoff for Chip: ChIP-PCR identifiserer kjent NKX2-1 bindingssetet i SFTPB promoter. Legg merke til anrikning av SFTPB sammenlignet med et irrelevant gen (WNT5A). (B) Overlapping blant de fire NSCLC cellelinjer NKX2-1 bindende språk assosierte gener (innen 100Kb). (C)
De novo
motiv analyse re-oppdager den kjente NKX2-1 konsensus bindende motiv, og identifiserer berikelse av andre transkripsjonsfaktor bindende motiver nærliggende NKX2-1 bindingssteder. (D) NKX2-1 bindende topper identifisert ved EGFR locus i H1819 celler. De to såkalte toppene er identifisert med blå trekanter, og støtter leser vises i nærbilde innfelt. Bindende topper på EGFR i andre cellelinjer er vist i figur D, Panel B i S2 File.
I de fire cellelinjer, ChIPseq identifisert 150-1,844 NKX2-1 bindingssetet assosierte gener (nærmest gen innen 100Kb) (figur 3B, og Tabell K i S1 File). De fleste bindingsseter skjedde innenfor 100Kb av gener, som ville være forventet for arrangører eller forsterkere (figur D, Panel A i S2 File).
De novo
motiv analyse gjenvunnet den kjente Nkx2 bindingssetet (CACTY) [31] (figur 3C), validere ChIPseq datakvalitet. I tillegg, motiv analyse av NKX2-1 bindings topper identifiseres i nærheten anrikning av FOXA1 motiv i HCC1833 celler, i samsvar med den rapporterte interaksjonen av NKX2-1 med FOXA1 [32]. Andre NKX2-1 bindende språk assosiert transkripsjonsfaktor motivene i HCC1833 inkludert MYOD1, NFE2 og TCF3 (Fig 3C)
Til tross for det store antallet NKX2-1 bindingsseter, bare en liten del (2 forbundet gener. PVT1 og ZC3H7A) ble identifisert på tvers av alle fire
NKX2-1
forsterket cellelinjer (figur 3B), speiling resultatene av transkriptom analyse. Av notatet, ble NKX2-1 bindende topper funnet i forbindelse med
EGFR
i alle tre cellelinjer (H1819, H661 og HCC1195) som deler lignende transkripsjons svar på NKX2-1 knockdown (tabell K i S1-fil, fig 3D, Figur D, Panel B i S2 File). NKX2-1 bindende nettstedet motiver kan bli identifisert innen ChIPseq bindende toppene på
EGFR plakater (figur D, Panel B i S2 File). Når regnet på tvers av alle cellelinjene sammen, gener nærmeste (og innen 100Kb) til NKX2-1 bindingsseter ble beriket for bestemte kanoniske trasé, inkludert MAPK signal, axon veiledning, brennvidde heft, og celle-celle kommunikasjon (tabell L i S1-fil) , muligens gjenspeiler NKX2-1 er dobbeltroller i celledeling og epitelial differensiering.
Integrative -omic analyse identifiserer EGFR som nedstrøms effektor av forsterket
NKX2-1
for å identifisere direkte transkripsjons mål for NKX2-1, integrerte vi ovenfor RNAseq og ChIPseq datasett. Blant de fire ulike cellelinjer, 2-13% av gener som uttrykk endret ≥25% ved NKX2-1 knockdown hadde også i nærheten (innen 100Kb) NKX2-1 bindende topper (Tabell M og N i S1 Fil, og figur E i S2 Fil). Motsatt, 6-17% av gener assosiert med NKX2-1 bindingssteder viste betydelige uttrykk endringer (≥25%) etter NKX2-1 knockdown. For å fremme spikke ned på listen over interessante kandidater, og for å sikre relevans til primære NSCLC prøvene, vi krysssammenlignet vår liste over gener til transkriptomet data for 488 primære lunge adenokarsinomer fra Kreft Genome Atlas (TCGA) [25]. Spesielt har vi identifisert undergruppe av NKX2-1 oppregulert presumptive direkte mål som uttrykk var betydelig høyere (ved to-klasse SAM-analyse) i TCGA lunge adenokarsinomer med
NKX2-1
forsterkning /overekspresjon (n = 20) , sammenlignet med adenokarsinomer uten forsterkning (men fremdeles uttrykker NKX2-1 i en ikke-forsterket sammenheng) (n = 60) (tabell 1). Bemerkelsesverdige blant de gjenværende kandidatene var EGFR, som i sammendraget ble nedregulert med NKX2-1 knockdown i tre av fire cellelinjer, var assosiert med en som heter ChIP topp i de samme tre cellelinjer, og ble betydelig overuttrykt (FDR = 0,054) i primær NSCLCs med
NKX2-1
forsterkning /overekspresjon. Desidert våre oppfølgingsforsøk rettet mot EGFR.
EGFR
er moderat forsterket i H1819 celler, og er villtype (dvs. ingen aktiverende mutasjoner) i alle fire linjer [33 -36]. EGFR protein uttrykk varierer, men var høyest i H1819 (figur F, Panel A i S2 File). I samsvar med RNAseq resultater, i alle tre cellelinjer (H1819, HCC1195 og H661) hvor NKX2-1 knockdown ført til redusert EGFR avskrift, NKX2-1 knockdown også ført til en 40-90% reduksjon av EGFR protein, vurdert av western blot (fig 4A). I samsvar med EGFR muligens fungere som en nedstrøms effektor av NKX2-1, slå ned av EGFR (med 200nm siRNA [37]) førte til en tilsvarende reduksjon i celleproliferasjon, målt ved WST-1-analysen (figur 4B). Uventet, knockdown av EGFR ført til økt proteinnivå NKX2-1 (fig 4C), noe som tyder på negative tilbakemeldinger regulering. To uavhengige sirnas rettet mot EGFR (figur B, paneler F og G i S2 File) hver også økt NKX2-1 protein nivåer (ved western blot, figur B, Panel H i S2 File), som støtter en on-target RNA interferens fenotype. Interessant, gjorde EGFR knockdown ikke endre NKX2-1 transkripsjonsnivåer (figur B, Panel I i S2 File), noe som tyder på at de økte NKX2-1 protein nivåer observert var trolig konsekvensen av post-transcriptional regulering.
( A) NKX2-1 knockdown fører til reduserte EGFR protein nivåer kvantifisert ved western blot (% rest angitt). Nivåer normalisert til a-tubulin lastekontroll. (B) EGFR knockdown etter siRNA reduserer celleproliferasjon sammenlignes med NKX2-1 knockdown (se figur 1A). **
P
-verdi 0,01 (to tailed t-test). (C) EGFR knockdown fører til forhøyede NKX2-1 proteinnivå (% økning indikert, nivåer normalisert til a-tubulin lastekontroll), noe som tyder på negative tilbakemeldinger regulering
I samsvar med en negativ feedback loop, banker. ned av NKX2-1 sammen med EGFR redusert H1819 celleformering betydelig mer enn knockdown av enten alene (figur 5A). (Den kombinerte knockdown kunne ikke testes i HCC1195 og H661-celler, fordi jo høyere siRNA konsentrasjonen som er nødvendig for å knockdown EGFR var toksisk for disse cellene.) Videre er kombinert NKX2-1 og EGFR knockdown redusert MAP-kinase (MAPK p-nivåer) og PI3-kinase signal (p-AKT nivåer)-kjent vekst /overlevelse signalveier nedstrøms av EGFR [38] -mer enn knockdown av enten alene (fig 5B).
(A) Kombinert knockdown av NKX2-1 og EGFR reduserer H1819 celledeling mer enn enten alene. **
P
-verdi 0,01; ***,
P
-verdi 0.001 (to tailed t-test). (B) Kombinert knockdown av NKX2-1 og EGFR i H1819 celler avtar MAPK signal (p-MAPK) og PI3K signalering (p-AKT) mer enn enten alene. Prosent rest angitt; nivåer normalisert til a-tubulin lastekontroll. Note, i særdeleshet vestlige vist, EGFR knockdown ser ikke ut til å øke NKX2-1 nivåer betydelig, men økningen er blitt reproduserbart observert i flere andre forsøk (for eksempel figur 4C, og figur B, Panel H i S2-fil). (C) NKX2-1 knockdown samarbeider med EGFR-hemmer erlotinib å hemme H1819 cellevekst ***,
P
-verdi ≤ 0.001 (to tailed t-test).
de ovenstående resultater antydet at NKX2-1 knockdown kan samarbeide med lite molekyl inhibering av EGFR kinase. For å teste dette, utfordret vi H1819 celler med NKX2-1 knockdown (eller ikke-måls kontroll) til en ~ 50% vekst hemmende konsentrasjon (1,0 mikrometer, figur F, Panel B i S2 File) av EGFR-hemmer erlotinib. Spesielt NKX2-1 knockdown økt betydelig vekst hemmende effekt av erlotinib (Fig 5C) i
NKX2-1
forsterket NSCLC celler.
Diskusjoner
NKX2-1 er en transkripsjonsfaktor, slik at dets onkogene effekter når de forsterkes antas å være mediert gjennom transkripsjonsregulering av nøkkel nedstrøms mål. For å identifisere disse målene, her utførte vi en kombinert transkriptomet (NKX2-1 knockdown etterfulgt av RNAseq) og cistrome (NKX2-1 bundne gener ved ChIPseq) analyse i fire NSCLC cellelinjer som viser
NKX2-1
forsterkning og vekst -dependency. Resultatene ble videre integrert med TCGA genom og transkriptom data fra primær NSCLC tilfeller, som vi identifiserte og videre studerte EGFR som et nedstrøms mål.
En uventet funn fra knockdown /RNAseq eksperimenter var relativt liten overlapping av vesentlig opp /nedregulert gener på tvers av cellelinjer. Dette reflekterer trolig den heterogenitet blant annet pasientens svulster, hvor forskjellige celletyper av opprinnelse, differensiering mønstre, og /eller svulst (epi) genetiske endringer kan påvirke landskapet i genene regulert av NKX2-1. Til tross for dette, 3 av de 4 cellelinjer delt menings genuttrykksmønster, utstilt berikelse for utvalgte prosesser (f.eks celledeling), og nominert spesifikke gener (EGFR).
Den kombinerte analysen av NKX2-1 bindingsseter videre identifisert undergruppe av sannsynlige direkte NKX2-1 transkripsjons mål (selv om vi oppmerksom på at indirekte transkripsjons mål kan også ha viktige biologiske funksjoner).
