Abstract
Cellular chemotaxis er den mest kjente funksjon kjemokinreseptorer som er nært knyttet til tumormetastaser. Faktisk kunne positivt uttrykk for kjemokinreseptorer også identifiseres selv i noen pasienter uten metastatiske svulster, mens den kliniske relevansen av disse dataene ikke er fullt etablert. Våre studier ble designet for å avklare CCR4 uttrykk profiler og å utforske dens potensielle rolle i histologisk node-negative (pN0) magekreft (GC). Immunhistokjemi (IHC) eller immunohistofluorescence (IHF) analyse ble utført på prøver hentet fra 108 pasienter med pN0 GC. Vi fant ut at CCR4 var abnormt over-uttrykt inpN0 GC vev, med ulike uttrykk mønstre på kreftceller og blir assosiert med T-stage (
P
= 0,002). Matrigel
in vitro
invasjon assay viste at over-ekspresjon av CCR4 i GC-cellelinjer betydelig forbedret invasiv kapasiteten til disse cellene. Resultater fra sanntids RT-PCR og gelatinzymography viste en signifikant økning i matriks-metalloproteinase (MMP) -9 produksjon indusert ved tvungen ekspresjon av CCR4 i GC-cellelinjer. Våre data tyder på at avvikende CCR4 uttrykket er involvert i tumorinvasjon av pN0 GC og, tenkes, antagonister av CCR4 kan være nyttige kandidater for å kontrollere tidlige hendelser i tumorprogresjon
Citation. Yang Y, Du L, Yang X, Qu A, Zhang X, Zhou C, et al. (2015) Aberrant CCR4 Expression er involvert i tumorinvasjon av Lymph Node-Negativ Menneskelig Gastric Cancer. PLoS ONE 10 (3): e0120059. doi: 10,1371 /journal.pone.0120059
Academic Redaktør: Chih-Hsin Tang, Kina Medical University, TAIWAN
mottatt: 29 september 2014; Godkjent: 03.02.2015; Publisert: 19 mars 2015
Copyright: © 2015 Yang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: Forfatterne bekrefte at deres data er innenfor manuskript og sin nåværende saksdokumenter fil
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Natural Science Foundation National of China (Grant Nos 81271916 og 81301506), Forskningsfondet for doktorgradsutdanningen av høyere utdanning i Kina (nr 20120131110055), Uavhengig Innovation Foundation of Shandong University (IIFSDU, 2012TS174), Shandong Technological Development Project (STDP, 2013GSF11859), Natural Science Foundation i Shandong (Grant No. ZR2013HM104) og National Key Clinical medisinsk Spesialiteter Foundation
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i likhet med de fleste av kreft, magekreft (GC) er en høyt. aggressiv kreft som har en tendens til å invadere omkringliggende vev og metastaserer til fjerne organer. Selv om pasienter med lymfeknute negativ magekreft har bedre resultater enn de med knutemetastaser [1, 2], noen av dem fortsatt led av lokale residiv eller fjernmetastaser etter kurativ reseksjon [3-5]. Identifisere effektive faktorer eller viktige molekyler assosiere med sykdomsprogresjon i iscenesatte node-negative magekreftpasienter er nødvendig, med tanke på at disse pasientene kan ha nytte av adjuvant behandling.
Chemotaxis spiller en nøkkelrolle i metastase, regi motiliteten metastatiske celler gjennom graderinger av chemoattractants. Spesielt de kjemokinreseptorer mekle organspesifikk metastasering av svulster ved å samhandle med sine matchende chemokiner på målorganene [6]. Gastric kreftceller kan uttrykke ulike kjemokinreseptorer som chemokin reseptor 4 (CXCR4) og chemokin reseptor 7 (CCR7), og co-opt disse molekylene for metastase [7-12]. Andre roller kjemokinreseptorer i kreft progresjon bortsett chemotaxis er sjelden avdekket. CCR4, en C-C-type kjemokinreseptor, er tidligere blitt fokusert på dets biologiske funksjon i immunpatogenese av hematologiske tumorer [13]. Til dags dato har relativt liten oppmerksomhet er betalt til rollen CCR4 i å fremme metastasering av noen solide tumorer, inkludert magekreft [14-17]. Vår gruppe har vist at lymfocytt-rike GCer tendens til å være mer hyppig positiv for CCR4, og funnet en ny rolle CCR4 i tumor-indusert immunsuppresjon [18], noe som indikerer forskjellige uttrykk profiler av CCR4 i GC vev og flerfunksjonelle rollene til dette molekylet i GC progresjon.
det er vel kjent at invasjonen er første skritt som fører til kreft metastasering. Bevis har vist at noen kjemokin reseptorer, så som CXCR4 [19] og CCR7 [20], fremme B-celle kronisk lymfocytisk leukemi celle invasjon ved oppregulering av MMP-9. Nylig, Yu et al. viste at CXCR4 kunne fremme celle migrasjon og invasjon gjennom induserende uttrykk for MMP-9 og MMP-13 i muntlig plateepitelkarsinom [21]. Li og kolleger fant at CCR7 var involvert i menneskets tykktarm kreft invasjon via oppregulering av MMP-9 [22]. Det er ikke klart, men om CCR4 kan også fremme kreft celle invasjon.
Gitt den brede distribusjonen av kjemokinreseptorer innenfor svulster andtheir potensielle roller i tumorinvasjon og metastase, vi hypotese at pN0 magekreftpasienter bære viss chemokine reseptorer kan være mer sannsynlig å oppleve ytterligere progresjon. For å teste vår hypotese, undersøkte vi uttrykket profiler av CCR4 i magekreftceller av pN0 pasienter og dens rolle i magekreft celle invasjon.
Materialer og metoder
Pasienter og prøver
Vevsprøver ble innhentet fra 108 pasienter (75 menn og 33 kvinner, i alderen 35-71 år, gjennomsnittsalder 62 år) med pN0 magekreft gjennomgår kurativ reseksjon av primærtumor i Qilu Hospital of Shandong University (Jinan, Kina). Vi brukte over matchet tilstøtende normale mage vev og vev fra 56 mage dysplasi pasienter (36 menn og 20 kvinner, i alderen 35-68 år, gjennomsnittsalder 48 år) som kontroller. Alle histopatologiske diagnoser og ondartede klassifikasjoner ble bestemt av senior patologer ved diagnosetidspunktet, ifølge Verdens helseorganisasjon International Histologisk klassifikasjon av svulster [23], og den postoperative patologisk iscenesettelsen ble bestemt på grunnlag av International Union Against Cancer (UICC) [24 ]. Studien ble godkjent av etikkomiteen av Qilu Hospital og skriftlig informert samtykke fra alle pasienter ble også oppnådd.
Immunohistochemistry og immunohistofluorescence
IHC eller IHF ble utført på parafinsnitt ved hjelp av antistoffer mot humant CCR4 (LS-A351, LifeSpanBioSciences, Seattle, WA, USA) og Anti-pan Cytokeratin (CK) antistoff (ab80826; Abcam, Cambridge, MA, USA), å følge instruksjonene fra hver produsent. Fluorescent antistoffer inkluderer geit anti-kanin TRITC konjugerte antistoffer (E031320, Amyjet Scientific, Inc. Wuhan, Kina), geit anti-mus FITC-konjugerte antistoffer (E0312400, Amyjet Scientific, Inc. Wuhan, Kina). Prøvene ble visualisert og observert under et fluorescens mikroskop (IX81, Olympus, Tokyo, Japan), og IHC resultatene ble analysert som tidligere rapportert [18]
Cellekultur
human mage. kreft cellelinjer SGC-7901 og BGC-823 ble kjøpt fra Culture Collection av den kinesiske Academy of Sciences (Shanghai, Kina) og vedlikeholdes i RPMI-1640 (HyClone, Logan, UT, USA) supplert med 10% FBS (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ved 37 ℃ i en fuktet atmosfære av 5% CO
2.
Transient overuttrykk av CCR4 i SGC-7901 og BGC-823 celler
Forbigående transfeksjon av plasmidet EGFP-CCR4 (CCR4) eller et EGFP ekspresjonsvektor (MOCK) i gastriske cellelinjer ble utført ved anvendelse av Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) som tidligere rapportert [18]. Og transfeksjonseffektiviteter ble bestemt ved fluorescens mikroskop, i sanntid revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) og strømningscytometri (FCM), respektivt.
Kvantifisering av mRNA ved hjelp av RT-PCR og sanntids RT -PCR
Total RNA ble isolert fra celler ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og revers transkriptase reaksjoner ble utført med kit i henhold til produsentens protokoll (Fermentas, St. Leon-Rot, Tyskland ). For RT-PCR, ble primere og PCR-forhold for amplifisering av CCR4 anvendt som tidligere beskrevet [25]. Og human glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) (forover-primer, 5′-GGTGGTCTC-CTCTGACTTCAACAG-3 «, revers primer, 5′-GTTGTTGTAGCCA-AATTCGTTGT-3») ble usedas en intern standard. For real time RT-PCR, ble primere for CCR4, MMP-9 og GAPDH og forsterkningsbetingelsene brukes som tidligere rapportert [18, 25, 26].
FCM analyse
Cellene ble høstet inkubert med en fysoerytrin (PE) konjugert anti-CCR4 monoklonalt antistoff (FAB1567P, R og det fluoriserende fusjonsproteinet ble lokalisert i cytoplasma og membranen av CCR4 plasmid transfekterte celler. Matrigel invasjon assay viste at antallet av EGFP-CCR4-transfekterte magecancerceller som passerer gjennom matrigel var betydelig høyere enn de av mock-transfekterte magecancerceller (Fig. 4D). Den CCK8 analysen indikerte at overekspresjon av CCR4 hadde ingen effekt på magekreft celleproliferasjon (S1 figur).
SGC-7901 og BGC-823 celler ble transient transfektert med tom (MOCK) eller CCR4-uttrykke vektor (EGFP -CCR4) ved hjelp av lipofectamine2000, og transfeksjonseffektiviteten ble bekreftet av et fluorescens mikroskop (A), RT-PCR (B) og FCM (C) ved 24 eller 48 timer etter transfeksjon, henholdsvis. D, ble cellene resuspendert i 200 ul serumfritt RPMI-1640 med en konsentrasjon på 1,5 x 10
5 /ml etter transfeksjon ved 24 timer, og deretter tillatt å invadere Transwell innsatser (8-um porer) belagt med Matrigel for en annen 24 timer. Cellene som invaderte gjennom innsatsene ble tellet og fotografert under et lys-mikroskopi ved 200 x forstørrelse. Dataene er presentert som representative bilder eller som gjennomsnitt ± SD (n = 3 i hver kolonne) fra mer enn tre individuelle eksperimenter. Gray fylte histogram, CCR4; tom histogram, isotype. Data er presentert som representative bilder og middelverdi ± SD og i tre separate forsøk fra hver gruppe. *,
P
0,05; **
P
0.01.
CCR4 regulerte MMP-9 produksjonen i magekreftceller
For å teste de mulige mekanismene bak CCR4-mediert tumorinvasjon, vurdert vi effekten av CCR4 på MMP-9 ekspresjon og aktivitet. Real time RT-PCR-analyse (Fig. 5A) viste at EGFP-CCR4-transfektert mage kreftceller uttrykt høyere nivåer av MMP-9 mRNA forhold til mock-transfekterte celler i 24 timer etter transfeksjon. Gelatin zymografi analyse (Fig. 5B) viste at utskillelsen og aktiviteten til MMP-9 var signifikant oppregulert i supernatantene av EGFP-CCR4-transfekterte celler sammenliknet med mock-transfekterte celler ved 48 timer etter transfeksjon, med eller uten tilsetning av eksogene CCL22.
En real time RT-PCR viste at MMP-9 mRNA uttrykk ble oppregulert i CCR4-transfektert GC celler sammenlignet med i mock-transfekterte celler i 24 timer etter transfeksjon. B, zymograms viser gelatin spaltning av pro-MMP-9 (92 kd) og aktiv MMP-9 (85 kd). Sekresjon av MMP-9 ble tydelig oppregulert i supernatantene av CCR4-transfekterte celler sammenliknet med mock-transfekterte celler ved 48 timer etter transfeksjon, med eller uten tilsetning av eksogent CCL22. Data er presentert som representative bilder eller middelverdi ± SD og i tre separate forsøk fra hver gruppe. *,
P
0,05; **
P
0.01.
Diskusjoner
interaksjoner mellom kjemokinreseptorer av kreftceller og deres matchende chemokiner representerer viktige skritt i tumormetastaser. Men resultatene av vår nåværende studyshowed at et visst antall av magekreftpasienter uten lymfatisk metastaser var også positivt for CCR4 farging. I motsetning til de fleste tidligere studier på funksjoner av kjemotaksi mediert av noen kjemokinreseptorer, denne forskning viste en ny, invasiv oppførsel av CCR4.
chemokin-reseptorer tilhører en familie av syv-transmembran G-protein-koblede reseptorer som er membranen proteiner, og de funksjonelle konsekvenser av chemokin-reseptor-aktivitet er generelt antatt å være avhengig av stimulering av ekstracellulære ligander [27]. Imidlertid histologiske prøver av denne studien viste at det var forskjellige uttrykk mønstre for CCR4. CCR4 i ikke-neoplastiske celler viste negativ farging, med bare svak membranfarging i mage dysplasi lesjoner. Membran og cytoplasma uttrykk for CCR4 oftest dukket opp i moderat til godt differensiert tumor reir, mens uttrykk i mindre differensierte celler tendens til å være begrenset primært til cytoplasma. Og mer intriguingly, som vist på typiske seksjoner, tumorceller som oppviser høye invasive kapasiteter, som muskel invasjon, vaskulær gjennomtrengning og nerve invasjon, viser ofte en økt cytoplasmisk ekspresjon av CCR4. Våre data tyder på en nær sammenheng mellom cytoplasmatiske CCR4 uttrykk mønster og aggressiv atferd av mage kreftceller. Dette funnet er i strid med vanlig antagelse at det ekstracellulære domene av en kjemokinreseptor nødvendigvis er påkrevet i tumormetastase ved interaksjon med dets ligand. Lignende fenomener har blitt observert med kjemokinreseptoren CXCR4, hvis kjernefysiske lokalisering var assosiert med utviklingen av ulike svulster [28-30]. Disse data indictate at magekreftceller kan invadere nærliggende vev via CCR4 i en ligand-uavhengig måte. Den andre hypotese var at CCR4 internalisering forårsaket av dets ligand kan representere en mekanisme som har utviklet seg i det cytoplasmatiske CCR4 uttrykksmønster. CCL22, blir CCR4 ligand produsert av humane magecancer vev [31], også kjent å causeCCR4 internalisering av membran til cytoplasma [32, 33], som tyder på cytoplasmatisk farge kan vise aktivert signale følgende CCR4-CCL22 ligering. Flere studier er nødvendig for å avsløre de nøyaktige mekanismene bak disse unormale mønstre av chemokin reseptor uttrykk involvert i tumorprogresjon. I tillegg er det langsomt forsterkende ekspresjon av CCR4 i premaligne vev, skjønt statistisk ubetydelig høyere enn i tumor tilstøtende normale vev, foreslo at CCR4 kan også delta i preneoplastiske stadier av tidlig tumorutvikling.
i vår tidligere studie fant vi at CCR4 ble overuttrykt i GC vev, men vi fant ikke signifikante forskjeller mellom pasienter med og uten lymfeknutemetastase [18]. Derfor hypotese vi at kjemokinreseptorer kan også spille en viktig rolle i kreftutvikling av pN0 pasienter. I denne studien, våre resultater viser en positiv sammenheng mellom CCR4 uttrykk og T-stadium, noe som var i samsvar med våre immunhistokjemi funn som CCR4 uttrykk tendens til å øke etter hvert som dybden av tumorinvasjon kommet. Effekten av CCR4 på magekreft celle invasjon ble delvis bekreftet av Transwell celleinvasjons analyser. Disse analyser ble utført under betingelser hvor det ikke eksogent CCR4 reseptor-ligand ble tilsatt. Det var mulig at forskjellige mekanismer kan finnes for å regulere tumorcelle-invasjon mediert av CCR4 i en ligand-uavhengig måte, i samsvar med fenomenet cytoplasmatiske mønster av CCR4 som var relatert til det meget inngripende oppførselen til tumorceller i GC vev. Vi har bekreftet at over-ekspresjon av CCR4 var nært knyttet til en høyere grad av tumor invasivitet og indikerer således at CCR4 over-ekspresjon kan gi metastatiske potensiale i GC-celler og ytterligere fremme tumorprogresjon. Vi antok også at autokrine CCR4 ligander ble også involvert i cellemotilitet
in vitro
. Konsentrasjonene av CCL22 i kultur- supernatanten GC-cellelinjer transfektert med eller uten CCR4 var ganske lav som vi undersøkt (data ikke vist). Men muligheten kan ikke utelukkes at autokrint eller parakrint produksjon av CCL22 kan bidra til tumorinvasjon via CCL22 /CCR4 aksen
in vivo
. CCL17 og CCL22, som høy affinitet CCR4 ligander, er produsert ved GC og andre kreft vev. Spesielt, CCL22, som fremstilles enten av kreftceller eller tumorassosierte makrofager, har blitt rapportert å være involvert i metastasen av flere typer kreft [15-17]. Dette antyder en mulig autokrint /parakrint sløyfe involverer CCL22 og CCR4 mellom ulike celletyper.
MMP-2 og MMP-9 er de mest berørte og godt karakteriserte MMP med sterk proteolytisk aktivitet i ekstracellulære matriks (ECM). Konsistens mellom sanntid RT-PCR tester og gelatin Zymografi eksperimenter viste tydelig at over-uttrykk for CCR4 i magekreftceller betydelig forbedret MMP-9 uttrykk og aktivitet. Disse eksperimentene ytterligere understreket og indikerte sin faktiske rolle i tumorinvasjon under visse betingelser, med eller uten stimulering av eksogene CCL22. Det antas at matrise MMP-9 degraderer type-IV-kollagen som er en viktig bestanddel av basalmembran og er relatert til cancercelleinvasjon og metastase hos pasienter med magekreft [34]. Her har vi gitt nye ledetråder om den underliggende mekanismen som CCR4 kan fremme magekreft celle invasjon av oppregulering av MMP-9. Lignende observasjoner er også gjort med hensyn til tumorinvasjon via noen kjemokin reseptorer så som CXCR4 og CCR7 [19, 20, 22]. Og MMP-2, hvis struktur var lik MMP-9, ble også rapportert å være assosiert med magekreft, [35]. Imidlertid fant vi MMP-9, men ikke MMP-2, var en viktig molekyl som er involvert i CCR4-mediert tumorinvasjon, noe som kan skyldes forskjellige co-regulatorer som interagerer med CCR4 i forskjellige mikromiljøer. Selv om MMP-2-ekspresjon i CCR4-transfekterte magecancerceller også ut til å være høyere enn det i mock-transfekterte celler, var forskjellen statistisk signifikant (data ikke vist). Celleviabilitet analyse viste at overekspresjon av CCR4 hadde ingen effekt på magekreft cellevekst
in vitro
, som var i overensstemmelse med tidligere studier som viste CCR4 ligandene kunne ikke indusere celleproliferasjon [14], og dermed unngår muligens som kan påvirke invasjon indeks eller MMP-9 beløp. Disse analysene ble utført med eller uten eksogent CCL22, med betydelige forskjeller i MMP-9 uttrykk mellom CCR4 og mock transfekterte celler. Vi spekulere mulige mekanismer for økt MMP-9 uttrykk ved CCR4-overekspresjon kan være delvis på grunn av autokrint eller parakrint uttrykk for CCL22
in vivo
. Fremdeles andre MMP som kan være involvert i denne prosessen, og de nøyaktige signalveier forble å bli ytterligere utforsket i fremtiden.
I konklusjonen, vi rapporterte for første gang at CCR4 var abnormt over-uttrykt i pN0 magekreft og kan fremme tumorinvasjon. Videre våre data indikerte at CCR4-indusert produksjon av MMP-9 kan i det minste delvis ligger til grunn for den nye mekanismen for CCR4-mediert tumorinvasjon. Dermed kan antagonister av CCR4 være nyttige kandidater for å kontrollere tidlige hendelser i tumorprogresjon.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. Overekspresjon av CCR4 hadde ingen effekt på magekreft cellevekst
in vitro
.
Etter transfeksjon med CCR4 eller MOCK plasmid og stimulering med eller uten eksogent CCL22, SGC-7901 og BGC-823 celler ble reseeded i 96-brønns plate. Celler levedyktighet ble vurdert ved CCK8 analysen på angitte tidspunkter
doi:. 10,1371 /journal.pone.0120059.s001 plakater (TIF)
