Abstract
Hypoksi og serum uttømming er de vanligste funksjonene i solide svulster som oppstår ved antiangiogenesis , bestråling og kjemoterapi over et bredt spekter av maligniteter. Her viser vi at tumorceller som uttrykker CD133, en markør for kolorektal kreft initiere eller stamceller, er beriket og overleve under hypoksi og serum utarming forhold, mens CD133- celler gjennomgår apoptose. CD133 + kreftceller øker kreftstamcelle og epitel-mesenchymale overgangs egenskaper. Videre via screening et panel av tyrosin og serin /treonin kinase pathways, identifiserte vi Hsp27 er konstitutivt aktivert i CD133 + celler fremfor CD133- celle under hypoxi og serum uttømming forhold. Imidlertid var det ingen forskjell i Hsp27 aktivering mellom CD133 + og CD133- celler under normale vekstbetingelse. Hsp27-aktivering, som ble mediert av p38MAPK-MAPKAPK2-Hsp27 vei, kreves for CD133 + -celler til å hemme caspase 9 og 3 spalting. I tillegg kan inhibering av Hsp27 signale sensitizes CD133 + celler til hypoksi og serum tømming indusert apoptose. Videre er antiapoptotic reaksjonsveien også aktivert i sfæroide kultur anriket CD133 + kreft stamceller fra en rekke av faste tumorceller, inkludert lunge-, hjerne og kreft i munnhulen, noe som tyder det er en vanlig vei aktiveres i kreftstamceller fra flere tumortyper. Dermed kan aktivering av PP2A eller inaktivering av p38MAPK-MAPKAPK2-Hsp27 pathway utvikle nye strategier for kreftbehandling ved undertrykkelse av deres TIC befolkningen
Citation. Lin SP, Lee YT, Wang JY, Miller SA, Chiou SH, Hung MC et al. (2012) Survival of Cancer Stem Cells under hypoxi og Serum Nedbryting via Nedgang i PP2A aktivitet og aktivering av p38-MAPKAPK2-Hsp27. PLoS ONE 7 (11): e49605. doi: 10,1371 /journal.pone.0049605
Redaktør: Marianne Koritzinsky, University Health Network, Canada
mottatt: 29 april 2012; Godkjent: 11 oktober 2012; Publisert: 20.11.2012
Copyright: © 2012 Lin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis av National Science Council (97-3111-B-010-001, og 99-3111-B-010-005-), Taipei Veterans General Hospital (V98E1-002), MD Anderson Cancer Center /Kina Medical University og sykehus Sister Institution Fund, og National Yang Ming universitetet, Ministry of Education. Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
De heterogene fenotypiske og molekylære egenskaper av kreft hos mennesker er en funksjon av deres startfasen eller kreft stamceller (tics) innhold [1]. Den CD133 + populasjon av celler som utgjør ca 2,5% av tykktarmskrefttumor-celler [2], og tidligere studier har vist at denne populasjon av celler inneholder et antall udifferensierte tumorigene tics [2], [3]. De viste at subkutan injeksjon av CD133 + kolorektale cancerceller, men ikke CD133- celler, var i stand til lett å reprodusere den opprinnelige tumor i mus med immunsvikt. Deregulering av TIC selvfornyelse er et sannsynlig behov for utvikling av kreft [4], [5], [6], og overlevelse av tics kan være ansvarlig for den motstand mot kreft terapier og gjentakelse av tumorer [7]. De underliggende mekanismene for tics overlevelse fra antitumor terapi er i stor grad ukjent. Men en økning i ABC-transportører [8], aktiv DNA-reparasjon kapasitet [7], og resistens mot apoptose ved produksjon av cytokiner eller aktivering av spesifikke veier har vært rapportert. Dermed identifisere signalveier for overlevelse og selvfornyelse egenskaper av tics har nylig fått mye oppmerksomhet på grunn av et løfte om en ny mobil mål for behandling av kreft.
Heat shock proteiner ( HSP) spiller en viktig rolle som molekyl anstand ved å bistå den korrekte folding av stress-akkumulert misfoldede proteiner, og direkte interaksjon med forskjellige komponenter i strengt regulert programmert celledød maskineri. Blant dem er det Hsp27 basalnivået vanligvis høy i celler eller vev fra et bredt spekter av tumorer [9]. I tillegg har det blitt demonstrert at Hsp27 forbedrer resistens mot kjemoterapi med cisplatin og doxorubicin, og øker tumoriogenic potensialet i rottetykktarmskreftceller [10].
Hypoksi og serum uttømming er vanlige funksjoner i faste tumorer som oppstår når antiangiogenesis, bestråling og kjemoterapi over et bredt spekter av maligniteter [11], [12]. Hypoksi og anemi (som bidrar til tumor hypoksi) kan føre til ioniserende stråling og kjemoterapi motstand ved å frata tumorceller av oksygen er vesentlig for de cytotoksiske aktivitetene av disse midler [13], [14]. Hypoksi kan også redusere svulst følsomhet for strålebehandling og kjemoterapi ved en eller flere indirekte mekanismer som inkluderer proteomic og genomiske forandringer. Disse effektene i sin tur kan føre til økt invasivitet og metastatisk potensial, tap av apoptose, og kaotisk angiogenese, for derved ytterligere å øke behandling motstand. Men responsen av tumorceller til hypoksi og serum utarming og den underliggende mekanismen formidler dette svaret gjenstår å avklare. I denne studien demonstrerte vi at de fleste av kolon kreftcellene gjennomgår apoptose ved å utsettes for serum uttømming og hypoksi, og den CD133 + populasjonen av tykktarmskreftceller er mer motstandsdyktig mot apoptose gjennom konstitutiv aktivering av en anti-apoptotiske signalveien som involverer Hsp27. Videre viser vi at tics kan sensibilisert å gjennomgå apoptose og celledød gjennom inaktivering av Hsp27 veien.
Materialer og metoder
Cell Kultur og hypoksiske betingelser
human colorectal cancer-cellelinje HT-29 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC). CCS og HCW primære kultur celler ble begavet av Dr. Wen K. Yang (Laboratory of Cell /Gene Therapy, Kina Universitetssykehus, Taichung, Taiwan). De CCS celler ble isolert fra en primærtumor av en kvinne med Duke C
3 kolon adenokarsinom. De HCW celler ble isolert fra levermetastaser prøve av en mannlig med kolon adenokarsinom. Alle celler ble dyrket i DMEM (Gibco, Grand Island, NY,) inneholdende 10 enheter /ml penicillin, 10 ug /ml streptomycin, 2 mmol /l glutamin og 10% føtalt bovint serum (FBS; Gibco) i 37 ° C fuktet atmosfære med 5% CO
2. For hypoksiske betingelser, ble cellene dyrket i en gassblanding bestående av 94% N
2, 5% CO
2, og 1% O
2, som ble opprettholdt ved hjelp av en inkubator med to luft sensorer, en for CO
2 og den andre for O
2; O
2 -konsentrasjon oppnås og opprettholdes ved hjelp av levering av nitrogengass (N
2). Hvis O
2 prosent stiger over det ønskede nivå, N
2-gass automatisk injisert inn i systemet for å fortrenge den overskytende O
2. For sfæroide kulturen, ble cellene resuspendert i serumfritt DMEM /F12-medium supplert med N2-supplement, rekombinant human EGF (20 ng /ml; Peprotech) og FGF (10 ng /ml; Peprotech), og sådd ved en densitet på 10
4 celler /brønn i en 6-brønnen Ultra-Low Attachment Mikro (Corning, Lowell, MA).
Analyser for apoptose
Apoptose ble analysert med en mobil fargestoff som oppdager membran endringer (fosfatidylserin flip) og flekker apoptotiske celler (APOPercentage; Accurate Chemical Scientific Corporation, New York, New York). Fargede celler ble analysert ved hjelp av en Spectramax 250 mikroplateleser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Alternativt ble cellene høstet ved trypsinbehandling, farget med TUNEL assay (In Situ celledød Detection Kit, Roche), og visualisert ved hjelp av fluorescens mikroskop. For påvisning av de spaltede former av caspase 3 og 9, ble proteinlysatene forberedt og en western blot ble utført med de primære antistoffer kjøpt fra cellesignalisering Technologies (Beverly, MA).
Cell migrasjon og invasjon analysen
for migrering assay, 4 x 10
4 celler, suspendert i 200 ul DMEM supplert med 0,5% FBS, ble sådd i øvre brønn i 24-brønners transwell som inneholdt et filter med 8 um porer ( Corning, Costar, USA). I den nedre vel, 600 ul DMEM supplert med 15% FBS ble tilsatt. Celle ble inkubert ved 37 ° C i 24 timer. Celler disse holdes igjen i øvre brønn ble fjernet ved vattpinne og de som migrerte til den motsatte siden av filteret ble farvet med DAPI og tellet under et fluorescens mikroskop ved 200 x forstørrelse. Den invasiv evne av cellene ble bestemt med Matrigel (Becton Dickinson) -belagte polykarbonatfiltere med 8 um porene i 24-brønners transwell. Cell seeding tetthet, kultur medium, kultur periode, og evalueringsmetode var det samme med migrasjon analysen.
Real-time RT-PCR
Metoden for real-time RT-PCR ble utført som beskrevet [15]. I korthet total RNA (1 pg) av hver prøve ble reverstranskribert i 20 pl ved anvendelse av 0,5 ug av oligo dT og 200 enheter Superscript III RT (Invitrogen, Carlsbad, CA). Amplifikasjonen ble utført i et totalvolum på 20 pl inneholdende 0,5 uM av hver primer, 4 mM MgCl
2, 2 ul av LightCycler ™ -FastStart DNA Master SYBR grønn I (Roche Molecular Systems, Alameda, CA) og 2 pl 110 fortynnet cDNA. PCR-reaksjoner ble fremstilt i duplikat og oppvarmet til 95 ° C i 10 minutter etterfulgt av 40 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 15 sekunder, annealing ved 60 ° C i 1 min, og forlengelse ved 72 ° C i 20 sek. Standardkurver (syklusterskelverdier versus mal konsentrasjon) ble fremstilt for hvert mål-genet og for det endogene referanse (GAPDH) i hver prøve. Kvantifisering av de ukjente prøvene ble utført av LightCycler Relativ Kvantifisering Software versjon 3.3 (Roche).
flowcytometrisk analyse, sortering og MACS-separasjon
utestengelse av kreftceller løftet med EDTA ble vasket med fosfat-bufret saltvann (PBS) og inkubert i 30 minutter ved 4 ° C med FITC- eller PE-konjugerte monoklonale antistoffer mot humane CD markører i 50 ul vaskebuffer (PBS, 2% FBS). Etter inkubering ble cellene med bundne antistoffer ble vasket to ganger med vaskebuffer og fiksert i 1% paraformaldehyd (i PBS). Muse isotype antistoffer fungerte som respektive kontroller. Celler ble analysert under anvendelse av et FACScan strømningscytometer løpeCellQuest-programvare (Becton Dickinson, San Jose, CA). Celler som brukes for sortering ble fremstilt som fremgangsmåten for flowcytometri med alle de reagenser aseptisk og uten fiksering. Magnetisk celleseparasjon (MACS) av CD133 + celler ble utført i henhold til produsentens instruksjoner (https://www.miltenyibiotec.com/en/NN_21_MACS_Cell_Separation.aspx). Etter inkubasjon med immunomagnetiske CD133-mikroperler (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Tyskland) i 30 minutter ved 4 ° C ble cellene vasket i PBS pluss 0,5% BSA plus 2 mM EDTA, filtrert gjennom en 40-mikrometer celle sil, og løpe over en magnetisk celleseparasjonsenhet (Auto-Mac; Miltenyi Biotec). for positiv utvelgelse av CD133 + celler
Western blot analyse
celle~~POS=TRUNC ekstrakter ble forberedt med M-PER (Pierce, Rockford, IL ) pluss proteasehemmer cocktail (Halt ™; Pierce) og proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved hjelp av BCA assay (Pierce). Alikvoter av protein lysater ble separert på SDS-10% polyakrylamidgeler og overført til PVDF-membran filtre, som ble blokkert med 5% blotting karakter melk (Bio-Rad, Hercules, CA) i TBST (20 mM Tris-HCl [pH 7,6] , 137 mM NaCl, 1% Tween 20). Membranene ble deretter probet med de angitte primære antistoffer, omsettes med tilsvarende sekundære antistoffer, og detektert ved anvendelse av en kjemiluminescens assay (Millipore, Billerica, Massachusetts). Membranene ble utsatt for røntgenfilm for å visualisere båndene (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Antistoffer mot pPP2A (# 12615; Santa Cruz), pP38 (# 9216; Cell Signaling), pMAPKAPK2 (# 3007; Cell Signaling), pHsp27 (AF2314, R D), β-tubulin (# 05-661, Millipore), E-cadherin (# 4065; Cell Signaling), N-cadherin (# 4061; Cell Signaling), vimentin (MAB3400 Millipore), fibronektin (sc-8422, Santa Cruz), pJak2 (# 3771; Cell Signaling) og PC- src på Tyr416 (# 2101; Cell Signaling) ble brukt. PP2 og PP3 ble kjøpt fra Calbiochem.
immunfluorescens og immunhistokjemisk farging
For immunfluorescens, ble kulene behandlet med blokkeringsbuffer, inkubert med mus eller kanin antistoffer mot humant CD133 (AC133 mus IgG, Miltenyi) CK 20 (Ks20.8 mus IgG2a, GeneTex, San Antonio, Texas), CDX2 (Chemicon, Temecula, CA), og β-catenin (H-102, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California), ved passende fortynninger over natten ved 4 ° C, vasket grundig med PBS, og reagert med tilsvarende fluorescein-isotiocyanat (FITC) -konjugert sekundære antistoffer. Immunfluorescens ble observert med fluorescens mikroskop. For immunhistokjemisk farging ble parafininnstøpte tumorsnitt deparaffinized, rehydrert og antigen gjenvinnes ved å plassere delene i Declere arbeidsløsning (Cell Marque, Austin, TX) i en mikrobølgeovn i 20 min. Endogen peroksidaseaktivitet ble blokkert med 3% hydrogenperoksyd. Gjenværende enzymatisk aktivitet ble fjernet ved vaskinger i PBS, og ikke-spesifikk farging ble blokkert med Ultra V-blokk i 5 min (Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA). Deretter ble seksjonene omsatt med første antistoff over natten ved 4 ° C, vasket grundig med PBS, og reagert med tilsvarende biotinylerte sekundære antistoffer (Vector Laboratories, Burlingame, CA) i 15 min ved romtemperatur og behandlet med streptavidin-peroksidase (LSAB Kit; Dako, Carpinteria, CA), etterfulgt av diaminobenzidin farging. Kontra ble utført med Mayers hematoksylin
Screening Påvisning av Fosforylering av RTK og Familie av MAPK
Membraner fra Human Phospho-reseptortyrosinkinasehemming Array Kit (katalognummer ARY001;. R D Systems, Minneapolis, MN) og human Phospho-MAPK Array Kit (katalognummer ARY002, R Invitrogen, Carlsbad, CA). Supernatanter ble samlet 48 timer etter transfeksjon og deretter ble filtrert. Subkonfluente celler ble infisert med lentivirus i nærvær av 8 mikrogram /ml polybrene (Sigma-Aldrich). Ved 24 timer etter infeksjon, fjernet vi mediet og erstattes med friskt vekstmedium som inneholdt puromycin (4 ug /ml) og valgt for infiserte celler i 48 timer.
PP2A fosfatase-aktivitet Assay
PP2A aktiviteten ble analysert ved anvendelse av fosfatase-kit V2460 (Promega, Madison, WI). I korthet ble cellene separert ved MACS eller anriket for tics lysert i fosfatase-lagringsbuffer, etterfulgt av fjerning av endogent-fosfat ved hjelp av spinnkolonner levert av serin /treonin-fosfataser analysesystemet. 1 ug proteinprøver i tre paralleller ble inkubert med phosphopeptide i PP2A reaksjonsbuffer i 2 timer ved romtemperatur. Etter vasking, ble prøvene fargelegges av fargestoff blandingen i 15 minutter, etterfulgt av at reaksjonen er stoppet, og OD-verdiene ved 600 nm ble målt. Dataene ble normalisert med kontrollceller som 100%.
Statistical Analysis
Alle verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Sammenligninger mellom to gruppene ble analysert ved hjelp av Student t-test. En verdi på p 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Hypoksi og Serum Nedbryting øke bestanden av CD133 + celler
Eksponering av tykktarmskreftceller til både hypoksi og serum. fri medium resulterte i et stort antall av celledød, noe som tyder de fleste tumorceller levde ikke under disse betingelser. Imidlertid fant vi at andelen av CD133 + celler av HT-29 colon cancerceller øket noen fold i henhold til hypoksiske betingelser og også med serumfritt medium, i forhold til normoksisk forhold. Imidlertid, under begge hypoksi og serumfritt medium betingelser ble CD133 + populasjonen økes opp til nesten 30 ganger (figur 1A). Økningen i prosentandelen av CD133 + -celler ble observert etter 2 dager, og enda mer dramatisk på dag 4 eller 6. Denne økning i CD133 + -celler ble også sett i CCS og HCW primær kultur tykktarmskreftceller (Fig. 1B). Økningen i prosent av CD133 + celler, var imidlertid ikke på grunn av en økning i det totale antall CD133 + -celler, som det faktiske antall CD133 + celler gikk noe sammen med økningen av kulturen under hypoxi og serumfritt medium betingelser (figur 1C) eller i forhold til antall CD133 + celler under seruminneholdt medium og /eller normoxia forhold (figur 1D). Siden CD44 + og CD166 + celler er også regnet som den tics i tykk- og endetarmskreft [16], også spurte vi om disse markørene ble assosiert med CD133 og påvirkes av hypoksi og serum uttømming. Flertallet av CD133 + celler ble funnet å være negative for både CD44 og CD166, men med hypoksi og serum uttømming observerte vi en økning i CD166 + -celler, men ikke CD44 + og bestanden av CD166 + var mye mindre enn den for CD133 + (figur 1E) , noe som tyder på at mesteparten av den CD133 + populasjonen er adskilt fra CD166 + /CD44 + -celler. Som forventet ble CD133 + celle farget negativ for CD29, CD90 og CD105, markører for stamceller og CD45, men da av hematopoietiske celler (figur 1F). Ingen celler ble farget positivt for CD105 og CD45, og ingen av disse markørene ble øket i henhold til serum uttømming og hypoksi forhold (Figur 1F).
(A), HT-29, (B) CCS og HCW celler ble sådd med normal vekst medium (FBS) under normoxia (Nor). Celler ble eksponert for serum uttømming (SF), hypoksi (Hyp), hypoksi og serum uttømming, eller, som en kontroll, under de samme betingelser, og 2, 4 eller 6 dager senere ble cellene høstet for analyse av CD133 prosent strømnings cytometri. (C venstre panel) Totalt celle tall for hver tilstand og (høyre panel C) celle antall CD133- og CD133 + av HT-29 celler på angitte perioden hypoksi og serum uttømming ble målt. (D venstre panel) Totalt celle nummer og (panel D høyre) antall CD133 + og CD133- celler av CCS og HCW celler 4 dager under hver tilstand. (E og F) Flowcytometri for overflateprotein profiler av celler dyrket under kontroll, eller under hypoksi og serum uttømming i 4 dager.
CD133 + celler har egenskaper av tykktarms tics
Å ytterligere adressering om CD133 + befolkningen er bona fide kolorektal tics vi brukt følgende egenskaper forbundet med kolorektal tics i litteraturen for å karakterisere CD133 + befolkningen. Siden en grunnleggende del evne tics er å danne udifferensierte kuler (kuler) [2], vi spurte om CD133 + celler isolert fra hypoksi og serum utarming besitter evnen. Vi fant at CD133 + celler var i stand til å danne kuler lettere enn CD133- celler når de ble dyrket i serumfritt medium supplert med EGF og FGF2 (figur 2A). Som forventet, cellene i kulene var positive for CD133, men negativt for differensierte markører for kolorektal tumorer, dvs. kjernefysisk β-catenin (aktivert β-catenin), cytokeratin 20 (CK20) og hale typen homeobox transkripsjonsfaktor 2 (CDX2) (figur 2B og 2C), som indikerer at disse kulene var udifferensierte kuler. For å undersøke om CD133 + anrikede populasjon i sfærene har evnen til å danne differensierte markører for kolorektale tumorer, ble CD133 + sfærer podet inn i matrigel og utsatt for serumholdig medium. Etter dyrking i disse forholdene for 2 uker, begynte de å danne differensierte kuler som ble redusert i CD133 farging, positive for kjernefysisk β-catenin, CK20 og CDX2 (figur 2B og 2C). Viktigere, for CD133 + celler, injeksjon av mindre enn 1.000 celler var tilstrekkelig til å danne svulster når transplantert inn i immunodefekte mus, men til og med 100.000 celler, CD133- var ikke i stand til å danne tumorer (figur S1A). Å forvente, tumorer dannet av CD133 + celler, i likhet med tumorer dannet av bulk-celler, ble positivt farget for kolorektal kreft markører (fig S1B). Videre xenografttumorer dannet av CD133 + inneholdt også CD133 + og CD133- celler (Figur S1B), og CD133 + befolkningen isolert fra xenografttumorer dannet en populasjon av celler blandet med CD133 + og CD133- celler
ex vivo
, mens CD133- befolkningen fortsatt ga opphav til CD133- celler (Figur S1C). Disse dataene viste CD133 + celler dannet xenograft tumor og ga opphav til begge CD133 + og CD133- celler, foreslå disse CD133 + celler besatt egenskapene til tics. I tillegg kvantitativ RT-PCR viste at CD133 + -celler hadde en økning av ekspresjonen av flere stamcelle relaterte gener, inkludert, Oct4, Nanog, nestin, KLF4, Notch1, hakk 2 og Notch 3, c-myc, Gil1, Wnt5a og VEGF (figur 2D og Figur S2). Oct4 og Nanog er utelukkende uttrykt i embryonale stamceller [17], er nestin uttrykt i pluripotente nevrale stamceller [18], mens KLF4, c-myc, og gener av Notch, SHH, og Wnt trasé er uttrykt i tics av en rekke av kreft [19], [20], [21]. VEGF er en av de antatte målene for hypoksi induserbar faktorer-1α (HIF-1α) [22]. HIF1-α er også blitt vist å indusere epitelial-mesenkymale overgang (EMT) [23], som nylig er blitt vist å være i stand til å generere celler med stamcelleegenskaper ved brystkreft [24]. Interessant, fant vi også at CD133 + celler ble redusert i E-cadherin og økt i EMT markører som N-cadherin, vimentin og fibronektin av kvantitativ RT-PCR og Western blot analyse (figur 2E). Viktigere, økningen av EMT markører i CD133 + -celler var også assosiert med en økning i kapasiteten for cellemigrering og invasjon, karakteristika for celler med øket EMT (figur 2F). Dermed CD133 + celler har EMT egenskaper og øke embryonale stamcellemarkører og en HIF målet genet.
(A) Sphere dannelsen kapasitet på CD133 + og CD133- celler. CD133 + og CD133- celler, separert med MACS etter 4 dager dyrket under hypoksi og serum uttømming, ble dyrket under serumfrie forhold i nærvær av EGF (10 ng /ml) og FGF2 (10 ng /ml). Sfære dannelse ble beregnet ved 2 uker ( 25 eller 25 angir den cellenummer for hver sfære.). Feilfelt representerer standardavvik. (* P. 0,05 sammenlignet med CD133-celler som bestemmes av Student t-test) (B) CD133 + celler etter MACS separasjon på dag 4 av eksponering for hypoksi og serum utarming, dyrket med serum fri tilstand i nærvær av EGF (10 ng /ml) og FGF2 (10 ng /ml), for å danne kuler på 2 uker. Immunfluorescens viser at disse kulene er udifferensierte kuler (Udifferensierte), som er positivt for CD133, og negativt for kjernefysisk β-catenin, CDX2 og CK20. Kulene ble deretter sådd ut matrigel og utsatt for serumholdig tilstand i ytterligere 2 uker. Immunfluorescens viser at disse kulene er differensiert (differensiert), som reduksjon i CD133 uttrykk, øke i uttrykket av kjernefysisk β-catenin, CDX2 og CK20. Scale bar, 20 mikrometer (C) Prosenter av celler positive for CD133, kjernefysisk β-catenin, CDX2 og CK20 ble talt opp. (D) og (E to øverste plater) Kvantitativ RT-PCR for mRNA-nivåer, (E lavere panel) immunoblotanalyse. (F) celle migrasjon og invasjon analyse for CD133 + og CD133- celler etter MACS separasjon på dag 4 av eksponering for hypoksi og serum uttømming. Data over HT-29 celler er vist som representative resultater.
CD133 + celler er resistente mot Hypoksi og Serum Nedbryting apoptose
Vi deretter undersøkt om CD133 + celler kan være motstandsdyktig mot hypoksi og serum uttømming indusert apoptose. Faktisk ble CD133 + celler funnet å være resistente mot apoptose målt ved TUNEL-analysen, mens CD133- cellene var positive for TUNEL-farging (figur 3A). Denne oppfatningen ble også støttet når HT-29 celler ble høstet etter tre dager med hypoksi og serum utarming, og deretter CD133 + og CD133- cellepopulasjoner ble henholdsvis reseeded for mer 16 timer under samme forhold og analysert ved hjelp av APOPercentage analysen. Her har vi funnet at i den CD133- populasjonen var det betydelig mer enn apoptose i CD133 + celler (figur 3B). Tatt sammen indikerer disse resultater at at CD133 + celler er resistente overfor hypoksi og serum tømming indusert celledød. Å belyse mekanismen av CD133 + celler resistens mot apoptose, først spurte vi om denne motstanden skjedd gjennom en caspases avhengige apoptotiske sti. Vi har funnet at ekspresjonen av kaspase-gener som caspase 9 og 3 ble redusert i CD133 + celler sammenlignet med CD133- celler i både mRNA og proteinnivå, ved hjelp av kvantitativ RT-PCR (figur 3C) og western blot analyse (figur 3D), respektivt. Videre CD133 + celler viste også en redusert mengde av de aktive spaltede former av kaspase 9 og caspase 3 (figur 3D). Men vi fant ikke noen åpenbar forskjell mellom CD133 + og CD133- celler i protein nivåer av fosfor-IKKα, kjernefysiske NF-kB og nedstrøms mål, slik som BCL-2 og Survivin proteiner (Figur S3). Disse resultater antyder at overlevelse av CD133 + celler fra hypoksi og serum uttømming blir hovedsakelig mediert av mangel på mangel på caspase 9 og kaspase 3 aktiveringen, men uavhengig av NF-kB kB, BCL-2 og Survivin.
(A ) TUNEL-farging for apoptose ble utført etter MACS separering av CD133- og CD133 + -celler i henhold til hypoksi og serum uttømming i 4 dager. (B) CD133- og CD133 + celler under hypoksi og serum uttømming i 3 dager ble høstet ved MACS separasjon, reseeded etter hypoksi og serum utarming, og APOPercentage Analysen ble utført 16 timer senere. (C) Kvantitativ RT-PCR for mRNA-nivåer. (DF) Cellelysater av CD133 + og CD133- celler etter MACS atskillelse på dag 4 av eksponering overfor hypoksi og serum uttømming ble fremstilt og anvendt for (D, F) immunoblotanalyse for proteinnivåer, og (E) MAPK fosfo-antistoff-matrisen for å analysere nivåene av angitte signalveier. Grafene viser hver signale etter normalisert med kontroll. CD133 + -celler ble redusert ved ekspresjon og aktivering av caspase 9 og 3 og økte i ekspresjon av fosfo-Hsp27. Feilfelt representerer standardavvik. (* P 0,05 og ** p 0,01 som bestemmes av Student t-test.) Data HT-29 celler er vist som representative resultater
Hsp27 er nødvendig for overlevelsen av ticsene. hypoksi og Serum Nedbryting
Siden vi fant ut at det var mindre av den aktive formen av caspase 9 og 3 (figur 3D), vi neste undersøkt de molekylære mekanismene som er ansvarlig for manglende aktivering av caspase 9 og 3 i CD133 + celler. For å oppnå dette har vi brukt hurtig og sensitiv Phospho-RTK (fosfo-Tyr) og fosfo-MAPK Arrays (fosfo-ser /thr), og sammenlignet fosforyleringen av proteiner i flere forskjellige baner i CD133 + -celler til CD133- celler, under betingelsene for hypoksi og serum utarming. Generelt var det ingen signifikant forskjell i tyrosinfosforylering mellom CD133 + og CD133- celler (figur S4). På den annen side, var det flere ser /thr-kinase phosphorylations som ble økt i CD133 + -celler, den mest åpenbare er Hsp27 (8,6 ganger), sammenlignet med CD133- celler (figur 3E). Derfor vurderte vi ytterligere involvering av Hsp27 i CD133 + celler resistens mot apoptose. Påliteligheten av Phospho-MAPK Arrays ble bekreftet av western blot analyse og CD133 + faktisk økt i Hsp27 aktivering, mens fosforylering nivåer av ERK og Akt ikke ble endret (figur 3F). Derfor er disse dataene antyder motstanden CD133 + celler til apoptose er knyttet til aktivering av Hsp27.
Hsp27 er nødvendig for overlevelsen av ticsene Hypoksi og Serum Nedbryting
For å undersøke om Hsp27 aktivitet er faktisk viktig å beskytte CD133 + befolkningen mot apoptose, vi først brukt to Hsp27-shRNAs og viste at undertrykkelse av Hsp27 (figur 4A) faktisk sensibilisert apoptose i CD133 + befolkningen i å svare på hypoksi og serum uttømming. Videre Hsp27-spesifikke shRNA induserte en nedgang i den økte CD133 + prosent etter hypoksi og serumfritt medium betingelser, sammenlignet med det forvrengte shRNA (figur 4B). En økning i apoptose ble også observert med to Hsp27-spesifikke shRNAs i CD133 + celler av HT-29 (figur 4C). Lignende resultater ble også observert i den primære kultur CCS (figur S5a). Western blot-analyse viste også en økning i spaltning av caspase 9 og 3 ved Hsp27-spesifikk shRNAs (figur 4A). I tillegg er to strukturelt forskjellige Hsp27 inhibitorer, quercetin og KRIBB3 (spesifikt for Hsp27-fosforylering) [25], også øket spaltning av caspaser 9 og 3 i HT-29-celler (figur 4D) og CCS-celler (figur S5b) og induserte en reduksjon av den økte prosentandelen av CD133 + celler under hypoxi og serum uttømming (figur 4E), og resulterte i apoptose i CD133 + celler (figur 4F), Som forventet, PI3K-Akt inhibitor, LY294002 og ERK-inhibitor, U0126 ikke induserer disse effektene ( Figur S5C og S5D). Det bør nevnes at quercetin er kjent for å hemme Hsp27, Hsp70 og HSP90. Dermed har vi også undersøkt aktivering av HSP90 og Hsp70 i CD133 + og CD133- populasjoner (Figur 3F). Resultatene viser at det ikke er noen forskjell i pHsp70 og pHsp90 mellom de to populasjoner av celler. Således, blant de tre Hsp proteinene, synes Hsp27 å være den eneste som aktiveres i CD133 + celler, således at quercetin effekten er sannsynligvis forårsaket av hemning av Hsp27. Samlet utgjør disse resultatene tyder på at Hsp27 er nødvendig for overlevelsen av ticsene hypoksi og serum utarming.
Celler ble lentivirally transfektert med Hsp27 shRNA (shR1 og shR2) eller egge shRNA, deretter utsatt for hypoksi og serum utarming . CD133 + og CD133- celler ble isolert ved anvendelse av MACS separasjons 4 dager senere. (A) Immunoblot-analyse for HT-29 proteinnivåer av CD133 + og CD133- celler etter MACS separasjon. Feilfelt representerer standardavvik. Feilfelt representerer standardavvik.
