Abstract
Prostatakreft viser enorm variasjon i klinisk atferd, alt fra lat til dødelig sykdom. Bedre prognostiske markører for å stratifisere pasienter for riktig aggressiv behandling. Ved uttrykk profilering, kan vi identifisere en spredning signatur løst uttrykt i prostatakreft. Her har vi bedt om en eller flere vev biomarkører kan fange opp denne informasjonen, og gi prognostisk verktøy. Vi testet tre sprednings signatur gener:
MKI67 plakater (Ki-67, også en klassisk spredning biomarkør),
TOP2A plakater (DNA topoisomerase II, alfa), og
E2F1 product: ( E2F transkripsjonsfaktor 1). Immunhistokjemisk farging var evaluerbare på 139 radikal prostatektomi tilfeller (i vevet microarray-format), med en median klinisk oppfølging av åtte år. Hver av de tre sprednings markører var alene prognostisk. Spesielt kombinere de tre merkene sammen som en «spredning indeks» (. 0 eller 1,
vs
2 eller 3 positive markører) gitt overlegen prognostisk ytelse (hasardratio = 2,6 (95% KI: 01.04 til 04.09) ;
P
= 0,001). I en multivariat analyse som inkluderte preoperativ serum prostata spesifikt antigen (PSA) nivåer, Gleason grade og patologisk tumorstadium, forble den sammensatte spredning indeksen en signifikant prediktor (
P
= 0,005). Analyse av mottaker-drift karakteristiske (ROC-kurvene) bekreftet den forbedrede forutsigelse som gis ved å inkorporere spredning indeksen (i forhold til de clinicopathologic data alene). Våre funn markere den potensielle verdien av en multi-gen signatur-basert diagnose, og definere en tri-markør spredning indeksen mulig verktøy for bedre forutsigelse og behandling lagdeling i prostatakreft
Citation. Malhotra S, Lapointe J , Salari K, Higgins JP, Ferrari M, Montgomery K, et al. (2011) En Tri-Marker spredning Index Spår Biokjemisk tilbakefall etter kirurgi for prostatakreft. PLoS ONE 6 (5): e20293. doi: 10,1371 /journal.pone.0020293
Redaktør: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, USA
mottatt: 20 januar 2011; Godkjent: 28 april 2011; Publisert: 23. mai 2011
Copyright: © 2011 Malhotra et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health: CA111782 (JDB), CA122246 (JRP), CTSA gi UL1 RR025744 (Stanford Spectrum); og fra Burroughs Wellcome Fund: # 1007519 (JRP, JDB). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er en ledende årsak til kreft dødsfall i USA [1]. Til tross for at utstillinger prostatakreft betydelig variasjon i klinisk atferd. Mange (om ikke de fleste) prostatakreft er klinisk lat, mens andre er klinisk aggressiv, blir metastatisk og dødelig. For lokalisert prostatakreft, behandlingstilbud varierer fra aktiv overvåking ( «vaktsom venter») til avgjørende kirurgisk inngrep (radikal prostatektomi) eller strålebehandling [2], [3]. Docetaxel kjemoterapi vurderes også i adjuvant og neoadjuvant innstillingen [4]. I økende grad er det behov for prognostiske biomarkører å nøyaktig stratifisere pasienter for hensiktsmessig risikotilpasset terapi
Nåværende prognostiske faktorer inkluderer Gleason grad, tumorstadium, og preoperativ serum PSA [5] -. [8] og nomogrammer som kombinerer slike data [9], [10]. Det gjenstår imidlertid mye usikkerhet, og som sådan mange menn velger unødvendig aggressiv behandling. Andre tiltak, f.eks tumorhistologi, ploidiresultat DNA, spredning markører, og utvalgte kreftgener, er også under vurdering [11] – [15]. Av disse markører for tumorcelle-proliferasjon, f.eks S-fase brøkdel eller Ki-67 farging, er allerede i klinisk bruk for andre krefttyper, inkludert for eksempel brystkreft [16], gastroentero-bukspyttkjertelen nevroendokrine svulster [17], og mantelcellelymfom [18].
i tidligere studier har vi brukt DNA-mikromatriser å profilere genekspresjon i prostata kreft [19]. Unsupervised clustering av uttrykk profiler avslørte tydelige kreft klynger (definerende molekylære undergrupper), samt ulike klynger (eller «egenskaper») av co-uttrykte gener, identifisere de underliggende biologiske mekanismer og prosesser. Blant disse, en fremtredende gen-uttrykk funksjonen tilsynelatende reflektert svulst celle spredning nivåer, og dens uttrykk variert betydelig over prostatakreft. Her setter vi ut for å karakterisere spredning-signatur gener som vev biomarkører, og å vurdere deres prognostiske verktøyet.
Metoder
Molecular signaturer
For å evaluere en celleproliferasjon signatur i prostatakreft, vi analysert tidligere utgitt [19] cDNA microarray gen-uttrykk profiler fra 71 prostatakreft og 41 normal prostata (uninvolved vev fra motsatt lapp) prøver. Microarray data er MIAME kompatibel, og rådata er tilgjengelige på GEO (tiltredelse GSE3933). Hierarkisk clustering [20] ble påført på 7957 gener (cDNA) som var både godt målt (signal /bakgrunns 1,5 i minst 50% av prøvestykkene) og variabelt uttrykt (≥2 ganger ekspresjon endring fra medianen på minst 2 eksemplarer). Gensamling som inkluderte mange gener med kjente roller i celleproliferasjon (en antatt «spredning signatur» cluster) ble evaluert videre. Overlapping mellom den antatte spredning signatur cluster (som inneholder 94 unike gener) og 639 kanoniske sti (BioCarta og KEGG) gensettene evaluert ved bruk av molekylær Signaturer Database (MSigDB) [21] «beregne overlapping» -funksjonen, basert på den hypergeometriske fordelingen. Ki-67, ble TOP2A og E2F1 velges blant spredning signatur gener basert på tilgjengeligheten av antistoffer som er egnet for immunhistokjemi på formalinfiksert, parafininnebygd vev.
Tissue microarray kohort
En vevet microarray inkludert 139 fullt evaluerbare formalinfikserte, parafininnstøpte primære prostatakreft valgt fra diagnostiske radikal prostatektomi tilfeller utført ved Stanford University Hospital mellom 1986 og 1996, med Institutional Review Board godkjenning og skriftlig pasientsamtykke (protokoll ID 11612) [19]. Hvert tilfelle ble representert av dupliserte 0,6 mm kreft kjerner. Clinicopathological karakteristikker av tilfellene er oppsummert i tabell 1. Pasientene ble behandlet ved radikal prostatektomi alene, og klinisk oppfølging hver 6. måned inkludert PSA testing og fysisk undersøkelse; median klinisk oppfølging var 8 år.
Immunohistochemistry
Serie deler av 4 mikrometer ble kuttet fra vevet microarray blokk, de-paraffinized i Citrisolv (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), og hydrert i en gradert serie av alkoholløsninger. Termisk induserte antigen gjenfinning ble utført ved mikrobølge forbehandling i citrat (1 mM, pH 6,0) i 15 minutter før farging. Endogen peroksidase ble blokkert ved preinkubering med 1% hydrogenperoksyd i fosfat-bufret saltløsning. Ki-67 monoklonalt antistoff (MIB-1; Dako, Nord-Amerika, Carpinteria, CA) ble brukt på 1:100 fortynning, TOP2A monoklonalt antistoff (SWT3D1, forskning Diagnostics, Flandern, NJ) på 1:10 fortynning, og E2F1 mus monoklonalt antistoff (18E10, GeneTex, Irvine, CA) ved 1:200 fortynning, hver i 30 min. Kromogen påvisning ble utført ved hjelp av en peroksydase-konjugert sekundært antistoff og DAB-reagenser som følger med Envision deteksjonssett (Dako). Immunostains ble scoret av en patolog (J.P.H) blindet for kliniske data, og kriteriene for positivitet satt for å gi et dynamisk område. For Ki-67 og TOP2A, ble sterk farging i ≥5% tumor kjerner scoret som positive. For E2F1, som farget en høyere andel av kjerner sterk farging i ≥50% tumorkjernene ble scoret som positive. Hvis en duplikat kjerne scoret positiv, ble saken vurderes som positive.
Statistisk analyse
Korrelasjon mellom spredning biomarkører ble vurdert av Pearson korrelasjon. Assosiasjoner mellom spredning biomarkører og clinicopathologic variabler ble evaluert av Fishers eksakte test. Kaplan-Meier plott og log-rank test ble brukt for å teste likestilling mellom overlevende funksjoner på tvers av prostatakreft grupper. Multivariat Cox regresjonsanalyse, med bånd håndteres av Efron appoximation, ble brukt til å identifisere en signifikant prediktor for PSA tilbakefall. Mottaker-drift karakteristiske (ROC) kurver ble evaluert for en signifikant prediktor for PSA tilbakefall. Alle analysene ble utført ved hjelp av R statistisk programpakke og WinStat programvare (R. Fitch Software, Chicago, IL).
Resultater
I våre tidligere studier, uttrykk profilering av prostatakreft avslørte tydelig molekylær undergrupper, samt gen-ekspresjon egenskaper reflekterende underliggende biologiske prosesser [19]. I en ny analyse av disse dataene, en fremtredende gen-uttrykk funksjon (Fig. 1A) inkludert gener som regulerer cellesyklus (f.eks
CCNE1
,
CDK1
,
CDC25A
), og er involvert i DNA-replikasjon (f.eks
POLE2
,
MCM4
,
TK1
) og kromosom dynamikk (f.eks
SMC4
,
CENPE
), tilsynelatende gjenspeiler kreftcelle spredning nivåer. Denne funksjonen ble variabelt uttrykt over, prostatacancere, og spesielt fremtredende blant lymfeknutemetastaser, og en delmengde av primærsvulster innen molekyl subtyper 2 og 3, undergrupper tidligere er funnet å være mer aggressiv klinisk-[19]. Vurderer overlappinger mellom denne klyngen av gener og kanoniske sti gensettene innenfor molekylær signatur Database [21] bekreftet en forbindelse til celledeling; de fem signifikant (
P
0,01). overlappende genet setter alle relatert til celle-syklus /spredning trasé (Fig. 1B)
(A) Unsupervised cluster analyse av prostatakreft ( datasett fra ref. [19]) avslører molekylære undergrupper av prostatakreft (1, 2 og 3, merket), og gen-uttrykk funksjoner som gjenspeiler de underliggende biologiske prosesser.
Venstre
, miniatyr heatmap av klyngeanalyse.
Høyre
, forstørret visning av «spredning cluster», med utvalgte gener vist (
MKI67
,
TOP2A Hotell og
E2F1
i rød tekst, merket ved pilen). Røde og grønne uttrykk nivåer reflektere høye og lave verdier, henholdsvis (se viktig). Røde fylte sirkler (
under
) identifisere lymfeknutemetastaser. (B) Overlapping matrise av spredning klase gener (N = 94) med kanoniske pathway (CP) gensettene identifiserer topp gen sett kampene (alle betydelig,
P
0,001) alle knyttet til celle-syklus /spredning . Solid blå fill indikerer overlappende medlemskap mellom spredning klynge og spørres gensettene.
Høye spredning priser i kreft er vanligvis forbundet med dårligere klinisk resultat. Vi søkte derfor å evaluere den prognostiske verdien av spredning signatur gener, individuelt og i kombinasjon, i prostatakreft. Basert på tilgjengeligheten av antistoffer som er egnet for immunhistokjemi på formalinfiksert, parafininnebygd vev, valgte vi å fokusere på tre sprednings signatur gener,
MKI67 plakater (som koder for den klassiske celleproliferasjon markør, Ki-67) [22 ],
TOP2A plakater (DNA topoisomerase II, alfa), og
E2F1 plakater (E2F transkripsjonsfaktor 1) (fig. 1a).
Immunohistokjemi ble gjort på en vev microarray som inneholdt prostata krefttilfeller fra radikal prostatektomi (tabell 1), assosiert med en median klinisk oppfølging av åtte år. Alle tre sprednings markører viste den forventede nukleær farging (fig. 2A). Interessant, mens Ki-67 og TOP2A typisk farget bare en liten fraksjon av tumorcellekjerner, E2F1 ofte farget de fleste tumorceller (Fig. 2A). Ki-67 og TOP2A farging tvers tilfeller var signifikant korrelert (R = 0,38,
P
0,001) (figur 2B.). Ki-67 og E2F1 var mindre korrelert (bare mangler statistisk signifikans) (R = 0,13,
P
= 0,06), og noe overraskende, TOP2A og E2F1 ikke vises korrelert (R = 0,00,
P
= 0,50) (figur 2B)
(A) Farging av spredning markører Ki-67, TOP2A og E2F1..; representative positive og negative saker vist. (B) parvise sammenligningen av immunfarging score over tilfeller. Pearson korrelasjon (R) verdier vist. (C) Kaplan-Meier analyse av Ki-67 ( 5%
vs
≥5% tumor kjerner.), TOP2A (mindre enn 5%
vs
≥5% tumor kjerner. ) og E2F1 ( 50%
vs
≥50% tumor kjerner) farging..
P
-verdier (log-rank test) vist. (D) Kaplan-Meier analyse av kombinert markør flekker (se nøkler).
P
-verdier (log-rank test) vist.
For å evaluere og sammenligne prognostisk verdi, utførte vi Kaplan-Meier analyser på settet av 139 saker som ble evaluert for alle tre sprednings markører. Ki-67 positivitet (≥5% kjerner farging) viste en sterk trend mot tidligere biokjemisk-tilbakefall etter prostatektomi (
P
= 0,107) (fig. 2C) (analyse av komplett sett av 156 tilfeller evalueres for Ki -67 nådde statistisk signifikans, data ikke vist). TOP2A positivitet (≥5% kjerner flekker) og E2F1 positivitet (≥50% kjerner farging) var signifikant assosiert med tidligere tilbakefall (
P
= 0,028 og
P
= 0,043, henholdsvis) (Fig . 2C). Ingen av de tre sprednings biomarkører var signifikant assosiert med andre clinicopathologic funksjoner, inkludert preoperativ PSA, Gleason grade og patologisk stadium (tabell 2).
Vi har også bestemt om å kombinere markører kan forbedre prognostisk verdi. En sammenligning av tilfellene har ingen, ett, viste to eller tre positive markører spredning signifikante forskjeller (
P
= 0,009), generelt med inkrementelle antall positive markører assosiert med tidligere tilbakefall (Fig. 2D). Stratifying tilfeller med ingen eller en positiv markør,
vs
. Tilfeller med to eller tre positive markører, heretter kalt tri-markør «spredning indeks», forutsatt at den største prognostisk betydning (
P
= 0,001), med en hazard ratio på 2,6 (95% konfidensintervall 01.04 til 04.09). Dette resultatet var også tydelig ved analyse av ROC kurver (Tabell 3, merk det større arealet under kurven for tri-markør spredning index)
Spesielt, i en multivariat analyse som inkluderte kjente prognostiske markører. – preoperativ serum PSA, Gleason grade og patologisk stadium, – den sammensatte spredning indeks forble en signifikant prediktor (
P
= 0,005) (tabell 4). Den forbedrede prognostication gis ved å innlemme spredning indeks (i forhold til de clinicopathologic data alene) ble bekreftet ved sammenligning av Kaplan-Meier plott (fig 3A,. Oppmerksom på de mer betydelige log-rank test P-verdi) og ROC kurver (tabell 3 og figur 3B,. merk større område under kurven)
(A) Kaplan-Meier analyse som sammenligner multivariate modeller basert på clinicopathologic data (
venstre
) og clinicopathologic data pluss tri. markør spredning indeks (
midt
). Tilfeller er gruppert etter tertile. Log-rank test
P
-verdier er indikert. (B) ROC kurven analyse som sammenligner multivariate modeller basert på clinicopathologic data (
venstre
) og clinicopathologic data pluss tri-markør spredning indeks (
midt
). Analyse gjort på 8 år oppfølging (median oppfølgingstid for kohorten). Områder under kurven (AUC) er angitt.
Diskusjoner
I denne studien har vi vurdert for prostatakreft den prognostiske nytten av vev biomarkører av celleproliferasjon, identifisert fra expression profilering mønstre. To biomarkører, TOP2A og E2F1, scoret av immunhistokjemi, ble hver prognostisk (og den klassiske markør Ki-67 nesten så). Spesielt, som kombinerer markører bedre prognostisk verdi ytterligere. En sammensatt spredning indeks (0,1
vs.
2,3 positive markører) gitt størst prognostisk betydning, og beholdt verdi når den kombineres med tiden brukes prognostiske faktorer.
Markørene vi evaluert var valgt blant prostatakreft spredning klase gener. Den «spredning signatur» (anmeldt i ref. [23]) er en vanlig forekommende mønster i microarray studier. Først rapportert i brystkreftcellelinjer og svulster [24], er spredning signatur fremtredende på tvers av ulike krefttyper (i forhold til normalt vev) [25]. Dens medlemsoverlapper betydelig med celle-syklus regulerte gener [26], og dens tilstedeværelse korrelerer med celledoblingstider i kultur [27], og Ki-67 farging i tumorer [24], [25]. Signaturen spredning har også blitt funnet prognostisk i brystkreft [28], [29] og i mantelcellelymfom [30].
Gene signaturer sannsynligvis fange opp mer informasjon enn å analysere enkeltgener, og faktisk multi-genet signatur assays har nådd klinisk anvendelse [31] – [33]. Spesielt to slike brystkreft prognostiske /prediktive signaturer inkluderer gener rapportering på celleproliferasjon [31], [32]. Imidlertid er microarray testing ikke lett implementert i klinisk lab. Vi har derfor bedt om et lite antall gener kan effektivt fange opp relevant informasjon i spredning signatur, ved rett-frem immunhistokjemi.
Vi har evaluert tre spredning gener. Ki-67 (spredning assosiert Ki-67 antigen), kodet av
MKI67
genet og ofte identifisert ved MIB-1 antistoff, er en kjernefysisk antigen uttrykt i prolifererende men ikke hvilende celler [34], men sin spesielle funksjon er fortsatt usikkert. Tidligere studier har vist Ki-67 å være en uavhengig prediktor for utfall i prostatakreftpasienter behandlet med radikal prostatektomi [35] – [39] eller radioterapi [40]. I samsvar med disse studiene, også fant vi Ki-67 å være prognostisk, men det savnet betydning for den delen av saker evalueres for alle tre spredning markører.
TOP2A er en type II DNA topoisomerase, kontrollere den topologiske staten DNA (ved kataforbigående doble strandet pauser) under DNA transkripsjon, rekombinasjon, replikering, og kromosom partisjonering ved celledeling [41]. TOP2A er også et mål for flere antineoplastiske medikamenter, f.eks doxorubicin og etoposid. TOP2A ekspresjon ved immunhistokjemi har vist seg å være prognostisk i bryst [42] og [43] ovarian cancer. Mer nylig, TOP2A transkripsjon [44] og protein [45] nivåer er blitt assosiert med systemisk progresjon av prostatacancer. Våre egne data bekrefte denne foreningen.
E2F1 er en nøkkel transcriptional regulator av DNA replikasjon og cellesyklusprogresjon, og er negativt regulert av RB1 tumor suppressor [46]. Rb /E2F veien blir forstyrret i de fleste kreftformer [47]. Spesielt, har en betydelig berikelse av E2F1 bindingsseter blitt funnet blant promotorområdene for spredning signatur gener [48], og kjente mål inkluderer for eksempel
CCNE1
,
CDC25A
,
MCM4
,
TK1
, og
CENPE product: [49]. Derfor er E2F1 ikke bare en spredning signatur gen, men i seg selv en transkripsjonsregulator av andre spredning signatur gener.
E2F1 farging er blitt funnet å være prognostisk i bryst [50] og lunge [51] kreftformer, og vi nå utvide dette til prostatakreft. Spesielt, mens E2F1, Ki-67 og TOP2A transkripsjonsnivåer er alle cellesyklus-regulert [26], vi vanligvis observert E2F1 immunofarging i en større andel av tumorceller, i motsetning til Ki-67 og TOP2A, som farget kun et mindretall fraksjon av celler. Som sådan, kan oppnå E2F1 positivitet være mer oversiktlig og reproduserbar, og videre evaluering av E2F1 som en spredning og prognostisk markør i prostata og andre krefttyper er berettiget.
Viktigere, fant vi at scoret tre sprednings markører gir overlegen prognostisk informasjon enn å utføre en enkelt en. Hvorfor skal dette være slik? På transkripsjon nivå, E2F1, TOP2A og Ki-67 topp ved ulike stadier av cellesyklusen, G
1 /S, G
2 og G
2 /M, henholdsvis [26]. Det er derfor mulig at de tre merkene sammen gir en mer komplett bilde av prolifererende celler. Alternativt, ved hjelp av tre markører kan «glatte ut» unøyaktighet i patolog scoring. Enten inkludert mer enn tre sprednings markører kan ytterligere forbedre ytelsen er ukjent, men vi konstaterer at tre markører er innenfor rekkevidden av hva som er praktisk for histologiske laboratorier (der antistoff panelene blir rutinemessig bestilt), og enklere, raskere og billigere enn en microarray.
i sammendraget, har vi vist at en tri-markør spredning indeksen gir bedre prognostisk ytelse i prostatakreft, legge verdien ovenfor i dag brukes prognostiske faktorer. Mens validering i flere kohorter, og på hele vevssnitt, er garantert, våre funn tyder på at spredning indeksen kan bistå i risikovurderingen, for å velge riktig aggressive behandlinger (f.eks bruk av adjuvant behandling) og til slutt forbedre pasientens utfall. Cleary, kliniske forsøk ville være nødvendig for å vurdere den fordel med hensyn til prostata cancer-assosiert sykelighet og dødelighet. Til slutt er det verdt å merke seg at mange antineoplastiske medikamenter målrette celleproliferasjon [23], inkludert taxaner som viser løftet i adjuvant /neoadjuvant innstillingen [4]. Derfor er det mulig (og verdt å undersøke videre) at spredning indeksen kan også vise nytten i å forutsi respons på spesifikke kjemoterapi.
Takk
Vi ønsker å takke medlemmene av Pollack lab for nyttig diskusjon.
