Abstract
Bakgrunn
Til tross for sin første positive respons på hormonbehandlede terapi, prostata kreft alltid går igjen i flere aggressive, behandlingsresistent former. Mangelen på vår forståelse av underliggende genetiske endringer for overgangen fra androgen-avhengige (AD) til ADI prostatakreft vekst hemmer vår evne til å utvikle mål drevne terapeutiske strategier for effektiv behandling av ADI prostatakreft.
Methodology /hovedfunnene
Ved screening et bibliotek av aktiverte humane kinaser, har vi identifisert
TPL2
, som koder for en serin /treonin kinase, som kjører ADI prostatakreft vekst. TPL2 aktivering av over-uttrykker enten villtype eller et konstitutivt aktivert form av TPL2 indusert ADI vekst, mens undertrykkelse av
TPL2
uttrykk og sin kinase aktivitet i ADI prostata kreft celler hemmet celledeling etter androgen-utarmet forhold . Viktigst,
TPL2
er oppregulert i ADI prostata kreft både
PTEN
sletting musemodell og de kliniske prostatakreft prøver.
Konklusjon /Betydning
Sammen disse dataene tyder på at
TPL2
kinase spiller en avgjørende rolle i markedsføringen av ADI prostatakreft progresjon. Videre undertrykkelse av TPL2 minker ADI prostatakreft vekst og en høy frekvens av TPL2 overekspresjon i menneskelige ADI prostatakreft prøvene validerer TPL2 som et mål for behandling av denne dødelige sykdommen
Citation. Jeong JH, Bhatia A , Toth Z, Oh S, Inn KS, Liao CP, et al. (2011)
TPL2 /COT /MAP3K8 (TPL2)
Aktivering Fremmer Androgen Nedbryting-Independent (ADI) Prostate Cancer Vekst. PLoS ONE 6 (1): e16205. doi: 10,1371 /journal.pone.0016205
Redaktør: Jean-Marc VANACKER, Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon, Frankrike
mottatt: 07.09.2010; Godkjent: 08.12.2010; Publisert: 18 januar 2011
Copyright: © 2011 Jeong et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert og støttet av DoD 060 868 og ACS tilskuddet IRG-58-007-48 til JHJ, gir NIH CA 109 147 og R01 CA 136 924 til GAC, NIH gir CA 59705 og CA 113 392 til PRB, og CA082057, CA31363, CA115284, AI083025, DE019085, CA148616, Hastings Foundation, og Fletcher Jones Foundation til JUJ. (https://cdmrp.army.mil/, https://www.cancer.org/, https://www.nih.gov/, https://www.fletcherjonesfdn.org/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft rammer 1 av 6 amerikanske menn, med mer enn 2 millioner lever med sykdommen. Kirurgi er effektiv, med nesten 100% av pasientene resterende kreftfrie i flere år hvis sykdommen oppdages tidlig og kreftceller er begrenset til prostata [1]. Men når kreft sprer seg utover prostatakjertel, er resultatet nesten alltid dødelig. Siden prostata kreft celler krever testosteron til drivstoff deres vekst og overlevelse, har androgen-deprivasjon terapi er konstruert for å stanse kreft vekst ved enten å stoppe produksjonen av testosteron eller hindrer hormonet fra å handle på prostatakreftceller [2]. Til tross for den innledende positiv respons på hormonbehandling, prostata kreft celler alltid går igjen i en aggressiv, androgen uttømming uavhengig (ADI) form. Selv om genetiske endringer forbundet med initiering og progresjon av prostatacancer har blitt intensivt studert [3], [4], [5], [6], [7], de underliggende overgangen fra androgen-avhengige (AD) til ADI prostata kreftvekst er forholdsvis mindre godt forstått. Denne mangel på forståelse hemmer vår evne til å utvikle target-drevet terapeutiske strategier for effektiv behandling av ADI prostatakreft.
I nærvær av androgen, androgenreseptoren (AR) gjennomgår fosforylering, dimerisering, og translokasjon inn i det kjernen, karakterisert ved at det bindes til androgen-responselementer (ER) områder, noe som resulterer i den transkripsjonelle aktivering av målgener [8]. Imidlertid overbevisende data, herunder RNAi knockdown og innføring av antagonister for androgenreseptoren (AR), indikerer at AR er fortsatt nødvendig for ADI prostatakreft vekst [9], [10], [11]. Derfor under androgen fattige forhold, ADI prostatakreftceller synes å utvikle intracellulære strategier som aktiverer AR signalveien. Mange underliggende mekanismene er blitt foreslått: økt
AR
uttrykk gjennom
AR
genamplifikasjon, økt
AR
følsomhet gjennom økt AR stabilitet og kjernefysiske lokalisering, utvidet AR ligand spesifisitet gjennom mutasjoner i sin ligand-bindende domene, og økt AR-aktivitet via post-translasjonelle modifikasjoner [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18]. På den annen side, aktivering av andre signaloverføringsreaksjonsveier, slik som BCL-2-aktivering, kan også omgå den nødvendige av AR aktivering for proliferasjon og overlevelse av prostatakreftceller [19]. Til slutt, et forhåndsdefinert undergruppe av ADI prostata kreft celler med progenitor /stamceller trekk kan bli dominerende i henhold androgen fattige forhold [20].
Mange studier viser at aktiveringen av RAS /RAF /MEK /ERK sti kan korreleres med ADI prostatakreft vekst [5], [13], [21], [22]. Nylig har en genetisk konstruert mus (GEM) modell, der uttrykk for en potent aktivator av RAS-MAPK signalering, B-RAF
E600, er rettet mot prostata epitel ved hjelp av en tet-induserbar system, utviklet invasiv adenokarsinom og dette videre kommet til lat ADI lesjoner etter kastrering [23]. Men mot intuitivt, aktiverende mutasjoner i RAS /RAF /MEK /ERK veien er sjeldne i menneskelige prostata kreft, selv om autokrine og parakrine vekstfaktor løkker synes å aktivere veien [24], [25]. Viktigere, en fersk undersøkelse foreslått at kromosom rearrangements av RAF kinase veien er ytterligere kilder til MEK /ERK signale aktivisering, og bidra til prostatakreft utvikling og progresjon [26].
For å identifisere nye kinase gener relatert til ADI prostatakreft vekst, vi skjermet et bibliotek av aktiverte humane kinaser. Her rapporterer vi identifiseringen av en serin /treonin kinase,
TPL2
, som kjører ADI prostatakreft vekst gjennom aktivering av MEK /ERK signalveien og NF-kB. Dette gir en ledetråd for å finne flere kilder til MEK /ERK sti aktivering i ADI prostatakreft. Videre undertrykkelse av TPL2 minker ADI prostatakreft vekst og en høy frekvens av TPL2 overekspresjon i menneskelige ADI prostatakreft prøvene validerer TPL2 som et mål for behandling av denne dødelige sykdommen.
Resultater
Kartleggings TPL2, ved Screening et bibliotek av aktiverte humane kinaser
for å identifisere nye kinase gener relatert til ADI prostatakreft vekst, vi skjermet et bibliotek med 354 aktiverte humane kinaser består av 98 kinase-relaterte åpne leserammer ( ORF) og 256 humane kinaser klonet inn i en gateway-kompatibel retrovirale destinasjonsvektor, eie-MF-DEST, hvori en myristoylation sekvens og en FLAG-epitop tag (MF) ble tilsatt til N-termini av hver innført ORF [27] . Som en avlesning for skjermen, brukte vi en reporter konstruksjon inneholdende
cis
regulatoriske promoter-regionen (5,8 kb inneholder en
AR
enhancer) av prostata-spesifikt antigen (
PSA
) genet, som er sterkt uttrykt i normal prostata epitel og i prostata tumorer [28], [29]. Den promoter /enhancer-aktivitet kan måles ved hjelp av en sammensmeltet
Luciferase
reporter-gen (figur 1A). For å identifisere mulige kinase gener i stand til å indusere transkripsjonen aktivitet av
PSA
enhancer /promoter
cis
regulatoriske område under androgen fattige forhold, hver kinase konstruksjon, sammen med reporteren plasmid ble ko-transfektert inn i individuelle brønner i en 12-brønns plate som inneholder androgen-avhengige LNCaP (AD-LNCaP) celler dyrket i media supplert med R1881, en syntetisk androgen (figur 1A). Tjuefire timer etter transfeksjon, ble AD-LNCaP-celler inkubert med medium inneholdende 10% trekull-strippet føtalt bovint serum (CS-FBS) uten R1881. Etter 24 timer inkubasjon transkripsjonen aktivitet av
PSA
enhancer /promoter
cis
regulatoriske område under androgen fattige forholdene ble målt ved luciferase analyser. Ut av 354 aktiverte humane kinase gener, uttrykk for
TPL2
genet i AD-LNCaP celler indusert det høyeste nivået av PSA transkripsjonen aktivitet i fravær av R1881 (figur 1B øvre). Som kontroller, andre onkogener, for eksempel
RAF Hotell og
RAS Hotell som tidligere har vært kjent for å være assosiert med ADI prostatakreft vekst, ble inkludert [5], [22], [23] , [26], [30]. Deres uttrykk faktisk indusert transkripsjonen aktivitet av
PSA
enhancer /promoter
cis
regulatoriske område under androgen fattige forhold til noen, men mindre grad enn
TPL2
. Men når testet i androgen reseptor (AR) -negative DU-145 prostatakreftceller,
TPL2
fremkalte ikke ADI transkripsjonen aktivitet, noe som tyder på at AR uttrykk er nødvendig for ADI transkripsjonen aktivering av
PSA
enhancer /promoter
cis
regulatoriske region indusert av
TPL2 plakater (Figur 1B midten, vær oppmerksom på endringen i omfanget av Y-aksen). På den annen side, androgen uttømming uavhengig C4-2B (ADI-C4-2B) celler viste høye endogene nivåer av transkripsjonen aktivitet av
PSA
enhancer /promoter
cis
regulatoriske region fravær av R1881 (figur 1B nederst). Disse dataene øke muligheten for at preexisting genetiske og epigenetiske forandringer i ADI-C4-2B celler bidrar til den høye endogene nivået av ADI transkripsjonen aktivitet drevet av
PSA
enhancer /promoter
cis
regulatoriske region. Det bør bemerkes induksjon av transkripsjonen aktivitet av
PSA
enhancer /promoter
cis
regulatoriske regionen med
TPL2
overekspresjon i AD-LNCaP cellene var mer slående (større enn 20 ganger) ved lave nivåer (0.1~0.001 nM) for R1881, som er sammenlignbart med de fysiologiske nivåer av androgen hos pasienter som har gjennomgått kastrasjon kirurgi (figur 1C). Videre ble ADI transcriptional aktivering avskaffet med en TPL2 hemmer behandling når enten med TPL2 overekspresjon i AD-LNCaP celler eller bare med endogen TPL2 uttrykk i ADI-C4-2B celler (figur 1D). For å teste muligheten for at det høye endogene nivået av ADI transkripsjonen aktivitet av
PSA
enhancer /promoter
cis
regulatoriske region i ADI-C4-2B celler kan skyldes økt TPL2 uttrykk, vi sammenlignet uttrykket nivået av
TPL2
i AD-LNCaP og ADI-C4-2B celler. Faktisk, ADI-C4-2B celler viste høyere nivå av
TPL2
uttrykk enn i AD-LNCaP celler (Figur S1 A). Videre er det i C4-2B celler, reagerer PSA enhancer /promoter-aktivitet for lave nivåer av eksogent TPL2 uttrykk, men ikke for høye nivåer av ekspresjon TPL2 (figur S1B). Det er mulig at høye nivåer av TPL2 eksogene uttrykk i C4-2B celler som allerede uttrykker et høyere nivå av endogen TPL2 uttrykk enn LNCaP celler, fører til skadevirkninger på PSA enhancer /promoter aktivitet. Derfor har vi identifisert
TPL2
som kandidat onkogen, som kan være forbundet med ADI prostatakreft vekst.
(A) Skjematisk av identifisering av kandidatgener som kan indusere transkripsjonen aktivering av en
PSA
enhancer /promoter
cis
regulatoriske region reporter konstruere henhold androgen fattige forholdene i androgen-avhengige LNCaP celler. Myr, myristoylation sekvens; ER, androgen respons elementer; CS-FBS, trekull-strippet føtalt bovint serum. (B) Relative LUC aktivitet (
PSA
enhancer /promoter luciferaseaktiviteten er normalisert til pGL3 beta-galaktosidase-aktivitet) ble målt etter 24 timers inkubering med 10% CS-FBS uten R1881 (unntatt for den andre kolonne med 10% CS-FBS + 1 nM R1881 som en kontroll) etter ko-transfeksjon av plasmider som uttrykker konstitutivt aktiverte former av de angitte kinase gener. Bretteinduksjonsverdiene (relativ LUC aktivitet dividert med den relative basal LUC aktivitet av vektoren kontroll), er angitt i grafen for LNCaP-celler. Relativ LUC aktiviteter ved
TPL2
uttrykk er angitt i rødt. Statistisk signifikant økning i LUC aktiviteter i forhold til vektor kontroll uten R1881 behandling er merket med * (p 0,05). (C) Relativ LUC aktivitet med økende konsentrasjon av R1881 i LNCaP celler forbigående co-transfektert med enten plasmider uttrykker Myristoylated
TPL2
eller med tom vektor. Statistisk signifikant økning i LUC aktivitet i forhold til hverandre tilsvarende R1881 konsentrasjon med vektorkontroll er merket med * (p 0,05). (D) Relativ LUC aktivitet med økende konsentrasjon av TPL2 inhibitor enten i AD-LNCaP celler forbigående ko-transfektert med plasmider som uttrykker Myristoylated
TPL2
eller i utransfekterte AI-C4-2B celler. Relative LUC aktiviteter med /uten R1881 er angitt i svart som kontroller. Statistisk signifikant økning i LUC aktiviteter i forhold til vektor kontroll uten R1881 behandling er merket med * (p 0,05). Alle forsøkene ble utført tre ganger med hver i tre eksemplarer, og hver kolonne representerer gjennomsnitt ± standardavvik.
TPL2 Aktivering Induserer ADI Vekst av AD prostata kreft celler
For å verifisere enten
TPL2
er funksjonelt forbundet med ADI prostatakreft cellevekst, undersøkte vi de funksjonelle konsekvensene av overekspresjon eller undertrykkelse av
TPL2
i AD eller ADI prostata kreft celler, henholdsvis. For det første, for å avgjøre om
TPL2
overekspresjon er tilstrekkelig til å fremme ADI prostatakreft vekst, etablerte vi AD-LNCaP stabile cellelinjer overekspresjon enten N-terminalt myc-merket villtype [
myc-TPL2
(WT)], et konstitutivt aktivert form med en sletting av 70 aminosyrer i sin C-terminale [
myc-TPL2 product: (A C)], eller en kinase-inaktiv form av
TPL2
[
myc-TPL2 plakater (D270A)] med pBabe-puro vektor (figur 2A). Ekspresjonen av hvert transdusert-genet ble bekreftet ved western blot (Figur 2B). Interessant, uttrykk for
myc-TPL2 product: (A C) konstitutivt aktivert mutant var lavere enn for
myc-TPL2 plakater (WT) og
myc-TPL2
D270A mutant tross som har det høyeste nivået av fosfor-ERK, en nedstrøms signalmolekyl (figur 2B). For å eliminere muligheten for uttrykket nivå effekter, etablerte vi et annet sett med AD-LNCaP stabile cellelinjer som overuttrykker enten C-terminalt flagg-merket villtype (
TPL2
-wt-flagget), et konstitutivt aktivert form med en sletting av 70 aminosyrer i C-terminalen (
TPL2
-delC-flagget), eller en kinase-inaktiv form av
TPL2 product: (
TPL2 Anmeldelser – inaktiv-flagg) ved hjelp av pEF-IRES-puro vektor (figur S2). Denne tilstanden viste også lavere uttrykk for
TPL2
-delC-flagg enn
TPL2
-wt-flagget og
TPL2
-inactive-flagget (figur S2), noe som tyder på at uttrykk for en konstitutivt aktivert form av
TPL2
ovenfor fysiologiske nivåer kan ha negative effekter på cellen. Men uansett
TPL2
uttrykk nivåer, generelle LNCaP celler som uttrykker enten
myc-TPL2 plakater (WT) eller myc-
TPL2 product: (A C) viste akselerert celleproliferasjon ved androgen- fratatt, -Lav, og -RICH vilkår i forhold til LNCaP celler uttrykker enten vektor alene eller myc-
TPL2 plakater (D270A) mutant (Figur 2C). Spesielt LNCaP-celler som uttrykker myc-
TPL2 product: (A C) viste en statistisk signifikant økning i celleproliferasjon sammenlignet med kontrollceller (LNCaP-GFP) under androgen-utarmet tilstand og ved lave nivåer av R1881 (0,01 nM og 0,1 nM) 3, 6, 9 dager (* p-verdi 0,05). Lignende data ble oppnådd med stabile cellelinjer konstruert med PEF-IRES-puro vektor (figur S2). Derfor er disse dataene indikerer at
TPL2
aktivering av over-uttrykker enten villtype eller et konstitutivt aktivert form av TPL2 fører til fremme av ADI vekst av AD-LNCaP celler.
(A ) Skjematisk av etablerte stabile LNCaP cellelinjer overekspresjon enten
GFP
, en myc-merket villtype
TPL2 product: [
myc-TPL2 plakater (WT)], en myc- tagget konstitutivt aktivert form av
TPL2
med en avkorting på 70 aminosyrer i sin C-terminale [
myc-TPL2 product: (A C)], eller en myc-merket kinase-inaktiv form av
TPL2 product: [
myc-TPL2 plakater (D270A)] med pBabe-puro uttrykk vektor. (B) Western blot analyse for å påvise uttrykk for
TPL2
konstruerer ovenfor (som indikert med piler i rødt). β-aktin ble benyttet som en kontroll for å laste den samme mengde av proteiner. (C) MTT-analyser for å måle celleproliferasjon av de stabile cellelinjer ovenfor i fravær av eller med lave nivåer av R1881 (0,01 nM, 0,1 nM, og 1 nM). Statistisk signifikant økning i celleproliferasjon i forhold til å kontrollere celler (LNCaP-GFP) er merket med * (p 0,05).
undertrykkelse av TPL2 Expression eller Hemming av Sin kinase aktivitet i ADI prostatakreft celler fører til redusert spredning fenotyper
Neste, for å avgjøre om ADI prostata kreft celler er avhengig av
TPL2
for deres ADI cellevekst, vi undertrykt
TPL2
uttrykk eller aktivitet enten med shRNA-mediert knockdown eller ved TPL2 inhibitor behandling, henholdsvis. Som vist i figur S1,
TPL2
uttrykk var høyere i ADI-C4-2B celler enn i AD-LNCaP celler. Den reduserte uttrykk for
TPL2
i ADI-C4-2B celler ved shRNA-mediert knockdown bruker pLKO.1-TRC vektor ble bekreftet av western blot (figur 3A). ADI-C4-2B celler med et redusert uttrykk for
TPL2
viste signifikant redusert spredning sats i henhold til androgen fattige forhold (Figur 3B). Vi har bekreftet disse dataene med ytterligere shRNA-mediert knockdown systemet med pGIPZ lentiviral vektor (Figur S3). Videre ADI cellevekst av ADI-C4-2B-celler ble også signifikant redusert ved behandling av en TPL2 inhibitor [Figur 3C; Den 50% inhiberende konsentrasjon (IC
50) av 4,0 uM ble bestemt som i figur S4]. Undertrykkelse av MEK /ERK bane i ADI-C4-2B celler med behandling av TPL2 ble bekreftet ved western blot (Figur 3D). Sammen utgjør disse dataene indikerer at
TPL2
aktivering er nødvendig for effektiv ADI veksten av ADI-C4-2B celler.
(A) Western blot analyse for å vise hvor mye
TPL2
uttrykk i de stabile C4-2B cellelinjer som uttrykker de indikerte shRNAs hjelp av pLKO.1-TRC lentiviral vektor ved tidspunktet for den følgende MTT-assay. β-aktin ble benyttet som en kontroll for å laste den samme mengde av proteiner. (B) MTT-analyser for å måle celleproliferasjon av de stabile cellelinjer i fravær av R1881. * P 0,05. (C) MTT-analyser for å måle celleproliferasjon av androgen-uavhengig depletion C4-2B celler med behandling av TPL2 inhibitor (4 uM). (D) undertrykkelse av MEK /ERK sti i ADI-C4-2B celler med økende konsentrasjon av en TPL2 inhibitor ble bekreftet av western blot.
TPL2 Aktivering Fremmer ADI prostatakreft Veksten i PTEN sletting Mouse Model
Tidligere hadde det vært vist at biallelic betinget PTEN sletting i prostata epitel kan indusere adenokarsinom som sammenfatter de fleste av histopatologiske trekk ved menneskelige prostata kreft [31], [32], [33]. Enda viktigere, androgen ablasjon av disse mus ved kirurgisk kastrasjon ført til fremveksten av ADI prostatakreft vekst (figur 4A) [33]. Nylig, prostata kreft cellelinjer ble etablert fra primær prostata kreft i
PTEN
sletting modell [34]. Etter langvarig kultur av disse cellene under androgen fattige forhold, ADI prostata kreft-lignende celler utpekt som «E» celler utviklet seg etter en innledende massiv celledød av AD celler. I tillegg prostatakreftcellelinjer ble også etablert av tilbakevendende ADI prostatakreft som utvikles etter kirurgisk kastrasjon og heter «CE» celler [34]. I motsetning til de E-celler, er disse cellelinjene CE androgen-uavhengig uttømming fra begynnelsen av, slik at det ikke var noen innledende massiv celledød i henhold til androgen-utarmet betingelser. For å undersøke om
TPL2
aktivering er fysiologisk relevant for ADI tumorvekst
in vivo
, vi først sammen uttrykket nivåer av
TPL2
mellom E cellelinjer (E2 og E4) og CE-cellelinjer (CE1, CE2 og CE3). CE cellelinjer (CE1, CE2, og CE3) viste høyere nivåer av
TPL2
uttrykk i forhold til E cellelinjer (E2 og E4) av western blot og immunhistokjemi (figur 4B og 4C). Interessant, E cellelinjer viste litt høyere nivåer av
AR
uttrykk enn CE cellelinjer, noe som tyder på at E cellelinjer kan ha ervervet ADI vekst om AR overekspresjon (figur 4B). ADI cellevekst av CE celler (CE1, CE2, og CE3) ble mer spesielt påvirket enn E celler (E2 og E4) som behandles med økende nivåer av en TPL2 inhibitor (figur 4D). Sammen er disse observasjonene tyder på at
TPL2
er også nødvendig for effektiv ADI prostatakreft cellevekst i musemodell.
(A) Skjematisk av «Pb-Cre4 :: PTEN
f /f :: β-Actinp-GFP
f /f-Luc «musemodell, der
PTEN
alleler er homozygously slettet og
Luciferase
er uttrykt i prostata epitel etter prostata-spesifikt
Probasin
promoter (Pb) -driven Cre recombinase uttrykk. Disse sammensatte musene utviklet prostata intraepitelial neoplasi (PIN), prostata invasiv adenokarsinom, og metastatisk prostatakreft ved de angitte tider. Viktigst, androgen ablasjon av disse mus ved kirurgisk kastrasjon ført til fremveksten av kreft vekst ADI prostata til tider varierende fra 7 til 28 uker etter kastrering i alle levende mus. E2 og E4 prostatakreftcellelinjer ble etablert i første omgang fra primærprostatakreftceller før kastrering som senere utviklet seg ADI vekst på lang sikt kultur i henhold til androgen-utarmet forhold. Men CE1, CE2, og CE3 prostatakreftcellelinjer ble etablert fra ADI prostatakreft etter kastrering. Bilder (200X) er representative for celle morfologi av E2 og CE1 celler. (B) Western blot analyse for å sammenligne uttrykket nivåer av AR og TPL2 mellom E cellelinjer (E2 og E4) og CE cellelinjer (CE1, CE2, og CE3) celler.
β-actin
ble anvendt som en kontroll for å laste den samme mengde av proteiner. AD, androgen-avhengige; ADI, androgen uttømming uavhengig; og AR, androgen reseptor. (C) Immunhistokjemisk analyse for å undersøke
TPL2
uttrykk i AD og ADI prostata kreft i
PTEN
sletting musemodell. Human duodenum vev som uttrykker høye nivåer av endogen TPL2 ble anvendt som en positiv kontroll (øverst til høyre). Som en negativ kontroll ble det vev farget bare med det sekundære antistoff (øverst til venstre). PCA, prostata adenokarsinom. (D) MTT-analyser for å måle celle proliferasjon av celler (E E2 og E4) og CE-celler (CE1 og CE3) med behandling av forskjellige nivåer av TPL2 inhibitor (0, 1, 5, eller 10 uM). Statistisk signifikant reduksjon i celleproliferasjon i forhold til kjøretøybehandling er merket med * (p 0,05).
TPL2 uttrykk er oppregulert i menneskelige ADI prostatakreft prøver
Til slutt, for å validere den kliniske relevansen av
TPL2
kinase handling i menneske ADI prostatakreft vekst, undersøkte vi hyppigheten av
TPL2
uttrykk i ADI menneskelige prostata kreft prøver ved hjelp av microarray (TMA). Vi evaluerte TPL2 farging av 12 normal (N), 52 hormon-naive (HN), 52 hormon-ildfast (HR), 26 hormon naive metastatisk (HN Met), og 12 hormon-metastaserende (HR Met) formalinfiksert parafin innebygde prøver. Figur 5A viser representative bilder av TPL2 uttrykk for normal prostata, hormon-naive prostatakreft, og hormon-refraktær prostatakreft menneskelige prostata TMA prøver. Som vist i figur 5B, var den samlede farging hyppigheten av TPL2 økt i hormonnaive pasienter (34,8%) og hormon-ildfast (36,5%) prøver i forhold til normale prostata prøver (18,2%). Økningen er større betydning i metastatisk prostatakreft prøver med 46,2% (p 0,05) av hormon naive metastatisk og 41,7% av hormon-metastaserende prøver, noe som tyder på at TPL2 uttrykk kan også være forbundet med prostata kreft metastasering. Spesielt skår både total gjennomsnitts farging stillingen og frekvensen av prøver med en sterkt belastende øket med utviklingen av prostatakreft (figur 5B). Samlet utgjør disse TMA data tyder på at TPL2 uttrykk er oppregulert med utviklingen av prostatakreft.
(A) Representative bilder av hver normal prostata (N), hormon-naive prostatakreft (HN), hormon-ildfast prostatakreft (HR), hormon-naive metastatisk prostatakreft (HN Met), og hormon-metastaserende prostatakreft (HR Met) av de fargede menneskelige prostata vev mikromatriser. TPL2 ekspresjon ble påvist ved immunhistokjemisk analyse ved anvendelse av et antistoff mot TPL2. (B) Statistisk analyse av TPL2 uttrykk i hver gruppe N, HN, HR, HN Met, HR Met prøver av farget menneskelige prostata microarray for i form av gjennomsnitts flekker score og farging prosentandel. Statistisk signifikante forskjeller i gjennomsnittlig farging poengsum er merket med * (p 0,05). Totalt prøvenummer for hver gruppe er notert. Fargeintensitet ble scoret uavhengig av to urologiske patologer med 0 (ingen flekker), en (svak flekker), 2 (middels flekker), og 3 (sterk farging) for hver prøve.
Diskusjoner
prostatakreft kan lett behandles og kureres hvis den oppdages i en tidlig fase, når tumorvekst er fortsatt begrenset til prostata. Men når kreften sprer seg utover prostatakjertelen, blir behandlingen vanskelig, selv om behandlingstilbud, for eksempel strålebehandling, hormonbehandling og kjemoterapi brukes med varierende grad av effektivitet. Fremveksten av en mer aggressiv, androgen uttømming uavhengig (ADI) form for prostatakreft er komplikasjon hyppig forekomst og årsaken til svikt i hormonbehandling. Derfor studier i forbindelse med identifisering og karakterisering av genetikk liggende ADI prostatakreft vekst er kritiske for fremtidig utvikling av target-drevet terapeutiske strategier for effektiv behandling av ADI prostatakreft. I denne studien ved screening av et bibliotek av aktiverte humane kinaser, vi identifisert og karakterisert et kinase-genet,
TPL2
, som ser ut til å drive ADI prostatakreft vekst. Enda viktigere,
TPL2
er oppregulert i ADI prostata kreft både
PTEN
sletting musemodell og de kliniske prostatakreft prøver. Disse dataene antyder sterkt at
TPL2
kinase spiller en avgjørende rolle i markedsføringen av ADI prostatakreft progresjon.
TPL2
, også kjent som tumorprogresjon locus 2, som koder for en produkt med en delesjon av sin C-terminale regionen ble opprinnelig klonet som en transformerende gen fra en human thyroideakarsinom cellelinje, og det ble kalt
barneseng plakater (kreft Osaka skjoldbruskkjertelen) [35]. Nesten samtidig, ble det også identifisert som et protein kinase assosiert med utvikling av T-cellelymfom, da det ble oppdaget at Moloney murine leukemia provirale genom har integrert i den siste intron i
TPL2
-genet resulterer i en delesjon av dets C-terminale [36]. En transgen mus studie viste at bare transgene mus som uttrykker en C-terminal slettet form av
TPL2
under kontroll av en proksimal
Lck
promoteren utviklet T-cellelymfom, noe som antyder at den C-terminale domenet av villtype
TPL2
spiller en hemmende rolle i sin kinase aktivitet [37]. Faktisk, slettes den C-terminale TPL2 har økt stabilitet og en høyere spesifikk kinase aktivitet enn vill-type. I tillegg samvirker TPL2 med en negativ regulator, NF-kB-inhiberende protein NF-κB1 p105 gjennom sin C-terminale ende, og således den C-terminale slettet TPL2 er ufølsomt overfor p105 negativ regulering [38], [39]. Interessant,
TPL2
uttrykk er også oppregulert i ca 40% av menneskelige brystkreftprøver, som kan være forårsaket av en økning i
TPL2
gen kopiantall [40]. Derfor er det viktig å bestemme hvorvidt TPL2 signaleringsaktivering i humane prostatacancerprøver kan skyldes enten den genetiske mutasjon ved en C-terminal region eller et gen kopitallet øker. Våre data viser at TPL2 uttrykkes på høyere nivå i ADI-C4-2B celler enn i AD-LNCaP celler, og dermed bidra til høy endogene nivået av ADI transcriptional aktivering av
PSA
enhancer /promoter
cis
regulatoriske region i ADI-C4-2B celler (figur S1). Vi sammenlignet også
TPL2
sekvenser av to cellelinjer, men ikke oppdage noen sekvens forskjell, noe som tyder på at ADI fenotype av C4-2B cellene ikke er assosiert med spesifikke mutasjoner i
TPL2
genet. I tillegg er en tidligere studie viste at mRNA-nivået av
TPL2
i mus prostata økt etter kirurgisk kastrering, men det deretter redusert etter gjentatt administrering av testosteron [41]. Disse mikroarray data tyder på at
TPL2
ekspresjon i prostata er omvendt regulert av testosteron på transkripsjonsnivået. Derfor er det mulig at redusert nivå av androgen med hormonterapi kan øke TPL2 ekspresjon, noe som resulterer i prostatakreft celle overlevelse og proliferasjon i henhold til androgen-utarmet betingelser. Denne hypotese er under en aktiv undersøkelse.
I nærvær av androgen, gjennomgår AR fosforylering, dimerisering, og translokasjon inn i kjernen, karakterisert ved at det bindes til ER områder, noe som resulterer i den transkripsjonelle aktivering av målgener [8] . Imidlertid flere rapporter viser at AR er fortsatt nødvendig for ADI prostatakreft vekst [9], [10]. Som for de underliggende mekanismene for TPL2-mediert ADI prostatakreft vekst, er et spørsmål om denne handlingen krever AR uttrykk og aktivitet. Opphevelse av TPL2-mediert PSA promoter aktivering i AR-negative DU-145 prostatakreftceller tyder på at
TPL2
formidlet ADI prostatakreft vekst kan være fortsatt avhengig av AR aktivitet.
