Abstract
Standard kreft cellelinjer ikke modellere intratumoural heterogenitet situasjonen tilstrekkelig. Klonal seleksjon fører til en homogen populasjon av celler ved genetisk drift. Heterogenitet av tumorceller, men er særlig kritisk for terapeutisk relevante studier, da det er en forutsetning for å skaffe legemiddelresistens og tilbakevendende tumorer. Her rapporterer vi isolering av et høyt tumorigen primær bukspyttkjertelkreft cellelinje, kalt JoPaca-en og dens detaljert karakterisering på flere nivåer. Implantasjon av så få som 100 JoPaca-1-celler i immundefekte mus ga opphav til svulster som var histologisk meget lik den primære tumor. Den høye heterogeniteten til JoPaca-1 ble reflektert av forskjellige cellemorfologi og et betydelig antall av kromosomale aberrasjoner. Sammen hel-genomsekvensering av JoPaca-en og BxPC-3 avslørt mutasjoner i genene ofte endret på kreft i bukspyttkjertelen. Eksepsjonelt høy uttrykk for kreft stamcellemarkører og en høy klonogene potensial
in vitro Hotell og
in vivo
ble observert. Alle disse egenskapene gjør denne cellelinjen en ekstremt verdifull modell for å studere biologi og farmasøytiske effekter på kreft i bukspyttkjertelen
Citation. Fredebohm J, Boettcher M, Eisen C, Gaida MM, Heller A, Keleg S, et al. (2012) Etablering og karakterisering av en høyst tumorer og kreft Stem Cell Beriket bukspyttkjertelkreft cellelinje som en veldefinert Model System. PLoS ONE 7 (11): e48503. doi: 10,1371 /journal.pone.0048503
Redaktør: Nathan A. Ellis, University of Illinois i Chicago, USA
mottatt: 5 juli 2012; Godkjent: 26 september 2012; Publisert: 12.11.2012
Copyright: © 2012 Fredebohm et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble finansielt støttet av den tyske Kunnskapsdepartementet (BMBF) som en del av NGFN PaCaNet konsortiet (BMBF-01GS08117). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Jörg Hoheisel og Jörg Tost tjene som redaktører for PLoS ONE. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer ..
Innledning
Bukspyttkjertelkreft er en av de mest aggressive typer kreft. Dødeligheten er nesten identisk med forekomst. Med en fem-års overlevelse på mindre enn 5%, er det den fjerde vanligste årsaken til kreftrelaterte dødsfall i den industrialiserte verden [1]. Årsaker til dårlig prognose er sen klinisk diagnose [2] og svulsten motstand mot standard kjemoterapi [3]. Med ca 90% av tilfellene, bukspyttkjertel ductal adenokarsinom (PDAC) er den vanligste formen og ansvarlig for den høye dødeligheten; andre, sjeldne kreftundertyper, som for eksempel cystisk svulster, er mindre dødelig. PDAC er antatt å oppstå fra epitelceller i pankreatisk duktus system [4]. Fordeling av tumorceller i den maligne vev er typisk diffus og inneholder områder med varierende grad av histologisk differensiering. Det er også karakterisert ved en overordnet heterogen tumorcellepopulasjon (intratumoural heterogenitet) [5], [6].
Et betydelig antall PDAC cellelinjer med forskjellige egenskaper har blitt etablert, og tilveiebringe en cellulær kilde for undersøkelse av molekyl aspekter ved denne ødeleggende sykdommen (grundig gjennomgått av Ulrich et al. [7]). Imidlertid, dyrking av cellelinjer i henhold til veldefinerte betingelser fører uunngåelig til valg av subpopulasjoner over tid. Dermed trenger standard cellelinjer ikke modellere situasjonen for intratumoural heterogenitet, siden klonal seleksjon har pågått over mange passasjer
in vitro
. Dette fører til en homogen populasjon av celler ved genetisk drift [8]. Tvert imot, primære cellelinjer meget ligner den heterogeniteten av den primære tumor, og gir derfor en god kilde for cellekultureksperimenter.
in vivo
heterogenitet av tumorceller er spesielt kritisk for eksperimenter teste effekten av cellegift, fordi heterogenitet gir grunnlag for valg av resistente subpopulasjoner, som igjen danner grunnlaget for ervervet narkotika motstand og gjentakelse av svulsten [3], [9]. Blant befolkningen i resistente celler, kreftstamceller spiller en spesielt viktig rolle som de har evnen til å fornye seg selv [3] og er i stand til å fylle den på svulst på den primære nettstedet eller føre til metastasedannelse i fjerne områder [10].
Cancer stamceller eller svulst initiere celler som driver tumorprogresjon har fått mye oppmerksomhet de siste tiårene [11], [12], [13]. For kreft i bukspyttkjertelen, har flere molekylære markører blitt foreslått å være karakteristisk for kreftstamceller. Blant disse er uttrykk for den lett CD44, CD24 og ESA [14], er celleoverflateprotein CD133 (prominin I) [15], [16], [17], og – mer nylig – økt aktivitet av aldehyd dehydrogenase 1 (ALDH1 ) [18]. Ekspresjon av ALDH1 har også blitt korrelert med invasjon og migrasjon, samt mesenkymale funksjoner av tumoren [19]. Videre har det vært forbundet med dårlig total overlevelse. Interessant imidlertid to motstridende studier viser at høy [19] eller lav [20] ekspresjon av ALDH1, har en ugunstig effekt på pasientens overlevelse. Et annet kjennetegn på startfasen er evnen til å danne kuler eller tumor kuler i suspensjon [21], [22]. Cancer stamceller er også antatt å bidra til utvikling av medikamentresistens. Samtidig har det vist seg at innholdet av CD133 uttrykkende celler kan bli beriket av gemcitabin-behandling [23], [24], [25] som antyder en viktig rolle i denne CSC markør i gemcitabin motstand.
Her vi rapporterer isolering og karakterisering av en ny primær cellelinje avledet direkte fra en human svulst prøve fra en pasient med pankreatisk duktus adenokarsinom. Denne cellelinje, heter JoPaca-en, viser en høy variasjon i morfologi og bærer mange kromosomavvik. Patologisk mus-xenografter og den primære svulsten har en høy grad av likhet i form av diffusive differensiering og infiltrasjon av omkringliggende pankreas og ikke-pankreatisk vev. JoPaca-1 celler uttrykker svulst markør mesothelin og flere cytokeratins. Bortsett fra sin høye heterogenitet, trolig den viktigste funksjonen i denne nye cellelinje er dens høye innhold av svulst initiere celler som demonstrert av
in vivo
begrensende fortynning analysen og høy uttrykk nivåer av kreftstamcellemarkører. I lys av dets likhet til den opprinnelige tumor og i kombinasjon med den grundige molekylær karakterisering, gir cellelinjen en utmerket kilde for enhver form for cellebasert snarere enn tissue-baserte analyser.
Materialer og Metoder
Etikk uttalelse
Informert skriftlig samtykke ble innhentet fra pasienten. Etisk godkjenning ble innhentet fra etikk provisjon av det medisinske fakultetet ved Universitetssykehuset i Heidelberg, Tyskland. Alle dyr omsorg og prosedyrer fulgt tyske lovbestemmelser og ble tidligere godkjent av den offentlige gjennomgang styret i delstaten Baden-Württemberg, Tyskland.
Cell isolasjon
Fresh vev ble hentet fra en 46- år gammel mannlig pasient som lider av kreft i bukspyttkjertelen, som gjennomgikk en pylorus bevar pancreatecto-duodenectomy. Under operasjonen ble en prøve tatt fra den fjernede tumor og direkte lagret i Hanks balanserte salter løsning (HBSS, H6648, Sigma Aldrich, Taufkirchen, Tyskland) ved 4 ° C i 12 timer før videre behandling. Vevet Prøven ble deretter skåret i stykker med en diameter på omtrent 5 mm og overført til en kulturflaske som inneholder Hams /F-12 medium (21765-029, Life Technologies, Darmstadt, Tyskland), supplert med serum erstatning reagens (S0638, Sigma Aldrich) . Vevet stykker er festet til substratet, og cellene vokste ut etter en uke, som danner klynger rundt vevet fragmenter. Fibroblaster og stel celler ble fjernet av to runder med serie enzymatisk avløsning med 0,05% Trypsin /EDTA (25300054, Life Technologies). Den resulterende populasjon av tumorceller ble frosset ved passasje nummer fire og lagret i alikvoter. For forsøkene beskrevet her, ble JoPaca-1 celler brukes i passasjene 6 til 19. immortalization av de isolerte cellene ikke var nødvendig.
Cell kultur
veletablerte bukspyttkjertelkreft cellelinjer MiaPaCa -2, MDAPanc-28, BxPC-3, ASPC-1, og CAPAN-1 ble erholdt fra ATCC (Rockville, MD, USA). I tillegg FamPAC ble vennlig levert av professor Eisold [26] og HPDE c7 celler av professor Francisco Fast (Spanish National Cancer Research Centre, CNIO) [27]. BxPC-3 ble godkjent av den tyske samlingen av mikroorganismer og cellekulturer (DSMZ, Braunschweig, Tyskland). Alle cellelinjer var fri for mycoplasms, virus og cellelinje forurensning som testet av PCR [28]
Cellene ble dyrket i standard medium og kosttilskudd, som ble hentet fra Life Technologies, Darmstadt, Tyskland med mindre annet er spesifisert.: JoPaca-1 i Isocove modifiserte Dulbeccos medium (IMDM), 10% føtalt kalve serum (FCS) og 1% penicillin-streptomycin (P /S) (Cat No. 21056.); BxPC-3 i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium, 10% FCS og 1% PS (Cat No. 21875.); HPDE c7 i keratinocytt serumfritt medium (KSFM), 0,15 ng /ml epidermal vekstfaktor-reseptor, og 25 ug /ml bovint hypofyseekstrakt (katalog nr. 17005075) [29]. For tumor sfære dannelse, JoPaca-1-celler ble dyrket i Hams /F12-medium supplert med 20 ng /ml basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF, F0291, Sigma Aldrich, Munchen, Tyskland), 1 x B-27 kosttilskudd (Cat. No . 0080085-SA), 2 mM L-glutamin (kat. nr 25030024), og 1% P /S i lave festeplater (kat. nr 3473, Corning, Amsterdam, Nederland). Celler ble splittet i et forhold på 1 til 10 mindre annet er angitt. Cellenes levedyktighet etter behandling med gemcitabin (G6423, Sigma Aldrich) ble bestemt ved resazurine analyse [30]. For langtidsbehandling med gemcitabin, ble JoPaca-1 celler i passasjen 10 utsatt for en periode på 72 timer til økende konsentrasjoner av medikamentet 10, 15, 20 og 25 nM. Celler ble delt 1/3 etter hver runde med behandling og sammenlignet med en kontroll i passasje 13 for ekspresjon av CD133. Bilder av foreldre JoPaca-1 og sub-kloner i kultur ble tatt på en invertert mikroskop (DM Irbe, Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland) er utstyrt med en CCD-kamera (Progressive Scan CV-M1, JAI, Frankfurt, Tyskland). Skala barer ble lagt i ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA) ved å beregne målt pikselstørrelser
Cytogenetikk -. Flerfarget fluorescens
in situ
hybridisering (mFISH)
JoPaca -1-celler ble behandlet med 10 ng /ml vinblastin ved 37 ° C, 5% CO
2 i 4 timer stanse dem i metafase. Metafase sprer ble fremstilt i henhold til standardprotokoller [31]. Kort sagt, ble suspendert celler behandlet med 75 mM KCl i 20 minutter ved 37 ° C og fiksert med Carnoy iskald løsning (methanol:acetic syre = 03:01) i tre vasketrinn. Løsningen av faste celler ble droppet fra en meter på et skråstilt lysbilde som tidligere hadde blitt fuktet med 70% etanol. mFISH ble utført ved hjelp av multi-farge probe kit 24XCyte (Metasystems, Altlussheim, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Hybridiserte metafase sprer ble analysert ved hjelp av en datamaskin-assistert fluorescens mikroskop (Axioplan to, Zeiss, Göttingen, Tyskland) utstyrt med passende filtersett. Bilder ble tatt opp med en CCD-kamera (fotometriske, Tucson, AZ, USA) og analysert ved hjelp av Quips SpectraVysion ™ programvare (Vysis, nå distribueres gjennom Applied Imaging).
klonogene potensial og tumourgeneity
in vitro
-limiting fortynningsanalyse.
JoPaca-1-celler ble sådd i en 96-brønns plate i et en-til-en fortynning serie som starter på 125 celler per brønn, hver fortynning i 16 gjentak. Ble mediet ikke endret for å muliggjøre autokrin signalering. Etter 10 dager ble brønnene som viser distinkte kolonier telles. Etter 15 dager ble kolonier som viser ulike morfologiske fenotyper fotografert.
In vivo
-limiting fortynning analysen.
Innledende xenograft eksperimenter ble utført ved å injisere 1 Mio celler i NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl (NOD /SCID /γ eller NSG) mus. For å bedømme in vivo tumorgenisitet av JoPaca-1, 104, 103 og 102-celler, henholdsvis, ble injisert i 70 ul Matrigel (2 mg /ml) (BD, Heidelberg, Tyskland) inn i pankreas legeme av NSG mus. Vellykket engraftment av svulster og påfølgende vekst ble overvåket ved regelmessig palpasjon av implantasjonsstedet.
For å kvantifisere klonogene potensial og tumor-initiering frekvens, ble data analysert av en regresjon-fit algoritme (ELDA) [32].
H E farging og immunhistokjemi av xenotransplantater og primærsvulster
Eksplanterte svulster ble innebygd i parafinblokker og seksjoner ble kuttet ved 4 mikrometer tykkelse ved hjelp av en mikrotom. Haematoxilin og eosin (H anti-cytokeratin 19 brukes på 1:50; anti-cytokeratin AE1 /AE3 (kode M3515, DakoCytomation) brukes ved 1:300; anti-CD133 /1 (AC133) (130-090-422, Miltenyi Biotech) som brukes ved 1:50; og en universell negative kontroll inneholder mus IgG (IS750, DakoCytomation) som brukes ved 1:02 fortynning. Platene ble inkubert ved 4 ° C i 16 timer. For påvisning av det primære antistoff, et sekundært anti-muse antistoff konjugert med peroksydase (K4001, DakoCytomation) ble anvendt i henhold til produsentens instruksjoner. Den fargereaksjon med diaminobenzodine (DAB) ble motfarget med hematoksylin. Til slutt, lysbilder ble sett ved hjelp av en Axioplan 2 mikroskop og bilder tatt av en AxioCam HRc CCD-kamera (Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Tyskland). Skala barer ble lagt i den medfølgende AxioVision 4 programvare.
immunfluorescens
For immunfluorescens av mesothelin og cytokeratin 19, JoPaca-en, BxPC-3 og HPDE C7 celler ble dyrket i kultur lysbilder (Cat . 354559, BD Biosciences), fiksert med 2% paraformaldehyd og permeabilisert med 0,2% Triton X-100 i 5 minutter. Platene ble blokkert i fosfatbufret saltvann (PBS) med 10% bovint serumalbumin (BSA) og epitoper hentes med PBS supplert med 10% proteinase K. IgG1 antistoffer mot mesothelin K1 (Kat. Sc-33672, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Tyskland ) og cytokeratin 19 (klone RCK108, Code-Nr. M 0888, DakoCytomation, Hamburg, Tyskland) samt mus IgG1 (MCA928, Serotec, Puchheim, Tyskland) som en negativ kontroll ble brukt ved en fortynning på 1:50. Den sekundære antistoff Alexa Fluor 488 geit anti-mus IgG1 (A-11001, Life Technologies) ble brukt ved en fortynning på 1:500. Lysbilder ble montert med vandig medium som inneholder 4 «, 6-diamidin-to-phenylindol (DAPI) til kontraflekk kjerner (sc-24941, Santa Cruz Biotechnology). Bilder ble tatt på et bredt felt mikroskop utstyrt med en AxioCam CCD-kamera (Zeiss Cell Observer, Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Tyskland).
Fluorescent assistert celle sortering (FACS)
Uttrykk for CD133 ble oppdaget av FACS (FACS Canto II, BD Biosciences, Heidelberg, Tyskland) ved hjelp fysoerytrin konjugert CD133 /2 (293C3) og CD133 /1 (AC133) antistoffer (Milteny Biotech, Bergisch Gladbach, Tyskland). Aktivitet av ALDH1 ble målt ved hjelp av Aldefluor underlaget +/- DEAB inhibitor (Stemcell Technologies, Grenoble, Frankrike). ALDH-lyse celler (ALDH
br) ble påvist i FITC kanal og kompensert mot fysoerytrin og vice versa ved hjelp av individuelt merkede celler som kontroller. Uttrykk for lett CD44 /CD24 /ESA ble testet ved hjelp av følgende antistoffer fra BD Biosciences: (. Cat 347 200) (. Cat 560 533) EpCAM (ESA) -APC, CD44-PE-Cy7, CD24-FITC (Cat 555 427.) . Inkubasjon av cellene med antistoffer og underlag, FcR blokkerer og vasketrinn ble gjort i henhold til produsentens instruksjoner.
Hele genomsekvense
Genomisk DNA fra cellelinjene JoPaca-en (passasje 8) og BxPC-tre ble hentet ved hjelp av standardprotokoller. Hele genomsekvensering og lese justering ble gjort ved hjelp av en Illumina HighSeq 2000 sequencer ved Centre National de Génotypage (Evry, Frankrike). Data over de beste 17 ikke-synonyme kodende gener mutert i bukspyttkjertelkreft ble innhentet fra Sanger Institute katalog av somatiske mutasjoner i kreft nettsiden (https://www.sanger.ac.uk/cosmic) [33]. I tillegg ble tre gener inkludert fra OMIM database under søkeordet «kreft i bukspyttkjertelen» (https://www.omim.org/entry/260350) [34]. Alle disse genene ble kontrollert for exonic ikke-synonyme mutasjoner i BxPC-3 og JoPaca-1 (tabell S2). Videre ble ikke-koding variasjoner forbundet med kreft i bukspyttkjertelen hentet fra genom vide assosiasjonsstudier (GWAS) (tabell S3). Opptellingen av mutert og villtype leser ble gjort for hånd ved hjelp av ensembl genomet leseren [35] og integrerende genom seer [36] teller hvert kartlagt lese.
Sanger-sekvensering av
KRAS
området rundt kodon 12 av
KRAS
ble forsterket fra cDNA generert fra cellelinjer ved standard PCR bruker Phusion polymerase (F-530, Fermentas, St. Leon-Rot, Tyskland) og følgende primere : KRAS-F (5′-CCC CGC CAT TTC GGA CTG GG-3 «) og KRAS-R (5′-ACT CCT CTT GAC CTG CTG TGT CG-3»). PCR-produktene ble sekvensert ved GATC (Constance, Tyskland) ved hjelp av primer KRAS-F.
Resultater
JoPaca-1 celler stammer fra dårlig differensiert ductal adenokarsinom i bukspyttkjertelen
for isolering av primær tumorceller, ble friskt vev erholdt fra en 46 år gammel mannlig pasient som lider av kreft i bukspyttkjertelen, som gjennomgikk en pylorus bevar pancreatecto-duodenectomy (pp-Whipple operasjon). Han døde fem måneder etter operasjonen. Histopatologisk undersøkelse av vev viste en dårlig differensiert duktalt adenokarsinom i bukspyttkjertelen, med tumor infiltrasjon i tolvfingertarmen, den intrapancreatic gallegang og peripancreatic bløtvev. Perinevral, lymphogenic og hematogenic tumorinfiltrasjon kan bli funnet, samt to lymfeknutemetastaser i 22 regionale lymfeknuter. TNM stadium var pT3, PN1 (2/22), G3. Klinisk, var det ingen forekomst av fjernt organmetastaser. Den primære cellelinje JoPaca-1 ble isolert fra resected kreftvev som beskrevet i detalj i metodedelen. Den resulterende befolkningen av rene kreftceller ble frosset etter fire vekst passasjer. For eksperimentene som er rapportert nedenfor, ble celler fra 6 til 19 passasjer benyttes. Cellene ble dyrket i standard cellekulturmedium IMDM supplert med 10% FCS og 1% PS.
Subkloner av JoPaca-en avsløre fenotypiske heterogenitet av foreldrebefolknings
Enkeltceller av JoPaca-en dyrket i fullstendig isolasjon ga opphav til kolonier som viste en varierende morfologi (fig. 1). Vanligvis kan to former for vekst observeres: nær kontakt øya dannelse og ingen kontakt spredning (figur 1B, C.). Cellular heterogenitet ble også reflektert av rekke ulike celleformer som ble observert. Rund og vesikulær celler skjedde som gjorde en spindel-lignende fenotype. I tillegg kan dannelsen av lange pseudopods sees (Fig. 1D-F). Begge deler, forskjellige vekstkarakteristikker og de forskjellige celleformer, kan også påvises i foreldre populasjonen (fig. 1A) som angir god representasjon av de isolerte kloner sub.
fasekontrastbilder presenteres av JoPaca-1 foreldrecellene og subkloner viser ulike vekstegenskaper og morfologi. A. JoPaca-en foreldrecellepopulasjon. B, C. To forskjellige vekstkarakteristikker kan observeres: nær-kontakt øy dannelse (B) og ikke-kontakt spredning (C). D-F. Tre forskjellige celleformer ble observert. Rund og vesikulært (D), spindel-lignende (E), og pseudo-pod dannende (F) celler
JoPaca-1 celler er tetra til pentaploid og genomisk ustabil
JoPaca-en ble arrestert i meta å studere Karyotype og kromosomavvik. Metafase sprer av 26 celler ble analysert. De viste en tetra til pentaploidic karyotype med fem vanlige observerte kromosomavvik (fig. 2). Disse er de trans t (17; 5) (5; 17), t (7; 4), t (13; 12), og t (2; 9) og en inversjon av kromosom 13 (I13). I alt ble 47 ulike avvik observert i de 26 karyograms. Men for de relativt hyppige avvik fra ovennevnte, de fleste (38) ble kun observert én gang. Tre andre trans ble funnet to eller tre ganger (tabell S1). Y-kromosom ble borte i 20 av 26 karyograms.
En representant karyogram av JoPaca-1 er vist her. JoPaca-en er en tetra til penta-ploidic cellelinje. Under oversiktsbildet, er de fem mest observerte avvik i 26 karyograms presentert. Trans kunne identifiseres ved hybridisering av forskjellig fargede sonder som resulterer i to-farget kromosomer. Inversjon av kromosom 13 (I13) er fusjon av to q-armer på kinetochore. Y-kromosomet er ofte tapt i tumorceller som det er i denne representasjonen.
JoPaca-1 viser økt motstand mot gemcitabin løpet BxPC-3
JoPaca-1 celler ble sammenlignet til BxPC-3 i sitt svar til gemcitabin, standard førstelinje kjemoterapeutisk behandling av bukspyttkjertelkreft. I fravær av medikamentet, doblingstiden var 28 timer for JoPaca-1 og 19 timer for BxPC-3. Under en 72 h vekstperiode, tilsvarer dette 3,79 celledelinger av BxPC-3 og 2.57 av JoPaca-en. For å kunne dele 3,79 ganger, ville JoPaca-1 krever 106 timer. Følgelig en langvarig inkubasjon med gemcitabin hadde en sterkere effekt på cellelevedyktigheten til JoPaca-1 (fig. 3A). Sammenlignet med BxPC-3, JoPaca-1 viste en vesentlig høyere toleranse for gemcitabin med en IC
50 av 28 nM sammenlignet med 11 nM for BxPC-3, selv etter at halvparten av cellepopulasjonen gjennomgikk en ytterligere runde med mitose (3.79+ 0,49 = 4,28 celledel = 120 h) (fig. 3b). Derfor er økt motstand av JoPaca-1 er uavhengig av frekvensen av proliferasjon.
BxPC-3 og JoPaca-1-celler vi behandlet med økende konsentrasjoner av gemcitabin i 72, 96 og 120 timer. Cellelevedyktigheten ble normalisert til de ikke-behandlede kontroller. Datapunkter representerer gjennomsnitt resultatene av seks replikere eksperimenter med standardavvik angitt med feilfelt. A. Øke inkubasjonstid med gemcitabin resulterer i økt cytotoksisitet for JoPaca-en. B. Celleviabilitet ble sammenlignet mellom 3.79 og 4.28 celledelinger for BxPC-3 og JoPaca-1, henholdsvis. JoPaca-en viser en høyere toleranse overfor gemcitabin enn BxPC-3 selv etter lang inkubasjonstid på 0,49 celledelinger.
JoPaca-1 celler er svært tumorigent og har økt klonogene potensial
Å etablere klonogene potensialet av JoPaca-1, ble cellene i passasje 10 telles og sådd ut i et 1 til 1 fortynningsserie i to 96-brønners plater som starter fra 125 celler per brønn ned til fire celler per brønn. Hver fortynning ble gjort 16 ganger. Etter 15 dagers inkubering, ble brønner inneholdende forskjellige kolonier telles. Matematisk analyse av kolonitellinger ved bruk av «Extreme LDA» algoritmen [32] har vist at en celle i 48 (ca. 2%) var i stand til å danne en koloni (Fig. 4A). Dette klonogene potensialet er ti ganger høyere enn for den etablerte cellelinje CAPAN-1 med 0,2% [19].
klonogene potensial og tumourgenicity av JoPaca-1 ble bestemt ved begrensende fortynning assays
in vitro
og
in vivo
. A. Fortynning av celler i en 96-brønns plate og telling av koloni-inneholdende celler etter 10 dager føre til en potensiell klonogene av en celle i 48 beregnet ved ELDA [32]. B. ortotopiske injeksjon av 10.000, 1.000 og 100 JoPaca-1 celler i 6 NOD.Cg-
Prkdc
SCID Il2rg
tm1Wjl
mus resulterte i dannelsen av svulster som ble skåret ut, veid og fotografert. Gjennomsnittlig tumormasser vises.
For å etablere tumourgenicity av JoPaca-en
in vivo
, tre grupper på seks immun kompromittert NOD.Cg-
Prkdc
SCID Il2rg
tm1Wjl
mus ble injisert orthotopically med 10
4, 10
3 og 10
2 celler, henholdsvis. Etter 100 dager, alle musene fortsatt var i live. I alt hadde 11 mus dannet tumorer: 6/6 for dyrene med 10
4 celler, 4/6 med 10
3 celler og 1/6 med 10
2 celler (figur 4B.). Tumor-initiere frekvens ble beregnet ved ELDA algoritmen ved en celle i 831 med en nedre og øvre grense av en i 2114 og en i 327, henholdsvis. Tumorene ble skåret ut og veiet. Den tumorvekt korrelerer direkte med antallet av injiserte celler. Med 10
4 celler, gjennomsnittlig tumorvekt var 927 mg; induksjon med 10
3 celler ga opphav til svulster i 618 mg i gjennomsnitt. Singelen svulst som følge av 10
2 celler hadde 300 mg.
JoPaca-1 celler invadere omkringliggende normalt vev og viser metastasizing potensial in vivo
Den primære svulsten hadde invadert glatt muskelvev av den proksimale tolvfingertarmen (fig. 5A). Xenografttumorer ble ikke kapslet; dessuten de avslørte en invasiv front med områder av infiltrerende tumor ekspansjon inn i tilstøtende normal bukspyttkjertelen vev (Fig. 5B) metastaser kunne observeres i ett av tre mus under innledende forsøk, men ble ikke analysert videre (Fig. 5C).
her vises H E flekker av primær (A) og vevssnitt xenograft (B). A. Glatt muskelvevet i tolvfingertarmen ble infiltrert av tumorceller av den primære tumor. B. Invasive foran xenografttumorer med områder av infiltrerende tumor ekspansjon inn i tilstøtende normalt bukspyttkjertelen vev (pil hoder). C. En av tre NSG mus utviklet metastaser under innledende forsøk når 1 Mio celler ble injisert orthotopically (piler).
Primære og xenografttumorer hevet fra JoPaca-en har veldig lik histologi
Histopathologically, de xenografttumorer viser en høy grad av likhet til den primære svulsten. Cellular morfologi og vekst mønstre ble samlet dårlig differensiert preget av enkel mobil eller solid vekst. Men deler av micropapillary vekst mønstre og ductular formasjoner ble funnet i både primær- og xenograft vev (Fig. 6A). I tillegg ble vandrings og invasive oppførsel observert til en tilsvarende grad. Primære og xenograft vev viste perinevral infiltrasjon og invasjon i lymfoide og blodkar (fig 6B, CII og 11C.)
Her vises H . E flekker av primære og xenografttumorer. A. Primær og xenografttumorer viser lignende differensiering fenotyper som spenner fra generell dårlig differensiering (-) over micropapillary vekst (x) til mer differensierte ductular formasjoner (*). B. Perineuronal invasjon kan observeres i både primær- og xenografttumorer (pil hoder). C. Vist her er områder av tumor nekrose, avgrenset av nøytrofile granulocytter (C i, stjernetegn) og tumor infiltrasjon av lymfekar (C ii, pil hodet). D. Fordeling av stroma (S) i grunnskolen og xenograft tumor vev. Tumor cellene i begge prøvene er innebygd i desmoplastic tumor stroma. Mens stroma i den primære tumor er dispergert gjennom hele tumoren, er det mer lokalisert i xenograft.
funksjoner på grunn av de immunologiske egenskapene var naturligvis mer uttalt i den primære svulsten enn i det xenograft mus som NSG er ute av stand til å montere en medfødt eller adaptiv immunrespons. Disse immunologiske funksjoner inkluderer områder av tumor nekrose som ble avgrenset av nøytrofile granulocytter (Fig. 6Ci) samt infiltrere betennelsesceller, hovedsakelig lymfocytter og granulocytter. I den primære tumor, blir cellene innleiret i desmoplastic tumor stroma. Xenografttumorer er delvis ispedd stromal vev i tillegg. Her er disse områdene lokalisert og ikke like allestedsnærværende som i primærtumor (Fig. 6D).
JoPaca-1 uttrykker cytokeratins og svulsten markør mesothelin
Immunohistochemistry av cytokeratins ble utført på primær og xenograft tumor vev skiver. Begge, grunnskoler og xenografttumorer farget positivt for pan-cytokeratin kloner AE1 og AE3. Ekspresjon av cytokeratins i det primære tumor var litt mer spredt enn i xenotransplantater, hvor det tydelig farget epitelceller langs den luminale side av kanalene. Nærmere bestemt ekspresjon av cytokeratin 19 var enda mer karakteristisk ductal i begge vev. Isotype kontroller var negative (Fig. 7). Immunfluorescens bekrefter uttrykk for cytokeratin 19 i isolerte JoPaca-1 celler. Cytokeratin 19 er en mellomliggende filamentprotein og ble uttrykt av JoPaca-1 ved økende foran en celle koloni (Fig. 8A). I tillegg JoPaca-en ble testet for ekspresjon av tumor-markør mesothelin. Den etablerte bukspyttkjertelkreft cellelinje BxPC-3, og den normale pankreatisk duktus cellelinje HPDE c7 ble anvendt som positive og negative kontroller, respektivt. Ekspresjon av mesothelin kunne påvises i JoPaca-1 og BxPC-3-celler, men ikke i normal pankreas kanalsystem celler HPDE c7. Isotype-kontroller var negative (Fig. 8B).
Immunohistokjemi ble utført på primære og xenograft tumor skiver. Cytokeratins AE1 /AE3 og mer spesifikt cytokeratin 19 ble uttrykt i duktale strukturer av primære og xenografttumorer (brun). Isotype kontroller var negative.
Fase kontrast presenteres som viser mesothelin og cytokeratin 19 som oppdages i fast JoPaca-en, BxPC-3 og HPDE C7 celler. Begge proteinene ble merket med primær og FITC-konjugert sekundært antistoff (grønn). Kjerner ble farget med DAPI (blå). Isotype kontroller var negative. A. Cytokeratin 19 er uttrykt i økende foran JoPaca-1 celler. B. JoPaca-en og den etablerte cellelinje BxPC-3 uttrykker begge mesothelin mens den normale pankreatisk duktus cellelinje HPDE c7 ikke gjør det.
JoPaca-1-celler er sterkt anriket med hensyn til kreft stamcellemarkører
selv~~POS=TRUNC fornye kreft stamceller er antatt å være drivkraften bak tumorprogresjon og ansvarlig for resistens mot kjemoterapi.
