Abstract
Sink Finger (ZNF) 280B protein ble identifisert som en uventet mål for en shRNA designet for sGCα1. Videre analyser viste at disse to proteiner er forbundet på en annen måte, med 280B oppregulering av sGCα1 uttrykk. Knock-down og over-uttrykk eksperimenter viste at 280B serverer pro-vekst og pro-overlevelse funksjoner i prostatakreft. Overraskende er imidlertid disse pro-cancer funksjoner av 280B ikke medieres av sGCα1, som i seg selv har tilsvarende funksjoner i prostata cancer, men ved ned-regulert p53. P53-proteinet er et andre mål for 280B i prostata cancer, men i motsetning til sGCα1, er p53 nedregulert ved 280B. 280B induserer p53 kjernefysisk eksport, fører til påfølgende proteasomal degradering. Proteinet ansvarlig for p53 regulering av 280B er MDM2, E3 ubiquitin ligase som fremmer p53 degradering ved å fremkalle sitt atom eksport. Vi viser her at 280B opp-regulerer uttrykket av MDM2 i prostatakreftceller, og denne forskriften er via MDM2 promoter. For å demonstrere en
in vivo
relevans for denne interaksjonen, uttrykk studier viser at 280B protein nivåer er oppregulert i prostatakreft og disse nivåene tilsvarer reduserte nivåer av p53. Ved å øke uttrykket av MDM2 gir uncharacterized 280B protein en ny mekanisme for p53 undertrykkelse i prostatakreft
Citation. Gao S, Hsieh CL, Zhou J, Shemshedini L (2013) Sink Finger 280B Regulerer sGCα1 og p53 i prostata kreft celler. PLoS ONE 8 (11): e78766. doi: 10,1371 /journal.pone.0078766
Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Østerrike
mottatt: 14. august 2013, Godkjent: 23 september 2013; Publisert: 13.11.2013
Copyright: © 2013 Gao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) R01CA127873-01A1. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
p53 tumor suppressor har en sentral rolle i koordineringen av cellulære responser til ulike påkjenninger (inkludert DNA-skader, over-uttrykt onkogener og diverse metabolske begrensninger) [1]. Som svar på cellulære påkjenninger, er p53-ekspresjon induseres, og proteinet blir translokert til kjernen for å binde seg til DNA i en sekvens-spesifikk måte, for derved å aktivere eller undertrykke målgener [2]. Dermed kan p53 orkestrere biologiske utganger som apoptose, cellesyklus arrest, senescence, eller modulering av autofagi. Flere nedstrøms direkte mål er involvert i anti-proliferative funksjon av p53, inkludert pro-overlevelse
suvivin product: [3] og cellesyklusen inhibitor
p21 /CIP1 product: [4].
MDM2 (Mouse dobbel minutt 2 homolog) er den viktigste regulatoren av p53 [5]. Prinsipielt er MDM2 en E3 ligase som nedregulerer p53 gjennom atom eksport og ubiquitin-avhengige proteasomal degradering [6] – [9]. I tillegg, den histon-acetyl-transferase (HAT) proteiner p300 og CBP (CREB-bindende protein) stabilisere p53 ved acetylering, og dette stabiliseringseffekt kan bli opphevet ved MDM2 gjennom dannelse av et ternært kompleks med p53 og p300 eller CBP [10], [11]. Mutasjoner i p53 at det fører til tap-av-funksjon representerer den mest vanlige genetisk endring i humane cancere [12], [13]. Interessant er et fullstendig tap av p53 som bare finnes i prostatakreft [14]. Det ble senere bestemt at en kombinert tap av p53 og PTEN, en tumor suppressor involvert i PI3-AKT signale [15], var nok til å drive utvikling av invasiv prostatakreft [16]. En annen tumor suppressor, NKX3.1, ble vist å øke acetylering og stabiliteten av p53 via MDM2-avhengige mekanismer [17].
Løselig guanylylcyklase (SGC) er nitrogenoksid (NO) reseptoren, og er godt kjent for sin enzymatiske aktivitet for å omdanne guanosin 5′-trifosfat (GTP) til cyklisk guanosin 3 «, 5»-monofosfat (cGMP). Denne veien er stort sett involvert i hjerte og nervesystemet [18]. Vi har tidligere rapportert at α1 subenheten av SGC (sGCα1; gen navn
GUCY1A3
) er et direkte mål av androgen reseptor (AR) og spiller viktig rolle i å drive prostatacancer celleproliferasjon [19]. Vi har også bestemt at sGCα1 serverer en pro-overlevelse funksjon i prostata kreft ved å hemme p53 aktivitet og selektivt undertrykke gener som er involvert i apoptose, via en mekanisme for p53 cytoplasma binding [20]. Interessant nok har disse pro-cancer funksjoner av sGCα1 er uavhengig av SGC enzymaktivitet. Mer nylig ble det terapeutiske potensialet for målretting sGCα1 utviklet via et bindende peptid som har sterk anti-kreft-aktivitet [21].
Sink fingre (ZNF) er et felles DNA-bindingsmotiv funnet i flere transkripsjonsfaktorer, og C
2 H
2 motivet er den vanligste typen [22]. Dette motivet er karakterisert ved to cystein og to histidinrester koordinerende en eller flere av sinkioner og som rager inn i et fingerlignende struktur som interagerer med DNA [23]. Bevis fremstår som ZNF proteiner spiller viktige roller i kreft hos mennesker. For eksempel, ZNF23 hemmer tumorcellevekst gjennom forbedring av p27 /kip-1-ekspresjonen, og uttrykket nivåer av ZNF23 protein er sterkt redusert i human kreft [24]. I tykktarmskreft, ble ZKSCAN3 (ZNF306) uttrykk forhøyet og under uttrykk for ZKSCAN3 redusert tumorigenitet [25]. Videre er det flere rapporter viser at ZNF proteiner kan påvirke p53 aktivitet. ZNF668 ble identifisert som en tumor suppressor i brystkreft, som stabiliserer p53 ved å hindre MDM2-p53 medierte ubiquitinering og degradering [26]. ZNF307 undertrykker aktiviteten av p53 og p21 ved å øke transkripsjon av MDM2 og EP300 [22].
Mens han studerte funksjon sGCα1 hjelp RNAi, identifiserte vi Sink Finger 280B (ZNF280B, deretter kalt 280B) som et mål for en av de sGCα1 shRNAs. Den begrensede informasjonen som er tilgjengelig på 280B og mulig sammenheng med ZNF proteiner med p53 oppmuntret oss til å ytterligere analysere 280B for en potensiell rolle i prostatakreft. I denne studien viser vi et funksjonelt samspill mellom 280B, p53, og MDM2. Over-uttrykk for 280B betydelig redusert p53 nivåer ved å redusere sin stabilitet. Denne effekt på p53 stabilitet medieres ved evnen til 280B til å indusere ekspresjon av MDM2, gjennom en positiv effekt på MDM2-promoteren. Ved å undertrykke p53, gir 280B pro-overlevelse og pro-vekstfunksjoner i prostatakreft. Til støtte for dette, er høy uttrykk for 280B assosiert med lave p53 nivåer i prostata tumorvev.
Materialer og metoder
Cell kultur og siRNA transfeksjon
LNCaP, C81 og CWR-22Rv1-celler ble dyrket som tidligere beskrevet [20]. Normale prostata epitelceller (PREC) ble dyrket i PrEGM som anbefalt av leverandør (Lonza). Egge kontroll siRNA, sGCα1 siRNA, MDM2 siRNA (GAACAAGAGACCCUGGUUA) og ZNF280B siRNA (GGAACAAUCAUGUGAGGAA) (Dharmacon) ved 40 nM endelig konsentrasjon ble transfektert inn i cellene ved hjelp Lipofectamine Simax (Invitrogen).
Reporter-analysen og Plasmid Transfeksjon
C81-celler ble dyrket til 80-90% konfluens i RPMI-1640 med 5% FBS. Etter 24 timer ble mediet erstattet med serumfritt medium, og cellene ble transient transfektert med p53-Luc reporter plasmid eller MDM2-Luc reporter plasmid, og kontrollere siRNA eller siRNA mot ZNF280B og p53. Den pCH110 plasmid som koder for b-galaktosidase ble brukt til å overvåke transfeksjonseffektivitet [27]. P53-Luc plasmid ble vennlig levert av Dr. Andrei Gudkov og inneholder tre p53-responsive elementer. Den MDM2-Luc og MDM2 uttrykk plasmid ble vennlig levert av Dr. Jason M. Shohet. Transfeksjon ble utført ved hjelp av Lipofectamine 2000 og luciferaseaktivitet ble målt ved anvendelse av luciferase-analysesystem fra Promega.
Adenovirus og lentivirus-infeksjoner
C81-celler ble infisert med 5-50 MOI på enten en adenovirus som uttrykker ZNF280B (ABMGood)) eller en tom adenovirus som en kontroll. Etter 48 timer ble cellene utsatt for RT-PCR og Western blotting.
sGCα1 shRNA, tom shRNA, og pakke vektorer ble kjøpt fra Åpne Biosystems. De lentiviral partikler ble fremstilt ved å følge selskapets protokoll. LNCaP-celler ble infisert med lentivirus og valgt ved hjelp av puromycin i en konsentrasjon på 4 mg /ml. Etter 4 dager med seleksjon ble cellene utsatt for MTT-assay, QRT-PCR, Western blotting.
Immunhistokjemi
Immunhistokjemi ble anvendt for å sammenligne nivået av ZNF280B i normal prostata-vev og tumorvev innhentet fra CHTN. ZNF280B antistoff (1:200 fortynning, Sigma) ble anvendt for immunohistochemisty som tidligere beskrevet [27]
proliferasjonsanalyser
Etter siRNA transfeksjon i 3 dager, 20.000 celler fra hver tilstand ble sådd ut igjen. 24-brønners plater. MTT-assayet (Sigma) ble anvendt som før [21] for å bestemme celleantallet.
Western blotting og Cellefraksjone
Western blotting ble utført som beskrevet [19] ved hjelp av primære antistoffer mot sGCα1 ( Cayman Chemical), ZNF280B (Abgent), MDM2 (Santa Cruz), survivin (Cell Signaling Technology), p21 (Cell Signaling Technology), p53 (Santa Cruz), β-Tubulin (Abcam), RARα (Santa Cruz), β- Actin (Abcam).
C81 celler behandlet med siRNA og adenovirus ble høstet og vasket en gang med kald PBS. 10% av cellene ble lagret som inndata og den gjenværende del ble oppdelt i nukleære og cytosoliske fraksjoner ved hjelp av Kjerne /Cytotsol Fraksjone Kit (MBL International). Fraksjonene ble deretter underkastet Western blotting for å måle ZNF280B og p53-proteinnivåer.
semikvantitativ RT-PCR og QRT-PCR
Total mRNA ble isolert ved anvendelse av Trizol reagens følgende protokoll fra fremstilling ( Invitrogen), og utsatt for semikvantitativ RT-PCR og QRT- PCR-analyser som beskrevet [28]. PCR-oppstrøms- og nedstrømsprimerne anvendt for hvert gen var:
Survivin
, 5′-GGACCACCGCATCTCTACAT-3 «og 5′-GACAGAAAGGAAAGCGCAAC-3»;
p53
, 5′-GGCCCACT TCACCGTACTAA-3 «og 5′-G TGGTTTCAAGGCCAGATGT-3»;
sGCα en
, 5′-AGCAGTGTGGAGAGCTGGAT-3; og 5′-CTGATCCAGAGTGCAGTCCA-3 «;
p21
, 5′-GACACCACTGGAGGGTG ACT-3 «og 5»-CAGGTCCACATGGTCTTCCT;
GAPDH
, 5′-CGACCACTT TGTCAAGCTCA-3 «og 5′-AGGGGAGATTCAGTGTGGTG-3».
MDM2
, 5′-TTTCGCAGCCAGGAGCACCG-3 «og 5′-AGTTTCCTTCACGGGGCGCG-3»;
ZNF280B
, 5′-TCCCAAAAGGGCTAAACTCA-3 «og 5’GTCCTTTGGAAAAGC- TGCTG-3».
Resultater
En sGCα1 siRNA er rettet mot 280B i prostatakreftceller
for å studere rollen til endogent sGCα1 i prostatakreftceller, brukte vi shRNA til knockdown dette genet i LNCaP celler. Blant fem forskjellige shRNAs, to var mest effektive i nedregulere sGCα1 protein uttrykk: shRNA7 og shRNA8 (data ikke vist). Disse shRNAs ble brukt for videre studier. Som vist på fig. 1, shRNA8 var mer effektiv enn shRNA7 ved avtagende begge nivåene av sGCα1 mRNA og protein (figur 1B). (Fig 1A.); Lignende resultater ble observert med siRNA7 og siRNA8 (fig. S1B, C). Interessant er imidlertid shRNA7 (og siRNA7) var betydelig sterkere enn shRNA8 (og siRNA8) ved å blokkere proliferasjon av LNCaP-celler (fig. 1C og S1C fig.). Dette overraskende resultat førte oss til å vurdere muligheten for off-target effekter av enten eller begge shRNAs. En Blast søk avdekket at 17 av 21 nukleotider av siRNA7 passet perfekt med en del av 280B genet (fig 1D.); en betydelig del av siRNA8 matchet HIF1A genet (data ikke vist). shRNA7 og siRNA7 var i stand til å betydelig ned-regulere 280B både på nivået av mRNA (fig. 1E) og protein (fig. 1F), mens shRNA8 /siRNA8 hadde ingen effekt, i LNCaP-celler og de to hormonuavhengige cellelinjer C81 og CWR-22Rv1; interessant, verken shRNA8 eller shRNA7 påvirket HIF1A uttrykk (data ikke vist). I lys av disse data, en hypotese vi at jo høyere negativ effekt på cellevekst av shRNA7 /siRNA7, sammenlignet med shRNA8 /siRNA8, er på grunn av den ekstra effekt av shRNA7 /siRNA7 på 280B. For å teste denne hypotesen, brukte vi en 280B-spesifikke siRNA, som interessant nok har en betydelig negativ effekt på LNCaP celleproliferasjon (Fig. 1 H). Hypotesen ble direkte testet ved å utføre en dobbel knockdown av sGCα1 hjelp av siRNA8 og 280B-spesifikke siRNA (fig. 1G), som blokkerte celleformering sterkere enn både siRNA8 eller 280B siRNA alene og nesten i samme grad som siRNA7 ( fig. 1 H). Disse dataene sterkt at 280B serverer en pro-vekst funksjon i prostatakreftceller.
(A, B, C) LNCaP celler ble infisert med tom lentivirus eller lentiviruses uttrykker en av to forskjellige sGCα1 shRNAs (7, 8 ) og sGCα1-ekspresjon ble målt ved hjelp av sanntids-PCR (A) eller Western blotting (B), og celletettheten ble målt ved MTT-analyse (C). (D) Diagrammet viser nucleotide homologi mellom siRNA 7 og 280B. (E, F) LNCaP, C81, og CWR22-RV1-celler ble utsatt for de samme infeksjoner og 280b nivåene ble målt ved hjelp av sanntids-PCR (E) eller Western blotting (F). (G, H) C81-celler ble transfektert med kontroll (Ctrl), sGCα1 siRNA (7,8), 280B siRNA, og 280B samt sGCα1 siRNA 8, og sGCα1 nivåene ble målt ved Western blotting (G), og celletettheten var måle ved MTT-assay (H). Alle uttrykk nivåer står i forhold til den første betingelsen (A, D), og det ble satt til 1. β-actin fungerte som en lasting kontroll i de vestlige blotter. Søylediagrammer representerer gjennomsnitt av tre uavhengige forsøk pluss SD. Stjerner indikerer statistisk signifikans (P 0,01).
280B opp-regulerer sGCα1 mRNA og protein i prostata kreft celler
For å studere rollen til 280B i prostatakreftceller, brukte vi den 280B-spesifikke siRNA (fra fig. 1G). Den 280B siRNA var i stand til å ned-regulere, som forventet, 280B mRNA og protein (Fig. 2A) og, overraskende, sGCα1 ekspresjon (Fig. 2A). En Blast søk på 280B siRNA-sekvensen identifisert bare den 280B-genet som et direkte mål og viste tydelig at sGCα1 ikke har noe sekvenslikhet med den 280B siRNA-sekvensen. Disse data tyder på at sGCα1 mRNA og protein er et mål for den 280B protein, ikke siRNA.
(A, B) LNCaP-celler ble transfektert med kontroll eller 280B siRNA og sGCα1 nivåene ble målt ved hjelp av sanntids- PCR eller Western blotting (A), og celletettheten ble målt ved MTT-assay (B); fase kontrast bildene ble tatt på dag 6 (B). (C, D) LNCaP-celler ble infisert med tom eller sGCα1 adenovirus etter transfeksjon med kontroll (-) eller 280B siRNA (+), og sGCα1 nivåene ble målt ved Western blotting (C), og celletettheten ble mål ved MTT-assay (D ). Alle ekspresjonsnivåer står i forhold til den første betingelse (A), og den ble satt til 1. β-actin tjente som en kontroll lasting i Western blot. Søylediagrammer representerer gjennomsnitt av tre uavhengige forsøk pluss SD. Stjerner indikerer statistisk signifikans (P 0,01).
For å finne ut om nedregulert sGCα1 er ansvarlig for redusert celledeling følge 280B knockdown, vi gjentok transfeksjon med 280B siRNA, som så før (se fig. 1 H) resulterte i en markert nedbremsing i LNCaP-cellevekst (fig. 2B). Faktisk cellene behandlet med 280B siRNA endret sin morfologi og begynte å dø (Fig. 2B). For å bestemme om sGCα1 over-ekspresjon kan redde cellene, ble siRNA-transfekterte celler infisert med sGCα1 adenovirus, noe som resulterer i gjenopprettede sGCα1 proteinnivåer (Fig. 2C). Over-uttrykk for sGCα1 ikke klarte å redde celler (fig. 2D), noe som indikerer at sGCα1 er enten ikke kan eller ikke er tilstrekkelig til å redde prostata kreft celler med redusert 280B uttrykk og dermed antyder at en annen 280B målet er involvert.
280B nedregulerer p53 protein i prostatakreftceller
Siden vår tidligere arbeid viste at sGCα1 hemmer p53 aktivitet i prostata kreft [20] og annet arbeid har indikert at ZNF proteiner kan påvirke p53 signalveien [29] ønsket vi å finne ut om 280B påvirker p53. Interessant, siRNA knock-down av 280B ført til økt p53 protein nivåer i LNCaP, C81 og CWR-22RV1 celler (fig. 3A). I motsetning til dette adenovirus-mediert over-ekspresjon av 280B markert redusert p53-proteinnivåer (Fig. 3B). Effekten ble bare observert på p53-protein, ettersom p53 mRNA-nivåer ble ikke påvirket av 280B (fig. 3C, D). Til sammen viser disse data at 280B regulerer negativt p53 bare på proteinnivået, og er derfor forskjellig fra dens effekt på sGCα1, noe som er positivt og observert både på mRNA og proteinnivåene.
(A, C) LNCaP , C81, CWR22-RV1-celler ble transfektert med kontroll (-) eller 280B siRNA (+) og p53, survivin, p21, og 280B uttrykk nivåer ble målt ved Western blotting (A) eller real-time PCR (C). (B, D) C81-celler ble infisert med tom (-) eller 280B adenovirus (+) og p53, Survivin, p21 og 280b uttrykk nivåer ble målt ved Western blotting (B) eller sanntids-PCR (D). Alle ekspresjonsnivåer står i forhold til den første tilstand (C og D), og den ble satt til 1. (E) C81-celler ble transfektert med 0,2 ug p53-Luc og kontroll (-), eller 280B (+) siRNA, i tilstedeværelsen av kontroll eller p53 siRNA. Transkripsjonen aktivitet av p53-aktivitet ble kvantifisert ved å måle luciferase-aktivitet. Alle aktiviteter står i forhold til den første tilstand, og denne aktivitet ble satt til 1. (F, G) Celler fra (E) ble underkastet Western blotting for p53, Survivin, P21, og 280B (F), og måling av celletetthet ved MTT-analysen (G). β-actin fungerte som en lasting kontroll i de vestlige blotter. Søylediagrammer representerer gjennomsnitt av tre uavhengige forsøk pluss SD. Stjerner indikerer statistisk signifikans (P 0,02).
Siden 280B endrer p53 protein nivåer, ville vi forvente at det skal påvirke p53 transkripsjonen aktivitet. Dette ble overvåket ved reporter gene assay eller ekspresjon av endogene p53-regulerte gener. Ved hjelp av et luciferase reporter plasmid inneholdende p53-responsive elementer [30], ble det observert en betydelig økning i p53-aktivitet i respons til 280B siRNA transfeksjon (fig. 3E). Transient transfeksjon av 280B ekspresjonsplasmid som skyldes en liten, men signifikant reduksjon i p53-aktivitet (Fig. S2). Å studere endogene gener, fokuserte vi på uttrykket av survivin og p21, siden 280B siRNA betydelig hemmet cellevekst (se Fig. 2B). Survivin er et p53-trykt gen som medierer celleoverlevelse og p21 er et p53-indusert gen som inhiberer cellesyklusprogresjon. Som svar på 280B uttømming ble Survivin protein redusert og p21 ble øket i alle tre cellelinjer (Fig. 3A). Real-time PCR data bekrefter at 280B påvirker survivin og p21 på mRNA-nivå (fig. 3C). I mellomtiden ble det observert de motsatte effekter når cellene ble behandlet med 280B over-ekspresjon, noe som gir økte Survivin og redusert p21-proteiner (Fig. 3B) og mRNA (fig. 3D).
Disse funnene antyder at 280B kan tjene en pro-overlevelsesfunksjonen i prostatakreft. For å teste denne hypotesen, overvåket vi apoptose ved å måle PARP cleavage. Både LnCap og CWR-22Rv1 celler viste forhøyede nivåer av spaltet PARP i respons til 280B knockdown (fig. S3). For å studere rollen til p53 i denne prosess, anvendes vi etoposid, noe som forventet, induserte høye nivåer av p53 og forhøyet PARP-spaltning (fig. 3F). Viktigere, ble disse effektene redusert eller borte når 280B var over-uttrykt (Fig. 3F), som klart 280B kan beskytte cellene mot Etoposide-indusert apoptose.
neste utforsket hvis p53 er involvert i veksthemming indusert av 280B siRNA. For å gjøre dette, brukte vi siRNA å redusere uttrykket av endogen p53 i C81-celler, som ble bekreftet av redusert reporter genaktivitet (Fig. 3E) og uttrykk for p53 regulerte proteiner (Fig. 3G). Betydelig, siRNA knockdown av p53 var i stand til nesten fullstendig redning cellevekst hemmet ved 280B siRNA uttømming (fig. 3 H), sterkt tyder på at p53 forhøyet er ansvarlig for cellevekst trykkes ved 280B knockdown.
280B destabiliserer p53 protein i prostatakreftceller med opptil regulerende MDM2
dataene ovenfor viser at 280B hemmer p53 transkripsjonen aktivitet og reduserer p53 protein nivå uten å endre sin mRNA nivå tyder på at 280B er rettet mot p53 protein. For å bestemme om 280B kan påvirke p53-proteinstabilitet, anvendte vi cykloheksimid (CHX) for å måle p53 halveringstid. Under-ekspresjon av 280B ved spesifikk siRNA fører til en økning i p53 halveringstid fra 14 min til 24 min (fig. 4A), mens overekspresjon av 280B minsket svakt halveringstid (Fig. 4B).
(A, B) C81-celler ble transfektert med kontroll siRNA eller 280B siRNA (A), eller infisert med tom adenovirus eller 280B adenovirus (B) i 48 timer og deretter behandlet med 100 mg /ml cykloheksimid (CHX) for den indikerte ganger, hvoretter Western blotting ble anvendt for å måle p53-nivåer. Venstre paneler representerer kvantifisert Western blot. (C, D) C81-celler ble transfektert med 280B siRNA eller infisert med adenovirus 280b og underkastet celle-fraksjonering, fulgt av Western blotting for å måle den cytosoliske (C) eller nukleær (N) nivåer av p53 og 280B. Merk at tallene over banene representerer relative nivåer av p53 protein, standardisert for beta-aktin nivåer, med den første kjørefelt satt til 1. (E) C81 celler ble infisert med tomt adenovirus eller 280B adenovirus i 48 timer og deretter behandlet med 10 mM Nutlin-3A eller kjøretøy, etterfulgt av Western blotting for å måle den cytosoliske (C) eller kjernefysiske (N) nivåer av p53 og 280B. For alle eksperimentene, β-actin tjente som en kontroll lasting. β-tubulin og RAR, brukes som markører for cytosoliske og kjernefysiske fraksjoner, henholdsvis (C, D, E).
For å bedre forstå 280B effekt på p53 protein stabilitet, overvåket vi p53 subcellulære lokalisering. Legg merke til at Western blotting for β-tubulin (cytosolisk) og RARα (atom) bekreftet renheten av de to cellefraksjoner og at 280B er hovedsakelig eller utelukkende et kjerneprotein (fig. 4C). Redusere endogene 280B proteinnivåer resulterte i betydelig forhøyet atom p53 men ingen endring i cytosoliske nivåer (fig. 4C). Den komplementære eksperiment, over-ekspresjon av 280B, redusert atom p53 uten igjen å endre cytosoliske nivåer (Fig. 4D). Disse resultatene tyder på at 280B fremmer p53 proteasomal degradering ved å indusere p53 kjernefysisk eksport. For å oppnå bevis for dette, ble p53 subcellulære lokalisering overvåkes i nærvær av Nutlin 3A, en inhibitor av MDM2 interaksjon med p53 og således atom eksport [31]. Som vist på fig. 4E, Nutlin-3A nesten fullstendig eliminert 280B-formidlet reduksjon i kjerne p53-nivåer, et resultat i samsvar med et 280B rolle i p53 kjerne eksport.
Nuclear eksport av p53 er avhengig av MDM2, noe som er et viktig trinn som fører til p53 proteasomal degradering [6], [7]. Vi bekreftet denne effekten i prostatakreftceller, der MDM2 siRNA indusert høyere nivåer av atom p53 mens forbigående over-uttrykk for MDM2 redusert disse nivåene (Fig. S4), etterligne 280 effekt på p53. Siden ZNF proteiner har evnen til å regulere transkripsjon, en hypotese om at vi 280B kan påvirke p53 ved å regulere ekspresjon av MDM2. Vi begynte å undersøke denne muligheten ved å måle ekspresjonen av MDM2, som er betydelig redusert ved både mRNA og proteinnivåene når 280B er tømt (fig. 5A). I kontrast, 280B over-uttrykk har motsatt effekt, noe som resulterer i markert økning i både
MDM2
mRNA og protein uttrykk (Fig. 5B). Siden
MDM2
mRNA påvirkes av 280B, er det mulig at effekten er transkripsjonen. For å teste denne muligheten, analyserte vi en potensiell 280B aktivitet på
MDM2
arrangøren, ved hjelp av en luciferasereportergenet analysen. Transient ekspresjon av 280B i C81-celler økte
MDM2
promoter-aktivitet på en doseavhengig måte (fig. 5C) og siRNA uttømming av 280B blokkert
MDM2
promoter-aktivitet (fig. 5D). Disse funnene viser tydelig at 280B virker på
MDM2
promoter og foreslår at arrangøren kan være en direkte mål for 280B.
(A, B, E) C81 celler ble transfektert med (A , E) kontroll siRNA (-) eller 280B siRNA (+) eller (B, E) infisert med Empty adenovirus (-) og 280B adenovirus (+) og utsatt for real-time RT-PCR og Western blotting for å måle uttrykket av MDM2 og 280B. (C, D) C81cells ble transfektert med 0,1 ug MDM2-Luc og ko-transfektert med (C) Kontroll siRNA (-) og 280B siRNA (+), (D) Empty pCIneo (-) og 0,2 ug og 0,4 ug 280B, og overvåkes for 280B aktivitet ved å måle luciferase aktivitet. (E) C81cells ble ko-transfektert med tom pCIneo (-) eller MDM2 (+) og styrer siRNA (-) eller MDM2 siRNA (+), etterfulgt av Western blotting for å måle den cytosoliske (C) eller nukleær (N) nivåer p53, 280B, og MDM2. For alle eksperimentene, β-actin tjente som en kontroll lasting. p-tubulin og rara ble anvendt som markører for cytosoliske og atomfraksjoner, henholdsvis (E). Alle p53 protein nivåene var i forhold til den første betingelsen, og det ble satt til 1. Stjernene * og ** indikerer statistisk betydninger av P 0,05 og P . 0,01, henholdsvis
For å begynne å studere involvering av MDM2 i 280B-mediert atom eksport av p53 ble MDM2 uttrykk endres i C81 celler for å finne ut om dette vil påvirke 280B aktivitet på p53 subcellulære lokalisering. Faktisk var dette tilfelle, som over-ekspresjon av MDM2 betydelig redusert atom akkumulering av p53 som ble utløst av 280B knockdown (fig. 5E). I den komplementære eksperiment, MDM2 knockdown eliminert den negative aktiviteten som 280B over-uttrykk har på atom p53 nivåer (Fig. 5E). Samlet utgjør disse dataene sterkt at den 280B effekt på p53 er formidlet via 280B regulering av MDM2 uttrykk. Merk at MDM2 er primært cytoplasma i prostatakreftceller.
280B er over-uttrykt i prostatakreft og korrelerer med redusert p53 protein
For å etablere betydningen av 280B i prostata kreft, må vi først undersøkte ekspresjonen av 280B i et panel av prostatakreftcellelinjer og en normal cellelinje. RT-PCR-resultater viste 280B mRNA-nivåene var 6-7 ganger høyere i kreftceller enn normale prostata epitelceller (Prec) (Fig. 6A). Western blotting viste samme resultat, med betydelige protein nivåer i prostata kreftceller og ikke noe påvisbart i Prec celler (Fig. 6A). For å utvide våre observasjoner til klinisk setting, utførte vi immunhistokjemi på kamp-paret vev fra 4 pasienter. Pasienter 2 og 4 viste sterkere 280B immunoreaktivitets enn normalt vev (Fig. 6B), som viser at 280B uttrykk er forhøyet i noen prostata kreftsvulster. Som ville være forventet for en transkripsjonsfaktor blir 280B uttrykt utelukkende i cellekjernene for alle tumorer (fig. 6B). Vevet Studien ble utvidet til å omfatte flere vev og for å søke etter en mulig sammenheng mellom 280B og p53 uttrykk. Som vist på fig. 6C, blir 280B protein uttrykt i 6 av 10 prostatakreft, mens i bare en av tre av normal prostata. Interessant er p53-protein uttrykt høyest i de tumorer (# 1 og # 7) som ikke uttrykker påvisbare nivåer av 280B, og det laveste nivået p53 er funnet i svulsten med høyest 280B uttrykk. Disse dataene viser en invers sammenheng i uttrykket av 280B og p53 i prostatakreft og dermed er i samsvar med en viktig rolle for 280B som en negativ regulator av p53 i prostata kreft.
(A) Real-time PCR og Western blotting ble anvendt for å detektere ekspresjon av 280B i normal prostata (Prec) og prostata cancer-cellelinjer (LNCaP, C81, og CWR-22Rv1). (B) Immuno-farging av 280B i 4 matchet par av prostata vev, normal versus tumor. (C) celleekstrakt fra 4 normal prostata vev og tumorvev 9 ble underkastet Western blotting til å detektere 280B, p53 og MDM2 ekspresjonsnivåene. β-actin fungert som en lasting kontroll.
Diskusjoner
Før denne studien, 280B var en uncharacterized protein, med den eneste tilgjengelige informasjonen beskriver sitt forhold til stor familie av sink finger transkripsjonsfaktorer [32]. I denne studien har vi identifisert to mål av 280B, sGCα1 og p53, som begge har betydelige funksjoner i prostatakreft. Den første, sGCα1, har et godt karakterisert rolle i NO signalering og en mindre kjente rolle i prostata cancer progresjon. Med hensyn til den sistnevnte rolle, har våre tidligere data viser at sGCα1 er en viktig formidler av androgen støtte av prostatacancer celleproliferasjon [33] og en repressor av p53 som gir prostatakreftceller en pro-overlevelse funksjons [20]. Våre funn at 280B forsterker uttrykket av sGCα1 er konsistent med 280B ha pro-kreft funksjoner som er tydelig angitt med sin høye uttrykk i prostatakreft og dens pro-proliferativ funksjon i prostatakreftceller. Interessant nok var den positive effekten av 280B observert både på sGCα1 mRNA og protein, noe som tyder på at mRNA, og kanskje den sGCα1 promoteren, kan være mål for 280B. Ved hjelp av en 1-kb strekning av sGCα1 promoter som virker AR [33], ble det observert ingen 280B aktivitet (data ikke vist). Dette kan skyldes enten 280B effekt på sGCα1 er utenfor vår 1-kb region, eller er post-transcriptional, noe som vil bli studert i fremtiden. Det er bemerkelsesverdig at 280B deler en begrenset felles DNA-sekvens med sGCα1, sekvensen som er målrettet av siRNA7, som førte oss til å identifisere 280B. I lys av disse data, er det interessant å vurdere muligheten for en felles endogen miRNA eller siRNA som fungerer på både sGCα1 og 280B. Dersom det foreligger en slik forskrifts RNA, ville dette RNA forventes å bli nedregulert i prostatakreft siden både sGCα1 og 280B er over-uttrykt i denne sykdommen. Identifisering av en slik spesifikk RNA er en viktig fremtidig mål av lab.
Til tross for den positive regulering av 280B fra sGCα1, over-uttrykk for sGCα1 raskende klarte å redde celler hemmes av 280B utarming, noe som tyder på et annet mål for 280B . Vårt søk førte til p53. I motsetning til sGCα1, er p53 negativt reguleres av 280B, og denne regulering er rettet mot p53-protein. Under-uttrykk av p53 er i stand til å nesten utelukkende rednings celler hemmes av redusert 280B uttrykk. Derfor, i sammenheng med avtagende 280B uttrykk i prostatakreftceller, noe som resulterte i reduserte nivåer av sGCα1 og økt p53, økningen i p53 var utelukkende eller hovedsakelig ansvarlig for den reduserte cellevekst og sannsynligvis den forbedrede apoptose.
