Abstract
Den potensielle anvendelse av multiplekset quantum dot merking (MQDL) for diagnose av kreft og prognose og overvåking behandlingstiltak har tiltrukket seg interesse bioingeniører, patologer og kreft biologer. Mange publiserte studier hevder at MQDL er effektive for kreft biomarkør oppdagelse og nyttig i kreft diagnose og prognose, har disse studiene ikke er standardisert mot kvantitative biokjemiske og molekylær bestemmelser. I denne studien brukte vi en molekylært preget human prostatakreft cellemodell stiller aktivert c-Met signalering med epitelial til mesenchymale overgang (EMT) og dødelig metastatisk progresjon til bein og bløtvev som gullstandarden, og sammenlignet den c-Met celle signaleringsnett i denne modellen, i kliniske humane prostatakreft vevsprøver og i et kastreringsresistent human prostatakreft xenograft modell. Vi observerte c-Met signale nettverk aktivering, manifestert ved økt fosforylert c-Met i alle tre. Nedstrøms overlevelse signale nettverket ble formidlet av NF-kB og Mcl-en og EMT ble drevet av reseptor aktivator av NF-kB ligand (RANKL), på celle nivå i kliniske prostatakreft prøver og xenograft modell. Resultatene ble bekreftet ved sanntids RT-PCR og Western blot i en human prostata kreftcelle modell. MQDL er et kraftig verktøy for å vurdere biomarkør uttrykk, og det gir molekylære innsikt i kreft progresjon på både celler og vev nivå med høy grad av følsomhet
Citation. Hu P, Chu GC-Y, Zhu G, Yang H, Luthringer D, Prins G, et al. (2011) multiplekset Quantum Dot Merking av Aktivert c-Met signalering i Kastrering-Resistant Menneskelig prostatakreft. PLoS ONE 6 (12): e28670. doi: 10,1371 /journal.pone.0028670
Redaktør: Dean G. Tang, The University of Texas M.D Anderson Cancer Center, USA
mottatt: 21 oktober 2011; Godkjent: 12 november 2011; Publisert: 21.12.2011
Copyright: © 2011 Hu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet er støttet av forskningsmidler 2PO1CA098912 og 1RO1CA122602 av National Institutes of Health /National Cancer Institute og Prostate Cancer Foundation Challenge Award (LWK Chung). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Halvleder leder~~POS=HEADCOMP kvanteprikker (QDS) fluorescerende nanopartikler har blitt anerkjent som en av de store nylige fremskritt for vår evne til å oppdage relevante biomarkører uttrykt av celler, vev og sera [1], [2], [3 ], [4], [5]. De unike optiske og elektroniske egenskaper av QDS inkludere deres smale og symmetriske emisjonsbånd, størrelse-og material avstembar lysemisjon, høyt overflate til volumforhold, fotostabilitet, signal lysstyrke og følsomhet, og samtidig eksitering av flere fluorescerende farger som gjør det mulig å detektere flere mål samtidig på celle-nivået [3], [6]. Quantum dot merking, QDL, er overlegne i forhold til konvensjonelle organiske fargestoffer for farging av celler og vev, spesielt siden den sistnevnte utbytte bred båndbredde med overlappende signal utslipp og er svært utsatt for fotobleking. Multiplexing biomarkører med forskjellige farger gir betydelige fordeler fremfor tradisjonelle organiske eller fluorescerende fargestoffer for påvisning og analyse av dynamiske endringer i proteiner og nukleinsyrer i celler eller vev under pathophysiologic forhold. QDL har vært brukt med hell for å detektere nivået av ekspresjon av gener
in situ
forbundet med viktige biologiske prosesser som epiteliale til mesenkymale overgang [6] i kreftmetastase [7], protein biomarkører i blodet, nærværet av nukleinsyrer, mikroRNA og DNA-metylering i sera eller vevsekstrakter med prøvene strekkodet for rask prosessering ved bruk av automatiske protokoller [8], [9], [10]. I den foreliggende undersøkelse, som anvendes vi multiplekset quantum dot merking (MQDL) for å detektere den aktiverte c-Met-formidlede celle signalveien som fører til EMT, kreft vekst og ben og metastase mykt vev i en ny prostata cancer metastase modell [11], [ ,,,0],12], [13]. Vi bekreftet nivået av genuttrykk bedømt ved MQDL med genekspresjon som bestemt ved RT-PCR og Western blot. Deretter påføres den MQDL protokollen for å avgjøre om c-Met celle signalveien og EMT blir aktivert i et kastreringsresistent prostatakreft (CRPC) dyremodell og i kliniske prostatakreft prøver oppnådd fra pasienter med høye Gleason score og benmetastase. Vi observerte at aktivering av c-Met er nært knyttet til EMT i kreftceller og deres påfølgende økt migrasjon, invasjon og metastasering [14], [15], [16]. c-Met signalaktivering i menneske prostatakreft har viktige kliniske implikasjoner: 1) c-Met nedstrøms signal driver EMT og kreft celle migrasjon, invasjon, metastaser og overlevelse i flere menneskelige solide tumormodeller inkludert prostata kreft [15], [17], [18], [19]. 2) Siden rettet mot c-Met og VEGFR2 nedstrøms signalering med en syntetisk flere tyrosinkinasehemmer, cabozantinib (XL-184), resulterte i bemerkelsesverdig oppløsning på bein og bløtvev metastaser i et stort antall pasienter med solide tumorer inkludert CRPC pasienter [20 ], [21], vil det være viktig å vise om disse cellesignalveier kan bli aktivert i kliniske prøver og i relevante tumor xenograft-modeller. Vi brukte en human prostatakreft cellelinje for å vise at c-Met aktivering overfører EMT og prostatakreft bein og metastaser bløtvev og undersøkt i dybden c-Met signale aktivering av molekylære analyser med resultater bekreftet av MQDL. Vi deretter ansatt MQDL å vurdere c-Met signale aktivering i klinisk prostata kreft vevsprøver og korrelert resultatene med en kastrering-resistente human prostatakreft xenograft modell. Vi viste at MQDL, kombinert med Vectra Image Analysis, forbedrer den kvantitative profilering evnen til enkelte biomarkører på celle-nivå. En rekke biomarkører knyttet til EMT, som for eksempel redusert uttrykk for EpCAM, og økt uttrykk for N-cadherin, vimentin og RANKL, og c-Met signal aktivering, inkludert VEGF, neuropilin en, pc-Met og fosfor (P) -NF -κB p65 [15], [22], ble analysert. Resultatene av disse studiene viste en bemerkelsesverdig parallellitet EMT og c-Met aktivering mellom prostata kreftcelle-modell, den CRPC xenograft modell og kliniske prostatakreft prøver. De metoder som er etablert i denne studien kan være av betydelig verdi i nær fremtid for å karakterisere andre aktiverte signalveier i kliniske prøver, avhøre molekylære mekanismene bak kreft progresjon, identifisere druggable mål, og følge opp klinisk respons hos pasienter som terapeutisk intervensjon.
Materialer og metoder
Cell kultur og celle transfeksjon
LNCaP cellelinje, vennlig levert av avdøde Dr. Gary Miller ved University of Colorado (Denver, Colorado), var dyrket i RPMI 1640-medium (Invitrogen) supplert med 5% føtalt bovint serum (Atlanta Biologicals, Lowrenceville, GA), penicillin (100 ug /ml) og tetracyklin (100 u /ml) ved 37 ° C i fuktet atmosfære med 5% CO
2. Etableringen av kloner overekspresjon RANKL protein ble rapportert tidligere [23]. I korte trekk ble en full-lengde cDNA som koder for human RANKL fra OriGene (Rockville, MD) klonet i én retning for å p3 x FLAG- myc-CMV-25 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ved Notl og Xbal-restriksjonsenzymseter. Etter transfeksjon av LNCaP-celler ved 75% konfluens med flag-tagget RANKL og neo-plasmidet ved hjelp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i en 6-brønners plate i 48 timer, ble cellene trypsinert og sådd ut på en 15 cm plate. De stabile LNCaP-neo og LNCaP-RANKL-celler ble utsatt for G418-seleksjon (400 ug /ml) og enkeltcellekloner ble isolert og opprettholdt i 200 ug /ml G418 for RNA og protein ekstraksjon og immunologisk måling ved bruk av 8-brønners kammer bakker (Thermo Scientific, Rochester, New York). Tre LNCaP-RANKL og 2 LNCaP-neo celle kloner ble valgt. Siden deres biokjemiske fenotyper lignet vi brukte en klone av hver for studien.
Revers transkriptase (RT) PCR
Total RNA fra celler ble isolert ved hjelp RNeasy Mini Kit (Qiagen Sciences, Inc. ; Germantown, MD) i henhold til produsentens instruksjoner. Komplementært DNA (cDNA) ble generert fra 3 ug av total-RNA ved hjelp av SuperScript® III First-Strand Synthesis System (Invitrogen, 1 pl av cDNA ble underkastet PCR analyser ved anvendelse av følgende primere: RANKL F, 5′-TGG ATC ACA GCA CAT CAG AGC AG-3 «, RANKL R, 5′-TGG GGC TCA ATC TAT ATC TCG AAC-3′, E-cadherin F, 5»-GCC AAG CAG TAC CAG ATT CTA CAC G-3 «, E-cadherin R , 5»-GCT GTT CTT CAC GTG CTC AAA ATC C-3 «, N-cadherin F, 5′-GAT GTT GAG GTA CAG AAT CGT, N-cadherin R, 5′-GGT CGG TCT GGA TGG CGA-3′ ; vimentin F, 5′-GGA CTC GGT GGA CTT CTC, vimentin R, 5»-CGC ATC TCC TCC TCG TAG-3 «, c-Met F, TGGGAATCTGCCTGCGAA;. c-Met R, CCAGAGGACGACGCCAAA PCR-reaksjonssykler å bruke en innledende denaturering ved 94 ° C i 10 minutter, 36 sykluser ved 94 ° C, 1 min, 55 ° C, 30 sekunder; for RANKL72 ° C, 1 minutt etterfulgt av en endelig 72 ° C i 10 minutter forlengelse for E-cadherin. og N-cadherin genamplifikasjon, PCR-reaksjonene varte i 32 sykluser, og annealing temperaturene var henholdsvis 55 ° C og 47 ° C, i 30 sek. for vimentin og GAPDH forsterkning, PCR-reaksjonene løp for 28 sykluser med annealing temperaturer ved 48 ° C i 30 sek. De amplifiserte PCR-produkter ble funnet og analysert på 1% agarosegel
Western blot analyse
Celler ble lysert i RIPA buffer som inneholder 1 x proteasehemmer cocktail (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). og sentrifugert, og supernatantene ble samlet opp og kvantifisert ved anvendelse av Bradford-proteinanalysen (Thermo Fisher Scientific). Cellelysatene (20-30 mikrogram) ble løst på en 4-12% Bis-Tris gradient SDS-PAGE (Invitrogen, Carlsbad, California) under reduserende forhold, etterfulgt av transblotting på nitrocellulose membran (BioRad Laboratories, Hercules, CA), og blokkert i 5% ikke-fettholdig melk /PBST i en time ved romtemperatur (RT) og inkubert med fortynnet primære Abs i blokkeringsbuffer ved 4 ° C over natten. Kilden og fortynning av primær Abs var: RANKL (sc-74261, 1:400), E-cadherin (sc-7870, 1:1000), vimentin (sc-6260, 1:500), c-Met (SC- 10; 1:500) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), N-cadherin (# 610920; 1:200) (BD Transduction Laboratories, San Jose, CA og Santa Cruz Biotechnology), p-Met (Tyr-1230 /34/35) (# 44888G; 1:500) (Invitrogen), p-NF-kB p65 (Ser536) (# 3033; 1:1000), NF-kB p65 (# 4764; 1:1000) (Cell Signaling teknologi, Danvers, MA). Produksjon og bruk av androgen-reseptor-antistoff (PG21; 1:500) ble tidligere rapportert [24]. Membranene ble vasket 3 x med PBST, inkubert med peroksidase-konjugert anti-mus eller anti-kanin sekundært Abs ved værelsestemperatur i en time og vasket 3 x med PBST. Signalene ble visualisert ved hjelp av ECL Plus reagens (GE Healthcare biovitenskap, Pittsburg, PA). Restore Plus Western Blot Stripping Buffer (Thermo Fisher Scientific) ble brukt før re-sondering med forskjellig Abs.
In vivo eksperimenter
Alle dyr prosedyrer ble utført i henhold til godkjent protokoll fra Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC # 2999, Cedars-Sinai Medical Center, og A10-0100, University of British Columbia). LNCaP-RANKL og LNCaP-neo-celler (1 x 10
6 celler /50 ul PBS) ble inokulert inn i intracardially 5- til 7-uker gamle hann atymiske nakne mus (Charles River; n = 20 for LNCaP-RANKL og n = 15 for LNCaP-neo). Alle mus ble jevnlig for metastatisk tumordannelse som først skjedde i 8 uker. Dyrene ble avlivet etter 12 uker.
Prostatakreft vevsprøver
Formalin-fiksert og parafin-embedded (FFPE) human prostatakreft prøver ble innhentet fra Avdeling for patologi av Cedars-Sinai Medical Center (IRB # Pro 00021228). Andre kliniske prostatakreft vevsprøver ble oppnådd fra Dr. Fouad Habib ved University of Edinburgh, Skottland, og Dr. Hua Yang ved Jilin University, Kina. Bruk av kliniske prøver ble godkjent av menneskelig vev institusjonelle gjennomgang komiteer ved de respektive institusjonene.
CRPC xenografter
Å etablere arbeids protokoller for single og sekvensiell multippel QD merking, valgte vi å bruke en LTL -313 CRPC xenograft modell siden den etterligner kastrering resistent prostatakreft og gir konsistente og lett tilgjengelige flere vevsprøver kritiske for utvikling og etablering av en ny MQDL protokoll. FFPE- vev fra en kastrering resistent prostatakreft (CRPC) LTL-313 (Leve Tumor Laboratory, www.livingtumorcentre.com) xenograft modell ble hentet fra Vancouver Cancer Center, BC Cancer Agency, Vancouver, Canada. Den LTL-313 tumor linjen ble utviklet fra prostata nål biopsiprøve fra en 80 år gammel pasient diagnostisert med Gleason Score 8 prostatakreft med et serum PSA nivå på 17 ng /ml ved diagnosetidspunktet [25]. svulst linje utvikling protokollen ble godkjent av Clinical forskningsetikk styret for University of British Columbia, i samsvar med forsøksdyr Retningslinjer for Institute of Experimental Animal Sciences (menneskelig prøven bruk var med godkjenninger fra University of British Columbia, Canada (IRB # UBC BCCA REB # H04-60131). Kort fortalt, for å etablere kastrering resistent prostatakreft, ble friske LTL-313 tumorvev fra femte generasjon av pode skåret i 3 × 3 × 1 mm stykker og re-podet inn i subrenal kapsler av mannlige NOD-SCID-mus. dyrene ble holdt i tumordannelse i to måneder før kastrering for å fjerne androgener. Tre uker etter kastrering, når tumorvolumet ble betydelig redusert, ble de gjenværende tumorcellene høstet og fremstilt som FFPE vevsblokker. Xenongraft vev som brukes i denne studien ble hentet fra 9 svulster fra kastrerte mus og 5 svulster fra 5 intakte muse verter supplert med testosteron som hadde gjennomgått humbug drift.
Immunologiske måle reagenser
den primære antistoffer (Abs) og deres kilder var: monoklonalt Abs til menneskelig EpCAM (VU-1D9) og RANKL (12A668) fra Novus Biologicals (St. Charles, MO); monoklonalt Ab til c-Met (25H2) og kanin monoklonalt Ab til E-cadherin (24E10) fra Cell Signaling Technology; kanin polyklonale Ab til androgen reseptor, AR, (PG 21), levert av Dr. Gail Prins fra University of Illinois (Urbana, Illinois); geitepolyklonalt Ab til neuropilin-1 (C-19), kanin polyklonalt Abs til N-cadherin (H-63), Mcl-1 (S-19), p-NF-kB p65 (Ser 536), og VEGF (A -20) fra Santa Cruz Biotechnology, Inc .; og kanin polyklonale Ab til p-c-Met (pYpYpY1230 /1234/1235) fra Invitrogen. Sekundære Abs benyttet i studien var forberedt på en cocktail av biotinylert Abs til mus, kanin og geit IgG (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Fosfat-bufret saltvann (PBS) og streptavidin-konjugert QDS på 565-, 585-, 605-, 625-, 655- og 705 nm bølgelengde som 1fiM stamløsning ble kjøpt fra Invitrogen.
Immunhistokjemisk (IHC ) farging
IHC fulgt vår publisert protokollen [26] med mindre modifikasjoner. FFPE-snitt (4 um) ble deparaffinized, rehydrert, og utsatt for antigen gjenfinning. Etter inkubering i Dual Endogent enzym Blokk-løsning (Deeb, Dako, Carpinteria, CA) i 10 minutter, den delen ble behandlet med primært antistoff fortynnet med antistoffdiluent oppløsning (DAKO) som følger: RANKL (1:100), c-Met ( 01:50), neuropilin 1 (1:100), androgen reseptor (1:200), N-cadherin (1:100), Mcl-1 (1:100); p-NF-kB p65 (Ser536) (1:100), VEGF (01:50) og pc-Met [pYpYpY1230 /1234/1235] (1:100), vimentin (1:100), og E-cadherin ( 1:200) ved 4 ° C over natten. Delen ble deretter vasket 3 ganger i PBST (PBS inneholdende 0,2% Tween 20) i 5 minutter per vask. For å detektere spesifikk farging, ble den seksjon behandlet i 30 minutter med seg
+ Dual Link System-HRP (Dako), som inneholdt pepperrot-peroksidase konjugert geite-antistoffer mot mus og kanin-Ig. Seksjonen ble vasket 3 ganger i 5 minutter hver, og spesifikke flekker ble utviklet med 3,3′-diaminobenzidin (Dako).
Enkelt QD Merking (SQDL)
IHC farging protokollen var modifisert for enkelt QD merking. Streptavidin-konjugert QDS (565-, 585-, 605-, 625-, 655- og 705 nm) ble fremstilt som 10 nM i PBS med 6% IgG-fri, protease-fri BSA (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) . Antigen hentes vev eller faste celleprøver ble inkubert i PBS inneholdende 2,5% hesteserum (Vector Laboratories) og 20% streptavidin Blokk-reagens (Invitrogen) i 20 minutter, etterfulgt av behandling med primære Abs som beskrevet ovenfor i den ovennevnte immunologiske reagenser delen i PBS pluss 1% hesteserum og 20% Biotin blokk-reagens (Invitrogen) ved 4 ° C over natten. Etter en 3 x 5 min PBST (PBS + 0,4% Triton X-100) skylle prøver ble inkubert med det sekundære Ab cocktail ved romtemperatur i 30 minutter og deretter inkubert med de respektive streptavidin-QD ved 37 ° C i 60 min. Ved slutten av hver inkubering, ble prøvene underkastet rutine 3 x 5 min PBST (PBS + 0,4% Triton X-100) skylling. Etter siste skylling, ble platene montert i vandige monterings medier som inneholder 4’6-diamidino-to-phenylindole (DAPI) (Vector Laboratories) for bildebehandling. Ab fortynninger ble beskrevet i IHC avsnittet ovenfor.
multiplekset QD Merking (MQDL)
Den eneste QD merking protokollen ble endret for MQDL, der en enkelt vev delen ble utsatt for farging for multiple markører på en sekvensiell måte. For hver biomarkør test, merking startet med et streptavidin blokkering, etterfulgt av primær Ab reaksjon og biotinylert sekundært Ab inkubasjon, og omsetning med streptavidin-konjugert QD ved en spesifisert bølgelengde. Seksjoner ble inkubert sekvensielt (med en 3 × 5 min PBST skylling etter hvert inkubasjon). Primære Abs og fortynninger i MQDL var identiske med de som brukes for SQDL. Immunoreaksjonen sekvensene var: 1) Anti-Neuropilin-1 Ab, 2 timer, romtemperatur; biotinylert heste anti-geit IgG, ved værelsestemperatur, 30 min; streptavidin-QD705, ved 37 ° C, 1 time. 2) Anti- p-c-Met Ab, ved 4 ° C, over natten; biotinylert heste-anti-kanin-IgG, ved værelsestemperatur, 30 min; streptavidin-QD655 ved 37 ° C, 1 time. 3) Anti-VEGF Ab, ved romtemperatur i 2 timer; biotinylert heste-anti-kanin-IgG, ved værelsestemperatur, 30 min; streptavidin-QD625 ved 37 ° C, 1 time. 4) Anti-p-p65-NFkB Ab ved 4 ° C over natten; biotinylert heste-anti-kanin-IgG ved romtemperatur, 30 min; streptavidin-QD565 ved 37 ° C, 1 time. 5) Anti RANKL Ab ved romtemperatur, 2 timer; biotinylert heste anti-muse-IgG ved romtemperatur, 30 min; streptavidin-QD585 ved 37 ° C, 1 time. 6) Montering i vandige monterings medier som inneholder DAPI. Ab konsentrasjoner ble beskrevet i IHC-delen. Deler av FFPE LNCaP-RANKL menneskelige prostata kreft celler ble brukt som en positiv kontroll. For negativ kontroll ble primære Abs erstattet med isotype- og arts matchet kontroll Abs og brukes på en nærliggende vev delen, og MQDL ble utført parallelt med vevet lysbilde merket med testing primære Abs.
Bilde Oppkjøp
CRI spektral avbildning system (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) med innebygd Nuance v3.1 programmet ble brukt til å dokumentere multispektrale bilder etter produsentens anbefalte protokoll. For hvert felt av kreftvev, ble seriebilder kjøpt til 10 nm bølgelengde intervallet 450-800 nm, en rekke valgt som svarer til de aktive fluorescerende QDS. Det genererer en ubehandlet bilde «kube» som en bunke med 36 separate bilder med hvert bilde inneholder komplett spektral informasjon for hver piksel på at gitt bølgelengde. Alle bildene ble kjøpt til 400 × forstørrelse, med en 50 millisekunder eksponering. For å unngå variasjoner i merking på grunn av celle heterogenitet ble fem bilder fra ulike kreftvev nettsider tatt for hver vevsprøve for påfølgende kvantifisering.
Bilde Deconvolution
Bilde deconvolution eller unmixing protokollen ble brukt til å trekke ut spesifikk merking av en spesifisert QD. En spektral bibliotek for 565, 585, 605, 625, 655, og 705 nm ble bygget for deconvolution av performimg flere SQDLs bruker androgen reseptor (AR) antistoff uten endelig DAPI kontra på serielt tilstøtende vev seksjoner. Den positive merking av AR ble bekreftet ved parallell IHC flekker på tilstøtende vev. Spekteret av DAPI ble oppnådd ved å montere tilstøtende vev i det vandige medium inneholdende monterings DAPI. Spectra av vev autofluorescence ble kjøpt for hver vev fra en negativ kontroll lysbilde (se MQDL seksjon) utarbeidet av IHC uten fluorescerende markører. Autofluorescence reduksjon ble utført ved Real Component Analysis plug-in programvare. Den spektrale Biblioteket ble deretter brukt til å unmix kuben. De separate spektrale bidrag til data «cube» er avgitt som utpekte fargede intensitet kart. Disse bildene representerer fordelingen av hver av de QDS og autofluorescens i vevet. Etter deconvolution av bildene, ble bakgrunnen merking filtrert og bare de sanne positive signaler ble vist på bildene av det som presenteres.
Signal Kvantifisering
Den spektrale Biblioteket ble brukt til å deconvolute den bildebehandling kuben til å trekke merking av enkelte QD hjelp informere v1.3 programvare (Sylinder) etter anbefalt strategi. Først ble et treningssett bestående av to klasser av vev ble opprettet: «kreft» og «ikke-kreft «. Programvaren ble trent på disse områdene ved hjelp av spektra av både DAPI counterstain og multiplex QD immunolabeling og testet på 50 tilfeldig utvalgte celler fra hvert bilde for å avgjøre nøyaktigheten av å skille de to klassene. Denne prosess ble gjentatt inntil ytterligere iterasjoner ikke lenger forbedret nøyaktighet. Histologiske H /E bilder ble deretter brukt til å lokalisere cancerceller basert på atom DAPI merking. En innebygd algoritme ble deretter brukt til å definere det cytoplasmatiske vs. atom subcellulære regioner. Basert på en analyse av bilder med 400 x forstørrelse, de optimale terskelinnstillingene tilnærmes: fast skala 200, minimum blob størrelse 20, maksimal blob størrelse 10000, sirkularitet terskel 0, skarpheten i kantene 0, fylle hullet aktivert (kjernefysiske parametre); indre avstand til kjernen 1, ytre avstand til Nucleus 7, minimum cytoplasma utvalgsstørrelse 1, minimum signalområde 0, maksimal signalrekkevidde 65535 (cytoplasmatiske parametre). For å eliminere ikke-spesifikke signaler ved de angitte spekteret, en acellulær område innen fagområdet som analyseres ble brukt som bakgrunn merking. QD fluorescens intensitet i hver celle ble eksportert til et Excel-regneark (Microsoft, Seattle, Washington) og utsatt for statistisk analyse [27], [28].
Resultater
Utvikling av en kvantitativ QD merking protokoll for vurdering av genekspresjon forbundet med aktivering av c-Met signalering og EMT i dyrkede humane LNCaP celler stabilt tansfected med RANKL
LNCaP bein og metastaser bløtvev modell: En roman LNCaP bein metastase modellen ble utviklet ved stabil transfeksjon av denne cellelinje med RANKL (LNCaP-RANKL), som driver EMT i de transfekterte cellene. Når RANKL overekspresjon LNCaP celler ble injisert intracardially på mus de viste en økt forekomst av bein og bløtvev metastaser (tabell 1).
Validering av aktiverte c-Met signalkomponenter som fører til EMT av RT- PCR, Western blot og Single Quantum Dot merking, SQDL: Sammenligning av genuttrykk mellom stabil LNCaP-neo-kontroll og LNCaP-RANKL celler ved hjelp av RT-PCR og Western blot viste tegn til aktivert c-Met signaliserer gjennom økt uttrykk av c-Met, pc-Met, og p-NFkB p65 (figur 1). Cellene gjennomgikk morfologiske (panel A) og biokjemiske (Panel B og C) epiteliale til mesenchymal overgang, med redusert intercellulær adhesjon mediert av E-cadherin og EpCAM, og økt N-cadherin, vimentin og RANKL. Disse vurderingene av c-Met signale aktivering og EMT ble utsatt for SQDL analyser med en bestemt innsats for å bekrefte om c-Met aktivering og EMT skjedde i denne cellen modellen av prostatakreft progresjon. SQDL bekreftet at i forhold til å kontrollere LNCaP-neo celler (Figur 2A), LNCaP-RANKL celler (figur 2B) hadde aktivert c-Met signale som avslørt av en forhøyet uttrykk av RANKL, c-Met, pc-Met og p-NFkB p65 og bevis for EMT, en cadherin switch av forhøyet uttrykk for N-cadherin, vimentin og RANKL men redusert uttrykk for E-cadherin og AR. Kvantitative analyser (figur 3) i 1.000 tilfeldig utvalgte kreftceller ved å informere programvare (Sylinder) støttet bildedataene, hvor både Ar og E-cadherin-ekspresjon ble drastisk redusert og aktivert c-Met aliserte komponenter ført til EMT, for eksempel forhøyet ekspresjon av c-Met, pc-Met, p-NFkB p65, ble det observert N-cadherin, vimentin, og RANKL i LNCaP-RANKL, sammenlignet med LNCaP-neo-celler. Denne kvantitative SQDL protokollen ble vedtatt for genekspresjon analyser av en etablert CRPC LTL-313 xenograft modell.
RANKL-transfekterte LNCaP celler indusert EMT i histomorphology (A) og genuttrykk i mRNA (B) og protein (C ). Data representerer en av tre RANKL-stabilt transfektert og 2 neo-stabilt transfekterte LNCaP-cellekloner.
Differensial QD merking av proteiner ble utført i LNCaP-neo (A) og LNCaP-RANKL (B) celler ved hjelp av DAPI nukleær farging som referanse. For hver analyse, QD merket protein uttrykk presenteres i pseudocolor, med overlagt bilde av DAPI og QD-signaler (Sammenslåtte). × 400.
Cell-baserte gjennomsnittlig intensitet teller fra 1000 hver av neo og RANKL-transfektert LNCaP kloner ble kvantifisert ved hjelp informere programvare. Det ble observert statistisk signifikante endringer i proteinuttrykk (
P
0,05)
Validering av c-Met signale aktivering og EMT i CRPC LTL-313-modellen med resultatene bekreftes av. IHC og SQDL
for å forstå den kliniske betydningen av c-Met signale aktivering og EMT i LNCaP-RANKL modell og tilhørende økning i prostatakreft metastaser, definerte vi c-Met signalveien og EMT i en CRPC LTL-313 xenograft modell hentet fra Living Tumor Laboratory (livingtumorcentre.com). Vi følger ekstra c-Met signal forbundet gener som neuropilin-en, VEGF, p-Akt, VEGFR2, Mcl-en og AR, som ble karakterisert som formidlere av c-Met nedstrøms overlevelse signale [15], [21], [ ,,,0],29], [30]. Figur 4 viser at økt c-Met signalassosierte gener og redusert AR uttrykk i CRPC LTL-313 xenografter opprettholdt hos kastrerte hann vertene, som vurdert av IHC (panel A) og SQDL (panel B) sammenlignet med de xenografter opprettholdt i intakte mus med androgen tilskudd.
c-Met aktivert og EMT forbundet proteiner ble påvist i CRPC LTL-313 xenograft modell av konvensjonell IHC (A) og SQDL (B). Kastrering økt et panel av gener i LTL-313 xenograft prostatakreft og redusert AR uttrykk i forhold til xenotransplantater oppnådd fra intakte verter ved både IHC og SQDL. × 400.
MQDL analyse viste aktivert c-Met og EMT i en CRPC LTL-313 xenograft modell og primære og metastatiske prøver menneskelige prostata kreft vev. En rekke av menneskelige prostata kreft xenografter hentet fra Living Tumor Laboratory ble brukt til å teste den kvantitative MQDL protokollen. Vi valgte LTL-313 modell for denne oppgaven fordi denne modellen viser CRPC egenskaper med en tilbøyelighet for primært lymfeknute, lunge- og levermetastaser med sjeldne beinmetastaser, når svulstene er implantert og dyrket under nyre kapsler. Vi testet hypotesen om at tumorer dyrket i kastrerte mus ville utvikle kastrering motstand og har aktivert c-Met signalisering fører til EMT, når sammenlignet med tumorer dyrket i mus supplert med eksogen androgen (figur 5A). Tre metoder ble tatt: 1) for å etablere en robust MQDL protokoll for å påvise og kvantifisere et panel av genekspresjon på de CRPC LTL-313-modellen vevsprøve med resultater sammenlignet med SQDL; 2) for å bruke denne etablerte kvantitative MQDL protokollen for å bekrefte om aktivering av c-Met og EMT oppstå i CRPC LTL-313 vev opprettholdes i de kastrerte vertene; og 3) for å demonstrere ved den standardiserte protokollen MQDL aktivering av c-Met og EMT-induksjon i både primære og metastatiske menneskeskjelett prostata kreftvev. Figur 5B viser den kvantitative MQDL analyser av neuropili-1, pc-Met, VEGF, p-NFkB p65, og RANKL, som tidligere er rapportert å være assosiert med c-Met signal aktiverings [15], [22] og EMT [26], [31] i menneskelige prostata kreft celler og i CRPC LTL-313-modellen. Vi viste aktivert c-Met signalering og EMT, som utstilt ved økt uttrykk av neuropilin-en, VEGF, og RANKL protein og aktivering av pc-Met og p-NFkB p65 i CRPC LTL-313 tumor modell med høyere uttrykk og aktivering av disse genene i LTL-313 tumorxenotransplantater opprettholdt hos kastrerte sammenlignet med intakte mus. Som en intern kontroll for å minimalisere mulig fluorescens innblanding av flere QD sonder, utførte vi MQDL side om side med den SQDL protokollen (se ovenfor). Den forhøyede ekspresjon av de 5 undersøkte gener ble funnet å være statistisk signifikante ved Infom kvantitative analyser (figur 5B). Vi er fast bestemt dette panelet av 5 gener i primær prostatakreft prøver med forskjellige Gleason score og funnet ut at uttrykk for neuropilin-en, VEGF, pc-Met, RANKL, og p-NFkB p65 var mer opphøyd i dårlig differensiert (Gleason score 10) enn moderat differensiert (Gleason score 7, 3 + 4) prostatakreft (figur 6). Disse resultater, tatt sammen, bekreftet at QD merking er svært følsom og allsidig og kan anvendes for multipleksing av genekspresjonsprofiler i eksperimentelle modeller på celle-nivået.
enkelt svulst vevssnitt fra intakte og kastrerte verter ble utsatt til sekvensielle MQDL. Forbedret uttrykk for c-Met aktiverte genene ble oppdaget i tumorvev fra kastrerte verter. (A) En stabel av flere bilder (Cube), kjerne flekker (DAPI) og individuelle genuttrykk (i pseudocolors) er vist. Genekspresjon signaler ble overlagret med DAPI atom signaler for å gi et sammensatt bilde for analyse. × 400.
