Abstract
Bakgrunn
Lungekreft forårsaker cirka 1,2 millioner dødsfall per år på verdensbasis, og ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) representerer 85% av alle lungekrefttilfellene. Forstå de molekylære hendelser i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er avgjørende for å forbedre tidlig diagnostisering og behandling for denne sykdommen.
Metodikk og hovedfunnene
I et forsøk på å identifisere nye NSCLC relatert gener, utførte vi et genom-wide screening av kromosomkopiantall endringer som påvirker genekspresjon ved hjelp av microarray baserte komparative genomisk hybridisering og genuttrykk arrays på 32 radikalt resected tumorprøver fra stadium i og II NSCLC pasienter. En integrerende analyseverktøy ble anvendt for å bestemme hvorvidt kromosomal kopiantall påvirker genekspresjon. Vi identifiserte en sletting på 14q32.2-33 som en vanlig endring i NSCLC (44%), som i betydelig grad påvirket genuttrykk for HSP90, bosatt på 14q32. Denne slettingen ble korrelert med bedre total overlevelse (p = 0,008), overlevelse var også lenger i pasienter med tumorer hadde lave nivåer av HSP90. Vi utvidet analysen til tre uavhengige validerings sett med NSCLC pasienter, og bekreftet lav HSP90 uttrykk for å være relatert med lengre total overlevelse (P = 0,003, P = 0,07 og P = 0,04). Videre in vitro behandling med en HSP90 inhibitor hadde potent antiproliferativ aktivitet hos NSCLC cellelinjer.
Konklusjoner
Vi foreslår at målretting HSP90 vil ha klinisk effekt for NSCLC.
Citation: Gallegos Ruiz MI, Floor K, Roepman P, Rodriguez JA, Meijer GA, Mooi WJ, et al. (2008) Integrering av Gene Dosering og genuttrykk i ikke-småcellet lungekreft, Identifisering av HSP90 som potensielt mål. PLoS ONE tre (3): e0001722. doi: 10,1371 /journal.pone.0001722
Academic Redaktør: Christoph Plass, Ohio State University, USA
mottatt: 28 desember, 2007; Godkjent: 04.02.2008; Publisert: 05.03.2008
Copyright: © 2008 Gallegos Ruiz et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser:. Paul Roepman er ansatt Agendia BV:
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis [1] og ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) representerer 85% av lungekrefttilfellene. En bedre forståelse av de molekylære hendelser som ligger til grunn for utvikling og progresjon av sykdommen kan bidra til å forbedre den kliniske behandling av NSCLC. Et antall gener, f.eks P53, RAS, P16 og EGFR, har vist seg å endres i NSCLC [2]. Gitt den heterogene og komplekse natur av denne svulsttypen, er det sannsynlig at mange gener kjøre NSCLC tumorigenesis er ennå ikke identifisert.
Kromosomavvik er tenkt å være kritiske hendelser i menneskehetens tumorigenesis, og flere genomiske regioner ofte husing DNA gevinster (3Q, 5p, 7q, 8Q, 11q og 16p) og tap (3p, 4Q, 5q, 6Q, 8p 9p og 13q, VED BETJENING 17Q) har blitt identifisert i NSCLC pasienter [3]. Ved hjelp av sammenlignende gruppe basert genomisk hybridisering (aCGH) og genekspresjon mikromatriser, DNA-kopitall endringer og gen-ekspresjon kan bli målt gjennom hele genomet av tumorceller. Ved å kombinere data fra disse analysene, er det mulig å oppnå et integrert genom bred riss av genet doseringsaberrasjoner og deres effekt på genekspresjon, noe som kan bidra til å identifisere gener som er viktige i NSCLC [4].
I denne studien har vi utført en integrerende analyse av kromosomkopiantall og genekspresjon på radikalt resected tumorprøver fra 32 NSCLC pasienter. To nye algoritmer, «CGH anrop «[5] og» ACE-it» [6], ble anvendt for å analysere dataene. Vi identifiserte en sletting på kromosom region 14q32.2-33 i 44% av NSCLC. Denne delesjon ble slekt med forbedret pasientoverlevelse, og er assosiert med redusert ekspresjon av HSP90, en molekyl anstand for flere oncoproteiner som blir utforsket som en ny mål i anticancerterapi. Lav HSP90 uttrykk ble korrelert med bedret overlevelse i de 32 NSCLC pasienter som ble analysert i utgangspunktet. Videre analyser av tre uavhengige sett med NSCLC pasienter bekreftet en signifikant sammenheng mellom pasient overlevelse og HSP90 uttrykk. I tillegg
in vitro
forsøk viser NSCLC-cellelinjer for å være ekstremt følsom for HSP90-inhibitor 17-AAG. Våre data tyder på og viktig rolle for HSP90 i NSCLC.
Metoder
Pasienter og prøver
testsett på radikalt resected vevsprøver av 32 scene NSCLC pasienter tidlig. Tre pasienter hadde en overlevelsestid på mindre enn 30 dager og ble ansett postoperative dødsfall. Derfor er disse tre pasienter som ikke er inkludert i overlevelsesanalyser. Pasientene hadde en median oppfølging på 86 måneder (variasjon 0,4 til 135,5). Verbal informert samtykke var innhentet fra alle pasienter og håndtering av prøver var i samsvar med protokoller godkjent av etisk board «subcommissie voor de ethiek van het mensgebonden Onderzoek» fra VU University Medical Center i Amsterdam.
Den første validering sett besto av 140 radikalt resected NSCLC pasienter fra Europa lungekreft konsortium. Pasientene hadde en median oppfølging på 35 måneder. Alle pasientene hadde ingen tidligere malignitet, patologisk tumorstadium 1 eller 2 (T1-2), node stadium 0 + 1 (N0-1), ingen fjernmetastaser (M0) på tidspunktet for operasjonen, og ingen restsykdom etter reseksjon ( R0). Ingen av disse pasientene fikk (neo) adjuvant kjemoterapi eller strålebehandling. Den andre validering besto av 111 tidlig stadium NSCLC pasienter fra Bild et al. [7]. Den tredje validering sett bestod av de offentlig tilgjengelige «datasett 1 og 2» fra Lu et al. [8] og inneholdt 54 scene NSCLC pasienter tidlig. En fullstendig beskrivelse av pasientkarakteristikker av alle fire pasient sett er gitt i tabell 1.
Isolering av genomisk DNA og rekke komparativ genomisk hybridisering
Cryo-deler av frosne vevsprøver, flankerer seksjonene som brukes til RNA og DNA, ble verifisert ved undersøkelsen patologen (WM) for å inneholde minst 50% av tumorcellene. Genomisk DNA ble ekstrahert fra hver prøve ved hjelp Trizol følge produsentens instruksjoner (Life Technologies, Breda, Nederland). DNA merking og hybridisering på CGH 30K oligonukleotid mikromatriser ble utført som beskrevet av van den IJssel et al [9].
RNA isolasjon og genuttrykk mikro arrays
RNA isolering og cDNA merking fulgt standardprotokoller . Hybridisering ble utført på Agilent plattform i henhold til standardprosedyrer som beskrevet av produsenten, og andre steder [10].
Dataanalyse
For matrise CGH, flekk-analyse og kvalitetskontroll ble utført ved anvendelse av BlueFuse versjon 3,2 ( BlueGenome, Cambridge, UK). Stoppunkter, gevinster, tap og presiseringer ble oppdaget ved hjelp av algoritmen CGH samtalen. Denne algoritmen omdanner rå log2ratios til absolutte mål for «tap», «normal», «økning» eller «forsterkning» ved påføring av et segmenteringsalgoritme kombinert med en sannsynlighetsmodell blanding [11]. For å teste om statistisk genekspresjon var påvirket av gen-dosering søkte vi en matrise CGH uttrykk integrasjonsverktøyet, ACE-it [6], i hvilken den anropte matrisen CGH og normalisert log10 forholdstall for ekspresjon matriser ble anvendt som inngangsdata. ACE-den bruker ensidige Wilcoxon Rank Sum statistikk til å teste hvilken kromosomal kopi nummer avvik recurrently påvirke RNA uttrykk. Beregnede p-verdier er korrigert for multippel testing med Benjamini Hochberg metoden [12]. ACE-det bare tester gener som oppfyller kriteriene for forurensning og balanse, som styres via en terskel på hvor mange prøver. Her terskelen ble satt ved en fast og forhåndsinnstilling av 9 prøver, noe som betyr at bare de kromosomale posisjonene ble tatt hensyn til den hadde minst 9 prøver i en CGH ringer status og ikke mer enn 9 i den annen stilling. Hele matrisen CGH datasett av test-serien (n = 32) er tilgjengelige på GEO database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo, tiltredelse antall GSE7878). De genuttrykk data av både testsettet (n = 32) og validering set 1 (n = 140) for de 359 genene identifisert av ACE-it er tilgjengelig på Array Express database (www.ebi.ac.uk/aerep/innlogging, tiltredelse antall Array utforming: A-MEXP-749, Experiment data. E-TABM-270)
genuttrykk data validering satt to ble innhentet ved hjelp av Affymetrix Hu133plus2 chips (GEO sjonsnummer GSE3141). Gjennomsnittsverdien av MAS5 beregnede signal intensiteter av fire probesets oppdage HSP90AA1 ble brukt i våre beregninger.
De tredje validering sett neden genuttrykk data fra Affymetrix Hu95 og Hu133 chips (GEO sjonsnummer GSE6253). Den Hu95 chip inneholdt en probeset detektere HSP90AA1 og Hu133 chip inneholdt fire probesets, hvorav middelverdien av RMA beregnet signalintensitet ble brukt i våre beregninger.
statistikker
En univariate cox regresjon analysen ble utført for å undersøke forholdet av genekspresjon verdier med overlevelsestiden. Overlevelseskurver ble konstruert ved hjelp av Kaplan Meier metoden og forskjeller i samlet ble evaluert ved bruk av log-rank test. I testsettet, var tre pasienter med mindre enn 30 dager overlevelse ekskludert fra overlevelsesanalyse, og deres død ble ansett kirurgisk dødelighet. For å bestemme de uavhengige effektene av HSP90 uttrykk, histologisk subtype, tumor stadium, alder og kjønn, ble en multivariat Cox regresjonsanalyse utført. AP verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Multiplex Ligation avhengig Probe Amplification (MLPA)
For Multiplex Ligation avhengig Probe Amplification (MLPA), den subtelomere probe sett P070 (MRC Holland, Amsterdam, Nederland) inneholdende en sonde som ligger innenfor båndet 14q32.33 (region 104874216-105070384) ble anvendt. MLPA ble utført i henhold til produsentens instruksjoner ved hjelp av 100 ng DNA som input. DNA isolert fra blodet av en pool av friske donorer ble anvendt som referanseprøve. Sondesignalene ble normalisert ved å dividere toppområdet av kromosom 14q ved toppområdet av kromosom 14p. MLPA generert 14q /14p-forhold er plottet mot de gjennomsnittlige normaliserte log2ratios av oligoene i området 104787271-105071522 fra rekken (totalt 11 oligoer). Denne regionen dekker området av MLPA sonde.
Kvantitativ RT-PCR
For å validere uttrykk verdier innhentet via genuttrykk arrays, vi utført kvantitativ real-time PCR ved hjelp Taqman® teknologi og ABI PRISM 7500 Sequence Detection System instrument utstyrt med SDS versjon 1.3.0 programvare (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Forover og revers primere og prober ble designet og produsert av Applied Biosystems for HSP90AA1 (Hs00743767_sH), og for den endogene kontroll genet GUSB (Hs00939626_mi). PCR ble utført i et 25-ul reaksjonsvolum som inneholdt 50 ng av cDNA, 1 × TaqMan Universal PCR Master Mix, og primer og probe sett for HSP90AA1 og GUSB. Hver prøve ble analysert i duplikat, og den gjennomsnittlige terskelsyklus (Ct) verdier for hver prøve for GUSB, ble trukket fra den gjennomsnittlige Ct-verdiene for HSP90AA1. TaqMan-genererte ΔCt verdier ble log transformert til uttrykk verdier og plottet mot Δlog2ratios mellom GUSB og HSP90AA1 fra uttrykket array.
Cell veksthemming studier
Veksthemming følgende
in vitro
eksponering til klinisk brukes HSP90 inhibitor 17-AAG (InvivoGen, San Diego, CA) ble undersøkt i fire EGFR villtype NSCLC cellelinjer (H460, H157, H441 og A549, hentet fra legene. P. Dennis og F. Kaye , NCI, Bethesda, MD). I korthet, 10
5-celler ble sådd ut i 6-brønns vevskulturplater (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), tillates å overholde, og deretter kontinuerlig eksponert for forskjellige konsentrasjoner av 17-AAG (0, 10, 30 , 100, 300, 1000 nM) i 24, 48 eller 72 timer. Ved hvert tidspunkt, ble cellene løsnet fra brønnene, inkubert med trypanblått, og levedyktig (trypanblått-ekskluderende) celleantall ble bestemt in triplo ved bruk av et hemacytometer. Den midlere celleantall med standard feilfelt er vist ved hvert tidspunkt. I tillegg IC
50 (medikament-konsentrasjon ved hvilken 50% veksthemming oppnås) 17-AAG ved 72 timer ble bestemt for hver cellelinje.
Resultatene
Gene doserings -relaterte genuttrykk endringer i NSCLC
Kromosomavvik var rikelig i de 32 NSCLC analysert. For å kunne identifisere svake punktene av gevinster og tap påført vi algoritmen CGH samtalen [11]. I tabell 2 er de kromosomale regioner hvor gevinster eller tap som var til stede i minst 20% av pasientene, er oppført. Den statistiske verktøy ACE-it [6] ble anvendt for å bestemme hvorvidt genkopitallet påvirkes genekspresjon. Totalt 359 transkripsjoner viste seg å bli betydelig påvirket av kopiantall. I figur 1 områdene berørte gener er indikert for 32 NSCLC pasienter, vist i grønt (vunnet regioner) eller rød (tapte regioner).
Sammendrag tomt for såkalte gevinster og tap i 32 resected NSCLC pasienter med DNA-kopi antall endringer angitt i grått. Positive verdier angir prosentandelen av prøvene funnet med en gevinst. Negative verdier indikerer hvor mange prosent av prøvene skjuler et tap på angitt kromosom plassering. Gener i angitte områder berørt av kopiantall gevinst er angitt i grønt og gener som påvirkes av kopi antall tap er angitt i rødt. Et utvalg av berørte gener er indikert. Den fullstendige listen over 359 berørte vitnemål kan bli funnet i supplerende tabell S1.
En univariate cox regresjon overlevelsesanalyse ble utført for uttrykk for alle 359 gener som ble identifisert til å være påvirket av eksemplar nummer (se utfyllende tabell S1). Etter flere tester korreksjon (med Benjamini Hochberg metoden) ingen av 359 gener forble betydelig for å overleve på denne lille pasienten sett (n = 32). Topp liste av gener korrelerte med overlevelse (rangert på rå p-verdier) inneholdt hovedsakelig gener som ligger på kromosom 3 og 5 fått regioner. Vi har også observert en gen i topp-liste 20, HSP90AA1, lokalisert på kromosom 14. HSP90AA1 gen (vanligvis referert til som HSP90), som ligger på 14q32.2, var den eneste gen i dette område med betydelig redusert ekspresjon hos pasienter påvirket ved tap av denne regionen (P = 0,05). Disse observasjonene bedt oss om å undersøke dette locus i mer detalj.
Genomisk avvik på 14q og HSP90AA1 genuttrykk sammenheng med overlevelse
Vi undersøkte sammenhengen av tilbakevendende stramt sletting i regionen 14q32.2- 33, med overlevelse. Interessant, pasienter der dette område ble slettet hadde en forbedret total overlevelse (OS) sammenlignet med pasienter som hadde et normalt gen dosering på dette locus (5 år OS 69% vs. 41%, P = 0,004-figur 2A).
(A) Kaplan-Meier kurver for total overlevelse er vist for 29 pasienter i forhold til genet dosering i kromosom region 14q32.33. (B) Total overlevelse for 29 pasienter i forhold til HSP90 uttrykk. Lav ekspresjon ble definert som uttrykk lavere enn medianen av totalt 32 prøver, «normal» ekspresjon ble definert som er høyere enn medianverdien av 32 prøver. Tre av 32 pasienter inkludert i analysen av genet dosering og uttrykk ble ekskludert fra overlevelsesanalyse på grunn av en overlevelsestid på mindre enn 30 dager.
For å undersøke HSP90 uttrykk i forbindelse med overlevelse, vi delt de 32 pasientene i to grupper basert på deres overlevelse status to år etter tumorreseksjon. Omtrent halvparten av pasientene ble kategorisert som «høy risiko» og halvparten så «lav risiko». For å finne ut om både risikogrupper kan bli diskriminert ved hjelp av genuttrykk av HSP90, bygget vi Kaplan Meier overlevelsesestimater for to like store grupper med «lav» og «normal», basert på medianen HSP90 uttrykk. Lav ekspresjon av HSP90 var assosiert med bedre total overlevelse (5 år OS 70% vs. 40%, P = 0,13 figur 2B), selv om forskjellene mellom de to gruppene var opprinnelig ikke vesentlig på grunn sannsynligvis en kombinasjon av en lav størrelsesorden av forskjellen og et lavt antall pasienter som ble analysert.
Teknisk validering av 14q sletting og HSP90 uttrykk
for å validere slettingen observert i regionen 14q32.2-33 vi utført multiplex ligation avhengig sonde forsterkning [13] (MLPA) analyse ved hjelp av en subtelomere probeset inneholder en sonde i region 14q32.33. Korrelasjonskoeffisienten (R
2) mellom tap av dette området oppdaget av matrise CGH og av MLPA var 0.439.
For å validere HSP90 uttrykk data innhentet med mikromatriser vi utført kvantitativ RT PCR der Taqman® teknologi. Det ble observert en god korrelasjon mellom uttrykket av HSP90 målt med de to forskjellige teknikker (R
2 = 0,6431).
Validering av HSP90 uttrykk og forhold med overlevelse i selvstendig pasient serie
for ytterligere å undersøke sammenhengen mellom lav HSP90 uttrykk og NSCLC pasient prognose, brukte vi tre uavhengige validerings sett med NSCLC pasienter. I alle tre pasient sett, «lav-risiko» /»high-risk» pasient fordeling mellom pasient kohorter var omtrent to tredjedeler kontra en tredjedel. Derfor har vi brukt 33-persentilen av HSP90 uttrykk som avskåret for separasjon av pasienter med «normal» (dvs. høy-risiko) og «lav» (dvs. lav-risiko) uttrykk. For alle tre valideringssett, ble lavt uttrykk av HSP90 korrelert med forbedret total overlevelse. Denne korrelasjonen var vesentlig for den første og tredje valideringssett (P = 0,003 og P = 0,04), og borderline betydning for det annet sett (P = 0,07) (figur 3). Multivariat analyse viste at HSP90 prognostisk verdi var uavhengig fra scenen, histologisk subtype, alder og kjønn av pasientene (Tabell 3).
Total overlevelse for (A) 140 pasienter med NSCLC, validering set 1 (B) 111 NSCLC pasienter, validering satt to og (C) 54 pasienter med NSCLC, validering satt 3. avskåret for skillet mellom lav og «normal» uttrykket var basert på den 33-persentilen av uttrykk verdier.
Validering av HSP90 som en levedyktig molekylære mål i et panel av NSCLC cellelinjer
HSP90 er en molekylær anstand som stabiliserer flere teinene, inkludert EGFR, og utgjør en roman potensielt mål for kreftbehandling. Dataene ovenfor viste at HSP90 uttrykk nivå er et prognostisk indikator på langsiktig overlevelse i en stor serie med NSCLC pasienter, og foreslår at HSP90 hemmere kan ha bredere nytte i denne sykdommen enn tidligere anerkjent. For å undersøke denne muligheten, testet vi om farmakologisk hemming av HSP90 funksjon ville påvirke
in vitro
cellevekst av et panel av NSCLC cellelinjer. Veksten av disse cellelinjene, alt som bærer vill-type EGFR, var dypt hemmet, i en dose- og tidsavhengig måte, ved sub-mikromolare konsentrasjoner av 17-AAG, en HSP90-inhibitor [14] for tiden i fase II klinisk forsøk (figur 4). 72 timer, IC50 var under 50 nM 17-AAG i alle tilfeller, og høyere medikamentkonsentrasjoner gående resulterte i markert cytotoksisitet.
(A-D) tids- og doseavhengig inhibering av in vitro-vekst av H460, H157, H441, og A549 NSCLC cellelinjer etter eksponering for 17-AAG. Celler ble sådd med 105 /brønn, og levedyktig celleantall ble bestemt på påfølgende dager, som beskrevet i Metoder. 17-AAG-konsentrasjoner på (H441) eller høyere (A549, H460 H157) 30 nM jevnt resulterte i tidsavhengig tap av celle levedyktighet. IC50-verdien av 17-AAG (kontinuerlig eksponering i 72 timer) for hver cellelinje er som følger:. H460 = 30 nM, H157 = 15 nM, H441 = 8 nM, og A549 = 20 nM
diskusjon
Basert på rekke-CGH data i NSCLC, det har vist seg at flere molekylære karsinogenisitetsstudier veier eksistere som er mest sannsynlig relatert til kjønn og røykevaner [15]. Videre ble det vist at det er en stor overlapping mellom avvik som observeres i adenokarsinom og squamous cell carcinoma subtype, med unntak for 3Q gevinster som synes å være mer spesifikke for squamous cell carcinoma subtype [16]. Ulike genekspresjonssignaturer har vært korrelert til overlevelse av NSCLC pasienter [17] – [19]. I tillegg har molekylære studier tillot utvikling av personlig behandlingsmetoder i flere tumortyper, [20] – [22]. Det er imidlertid sannsynlig at mange kreftrelatert målgener ikke er blitt identifisert ennå. I denne forbindelse har integrert genom bred screening av kopitall endringer og genekspresjon ved å bruke mikro-rekker er nylig blitt utført i forskjellige tumortyper for å identifisere gener hvis ekspresjon blir påvirket av gen-dosering [4], [23] – [26]. Disse studiene tar sikte på å identifisere nye kreftrelaterte gener og å definere nye biomarkører for svar eller prognostiske signaturer. I både NSCLC og ductal kreft i bukspyttkjertelen, har to fokus presiseringer av 8p12 og 20q11 blitt studert i detalj fører til to kandidatgener (WHSC1L1 og TPX2) viktige i disse sykdommene [16]
Vi her utført en integrert genome wide screening av genkopitallet endringer og genekspresjon i 32 radikalt resekterte NSCLC, for å identifisere nye NSCLC-relaterte gener. Ved å bruke ACE-it, en roman informatikk verktøy for integrering av genet dosering og genuttrykk data, identifiserte vi 359 transkripsjoner å bli betydelig berørt av kopiantall. En cox overlevelsesanalyse på alle 359 gener viste ingen signifikant sammenheng etter flere tester. Topp liste av gener knyttet til overlevelse i hovedsak inkludert gener som ligger på opparbeidet regioner 3Q og 5p. Disse områdene dekker mange gener og å finne genet av størst betydning er en utfordrende oppgave. Videre undersøkelser bør belyse betydningen av disse genene i forhold til NSCLC, spesielt av de i topp liste over sammenheng med overlevelse som SLC45A2, WDR70 og NIPBL (se utfyllende tabell S1). I denne artikkelen har vi fokusert på tilbakevendende sletting på kromosom 14 og genet HSP90, som også var på topp liste over forhold med overlevelse og ikke tidligere undersøkt i detalj. Delesjon av området 14q32.2-33 ble korrelert med forbedret overlevelse, noe som igjen tyder på at det kan inneholde ett eller flere gener relatert til NSCLC progresjon. Sletting av denne regionen er blitt beskrevet tidligere av en gruppe rapportere genomiske aberrasjoner i NSCLC, men ble ikke undersøkt i nærmere detalj [27]. Ut av 109 gener kartlegging til 14q32.2-33 regionen, HSP90 var den eneste gen med betydelig lavere uttrykk hos pasienter som hadde den 14q32.2-33 sletting. I den første serie av 29 pasienter (3 pasienter som er utelatt fra overlevelsesanalyse), observerte vi forbedret overlevelsen hos pasienter med lavere nivåer av HSP90. Sammenhengen mellom HSP90 uttrykk nivåer og NSCLC pasient prognose ble bekreftet å være betydelig i tre uavhengige validerings sett med NSCLC pasienter. Multivariat analyse med scenen, histologi, alder og kjønn viste at HSP90 forble uavhengig relatert til overlevelse.
En kritisk faktor i å definere «lav» og «normal» uttrykk er valget av en passende avskåret verdi. I de innledende analysene brukte vi medianen av uttrykk forholdstall som kuttes mellom «lav» og «normal» uttrykk, siden lav risiko og høy risiko separasjon av pasientene var lik. Men i valideringen setter lav risiko og høy risiko overlevelsesgrupper ble ikke like balansert (to tredeler versus en tredjedel). Følgelig de avskårne verdiene som benyttes i disse datasettene var ikke medianverdien, men den 33-percentilen.
I denne studien, ved hjelp av et genom bred integrerende analyse av genet kopiantall og ekspresjonen vi var i stand til å identifisere ekspresjon av HSP90 som et viktig gen i tidlig stadium NSCLC pasienter. HSP90 er en anstand protein som er involvert i stabiliseringen av mange oncoproteiner slik som EGFR, Her-2 og Akt [28]. Nyere arbeider har vist at HSP90 spiller en rolle i å opprettholde den aktive konformasjon av EGFR og spesielt EGFR-mutanter [29], [30]. Vi viser her at flere NSCLC-cellelinjer som bærer villtype-EGFR er følsomme for HSP90 inhibering, noe som indikerer at den inhiberende effekt av 17-AAG ikke kan utelukkende tilskrives mutant EGFR. HSP90 har nylig blitt anerkjent som en potensiell kreft terapeutisk mål og undersøkelser av HSP90-hemmere er pågående [31], [32]. I denne forbindelse, glioblastom-celler overuttrykke EGFR, men resistente overfor inhibering av EGFR-kinase-hemmere, var følsomme for HSP90-inhibering [33]. Derfor, mens HSP90 kan være nødvendig for å stabilisere over uttrykt eller mutert EGFR, våre data støtter en mer omfattende og kompleks rolle for HSP90 i formidling NSCLC vekst og overlevelse. Den lave nanomolare følsomhet observert i 4 cellelinjene som ble testet i våre eksperimenter, er i overensstemmelse med andre publiserte rapporter om høyt 17-AAG sensitive tumorcellelinjer [34] – [36]. Disse konsentrasjonene er lett oppnåelig hos pasienter over lengre tidsperioder ved hjelp av dagens planlegging og doseringsregimer [37].
I sammendraget, den observasjon at HSP90 uttrykk nivå er en prognostisk faktor for NSCLC pasient overlevelse (uavhengig av EGFR mutasjonsstatus ), kombinert med den ekstreme følsomhet av EGFR villtype NSCLC-celler til HSP90-inhibitor som 17-AAG, antyder at HSP90-inhibitorer kan ha større klinisk anvendelighet i NSCLC enn tidligere har vært ansett for og garanterer videre undersøkelser av avhengigheten av andre proto-onkogener videre dette anstand protein i NSCLC.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
doi: 10,1371 /journal.pone.0001722.s001 plakater (0,03 MB PDF)
Takk
Vi takker europeiske lungekreft konsortium for å gi microarray genuttrykk data av 140 uavhengige NSCLC pasienter; Nederland Cancer Institute: Sjaak Burgers, Tony van de Velde; Medical University of Gdansk: Jacek Jassem, Amelia Szymanowska, Marcin Skrzypski, Barbara Szostakiewicz, Witold Rzyman; Medical University of Bialystok: Jerzy Laudanski, Miroslaw Kozlowski, Lech Chyczewski; Thoraxklinik Heidelberg: Michael Meister, Philipp A. Schnabel, Henrik Dienemann og Hans Hoffman. Vi gir også våre spesiell takk til Sjoerd Vosse (Avdeling for patologi, VU University Medical Center, Amsterdam, Nederland) for nyttige bioinformatikk diskusjoner og til Hans Gille (Institutt for klinisk genetikk, VU University Medical Center, Amsterdam, Nederland) for å utføre MLPA analyse.
