Abstract
bakgrunner
Uttrykk for Livin, et medlem av hemmere av apoptose protein familie, er assosiert med tumor utvikling og progresjon. Målet med denne studien var å vurdere om Livin påvirker onkogene biologiske oppførsel av kolorektal kreft celler, og å dokumentere sammenhengen mellom sitt uttrykk og ulike clinicopathological parametre i tykk- og endetarmskreft.
Metoder
Vi undersøkte virkningen av Livin på tumorceller atferd ved hjelp av små interfererende RNA og pcDNA3.1 vektor i SW480 og DKO1 kolorektal kreft cellelinjer. Ekspresjon av livin ble undersøkt ved hjelp av RT-PCR og immunhistokjemi i coloretcal cancervev. De apoptotiske celler ble visualisert ved TUNEL analysen, og proliferative celler ble visualisert ved Ki-67 antistoffet farging.
Resultater
knockdown av Livin trykt svulst celle migrasjon og invasjon i kolorektal kreftceller. Knockdown av Livin indusert apoptose ved opp-regulering av caspase-3, -7 og PARP-aktivitet og cellesyklus-stans ved å redusere cyklin D1, cyklin D3, cyklin-avhengig kinase 4 og 6, og ved å indusere p27 ekspresjon. MAPK signalkaskader ble betydelig blokkert av knockdown av Livin. I kontrast, overekspresjon av Livin forbedret tumor celle migrasjon og invasjon, og hemmet apoptose og cellesyklus arrest. Den midlere apoptotiske indeks (AI) verdien av Livin positive tumorer var signifikant lavere enn AI av Livin negative tumorer. Men det var ingen signifikant forskjell mellom Livin uttrykk og Ki-67-merkeindeksen (KI). Livin uttrykk ble betydelig økt i tykktarmskreft og metastatisk lymfeknute vev sammenlignet med vanlige tykktarmsslimhinnen og ikke-metastatisk lymfeknute vev og ble assosiert med tumor stadium, lymphovascular invasjon, lymfeknutemetastase og dårlig overlevelse.
Konklusjoner
Disse resultatene indikerer at Livin er knyttet til tumorprogresjon ved å øke svulst cellemotilitet og hemme apoptose i tykktarmskreft
Citation. Myung DS, Park YL, Chung CY, Park HC, Kim JS, cho SB, et al. (2013) uttrykk for Livin i tykktarmskreft og dens forhold til Tumor Cell Behavior og prognose. PLoS ONE 8 (9): e73262. doi: 10,1371 /journal.pone.0073262
Redaktør: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, USA
mottatt: 19 februar 2013; Godkjent: 19 juli 2013; Publisert: 02.09.2013
Copyright: © 2013 Myung et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning (0720570) fra National Research Development Program for Cancer Control, Ministry of Health Velferd, Republic of Korea. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er en av de viktigste årsakene til kreft-assosiert sykelighet og dødelighet i verden. Til tross for bevis for at 5-års overlevelse er 90% når kolorektal kreft er diagnostisert på et tidlig stadium, 40% av tilfellene er diagnostisert når kreften er fortsatt lokalisert [1]. Raske fremskritt i vår forståelse om de molekylære og biologiske egenskaper ved tykk- og endetarmskreft har gitt nyttig kunnskap inn i patogenesen av tykktarmskreft. Biomarkører er utviklet for å identifisere personer som vil dra mest nytte kreft overvåkning og styring [2-5]. Identifiying biomarkører som kan oppdage tykktarmskreft tidligere eller overvåke kreft progresjon ville muliggjøre tilpassing av medisin og forbedre overlevelse av pasienter med kreft.
De underliggende mekanismene for handling i kreft progresjon begynner å bli avslørt. De rapporterte molekylære og biokjemiske mekanismer som kan bidra til de fenotypiske endringer i favør av kreftutvikling, inkluderer hemmet apoptose, forbedret svulstcellevekst, økt invasivitet, forstyrrelse av celle adhesjon, fremming av angiogenese, og hemmet immun overvåking. Disse hendelsene kan bidra til utvikling og progresjon av kreft [6-8].
apoptose spiller en viktig rolle i mange biologiske hendelser, inkludert morphogenesis, cellefornyelsen og eliminering av skadelige celler. En forstyrrelse i apoptose kan gi en overlevelsesfordel på ondartede celler som genetiske endringer og dermed fremme kreft progresjon [9,10]. Den sentrale begivenhet i apoptose er den proteolytiske aktivering av en klasse av cystein-aspartyl-spesifikke proteaser, de caspaser. Initiator caspaser spalter effektor kaspaser, som i sin tur nedbryter en rekke intracellulære proteinsubstrater og derved induserer de karakteristiske morfologiske kjennetegn på apoptose [11]. Disse caspase aktiviteter er hemmet av hemmere av apoptose proteiner (IAP) familie. Inntil nå har åtte mennesker IAP blitt identifisert, inkludert c-IAP1, c-IAP2, NAIP, XIAP, ILP-2, BRUCE, Survivin og Livin [12]. Livin ble nylig identifisert til å være en ny anti-apoptotiske genet. Livin rekrutteres til døden reseptor signalkomplekser, der den hemmer aktiveringen av caspases ansvarlige for apoptose og beskytter cellene fra ulike pro-apoptotiske stimuli. Livin er forbundet med induksjon av onkogene fenotyper inkludert invasjon, motilitet, celleproliferasjon og inhibering av apoptose i humane kreftcellelinjer [13-16]. I tillegg er Livin uttrykk i de aller fleste av kreft hos mennesker forbedret og korrelert med kreftutvikling og progresjon [17-22]. Stanse av Livin genet ved hjelp av små interfererende RNA (siRNA) reduseres tumorvolumet ved å indusere apoptose i en xenograft modell av tykktarmskreft [23]. Derfor er Livin ansett som en potensiell terapeutisk mål for behandling av tykktarmskreft.
Formålet med denne studien var å vurdere om Livin påvirker onkogene biologisk oppførsel av menneskelige kolorektal kreftceller, for å evaluere Livin uttrykk i menneskelige kolorektal kreft vev, og for å undersøke korrelasjon av Livin med apoptose, tumor celleproliferasjon og clinicopathological funksjoner, inkludert overlevelse.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Denne studien ble godkjent av Institutional Review styret Chonnam National University Hwasun Hospital (Jeonnam, Korea). En skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver deltaker før vev oppkjøpet. Alle deltakerne ga skriftlig samtykke fra deres informasjon skal lagres på sykehuset database og brukes til forskning.
Pasienter og vevsprøver
Tjue kolorektal kreft vev og sammenkoblede normale tykktarm vev ble samlet av colonoscopic biopsi for RNA og proteinpreparater på Chonnam National University Hwasun Hospital. Formalinfiksert og parafin-embedded vevsprøver fra 161 tilfeldig utvalgte pasienter som hadde gjennomgått kirurgi for kolorektal kreft på Chonnam National University Hwasun Hospital mellom januar 2004 og desember 2004 ble oppnådd for immunhistokjemi. Ingen pasienter hadde gjennomgått preoperativ strålebehandling eller cellegift. Patologiske rapporter og kliniske historier på tidspunktet for operasjonen ble anmeldt i medisinske journaler. Vevsblokker ble valgt ved å se original patologiske lysbilder og velge blokker som viste krysset mellom normal kolon epitel og svulsten regionen. Svulster ble iscenesatt i samsvar med den amerikanske Joint Committee on Cancer staging system [24]. Overlevelse ble målt fra tidspunktet for operasjonen til oppfølging 31. desember 2010.
Cell kultur og siRNA transfeksjon
SW480 og DKO1 menneske kolorektal kreft cellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) og dyrket i DMEM (Hyclone, Loan, UT, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (Hyclone) i en fuktet inkubator ved 37 ℃ med en 5% CO
2 atmosfære. Livin og egge siRNA ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA) og Qiagen (Valencia, CA, USA), henholdsvis. Livin cDNA ble subklonet inn pcDNA3.1 vektor (Invitogen, Carlsbad, CA, USA). Livin byggingen ble verifisert ved sekvensering. Den spesifikke genet ble transfektert hjelp Lipofectamine
TM RNAiMAX og Lipofectamine
TM 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens anbefalinger, og deretter inkubert i 48 timer. I tillegg ble celler transfektert med pcDNA3.1 vektor selektivt behandlet med 5-fluorouracil (5-FU) (10 ug /ml, Choong-PCE, Chung-Nam, Korea) i 48 timer.
Omvendt transcription- polymerase chain reaction (RT-PCR)
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp Trizol reagens (Invitrogen) og revers-transkribert med MMLV transkripsjons reagenser (Invitrogen) i henhold til produsentens anbefalinger. PCR amplifikasjon av cDNA ble utført ved hjelp av gen-spesifikke primere og Go Taq
® DNA polymerase (Promega, Madison, WI, USA). De følgende spesifikke primere ble anvendt; Livin 5′-CACACAGGCCATCAGGACAAG-3 «/5′-ACGGCACAAAGACGATGGAC-3′; GAPDH 5»-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 «/5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3».
Western blotting
Cellelysater ble utarbeidet etter M-PER
® pattedyr Protein Extraction Reagent (Thermo, Rockford, IL, USA) med Halt
TM fosfatase hemmer og Halt
TM Proteasehemmer cocktail (Thermo). Totale proteiner ble elektrooverført på PVDF-membraner (Millipore, Billerica, MA, USA), og de spesifikke proteinene ble blottet med primært antistoff. Følgende antistoffer ble brukt: antistoffer mot Livin, X-kromosom bindende IAP (XIAP), Survivin og β-tubulin ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA). Antistoffer mot ekstracellulære signalregulerte kinase (ERK), fosfor-ERK, p38, og fosfor-p38, c-Jun NH
2-terminal kinase (JNK), fosfor-JNK, fosfor-Akt, Akt, fosfor-p65 , spaltes caspase (3, 7 og 9), spaltet poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), cyklin-avhengig kinase 4 (CDK4), CDK6, cyklin D1, cyklin D3, cyklin B1, p21, p27, p57, p15, p16 og andre mitokondrier-avledet aktivator av caspases /direkte IAP bindende protein med lav pI (SMAC /DIABLO) ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Immunreaktive proteiner ble visualisert ved den forbedrede chemiluminescence deteksjonssystem HRP-substrat (Millipore) og LAS-4000 lysende bilde analysator (Fujifilm, Tokyo, Japan).
Cell invasjon analysen
Invasive evne ble beregnet med antall celler som passerte gjennom Transwell filterkamrene (Corning Inc., Corning, NY, USA) med 8 um porer. Transwell Filtrene ble belagt med 1% gelatin over natten og tørket ved romtemperatur (RT). Celler ble sådd på levedyktige celler av 2 x 10
5 i 0,2% BSA medium i det øvre kammer. Human plasma fibronektin (Calbiochem, La Jolla, CA, USA) ble tilsatt som en kjemoattraktant til 0,2% BSA mediet i det nedre kammer. Etter en 24 timers inkubering ble invaderte celler på den nedre overflate av Transwell farget med Diff-Quik løsning (Sysmex, Kobe, Japan) og telles i fem utvalgte områder under et lysmikroskop. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik for antallet celler /felt i tre individuelle eksperimentene.
Cellemigrering assay
Den cellemigrering Analysen ble utført ved bruk av kultur-innsatser (2 x 0,22 cm
2; Ibidi, Regensburg, Tyskland). For å lage et sår gap, ble cellene sådd i Kultur-innlegg, som ble forsiktig fjernet etter en 24 timers inkubasjon ved hjelp av sterile pinsetter. Fremdriften for sårheling ble fotografert med en invertert mikroskop. Avstanden mellom hullene ble normalisert til 1 cm etter fangst fra tre tilfeldige steder.
Celleviabilitet
Celleviabilitet ble bestemt med EZ-CyTox (tetrazoliumsalter, WST-1) celleviabilitet analyse kit (Daeil Lab Inc., Seoul, Korea). Etter bruk av WST-1 reagens ved 37 ℃, ble celleviabilitet målt ved hjelp av en mikroplateleser (Infinite M200, Tecan, Austria GmbH, Wien, Østerrike) med Magellan V6 dataanalyse programvare (Tecan). Triplikate brønner ble anvendt for hvert forsøk og alle eksperimenter ble utført minst tre ganger.
Strømningscytometrisk analyse
Transfekterte celler ble trypsinert, oppsamlet i PBS og resuspendert i 1 x bindingsbuffer (BD Biosciences , San Diego, CA, USA). Cellesuspensjoner ble inkubert i APC Annexin V og 7-amino-actinomycin D (BD Biosciences) ved romtemperatur. For den cellesyklusanalyse, ble cellene inkubert i 10 ug /ml ribonuklease A (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) og 50 ug /ml propidiumjodid (PI) ved romtemperatur i mørket. Befolkningen i Annexin-V-positive celler og cellesyklus fase ble analysert ved hjelp av en BD Cell quest
® versjon 3.3 instrument (Becton Dickinson, San José, California, USA) og WinMDI versjon 2.9 software (The Scripps Research Institute, San Diego, CA, USA).
Immunohistochemistry
Parafin vevssnitt fra pasienter ble deparaffinized, rehydrert og hentet med henting buffer. Vevene ble behandlet med et peroksidase-blokkeringsløsning (Dako, Carpinteria, CA, USA) for å blokkere endogen peroksidase-aktivitet og ble inkubert med polyklonalt kanin-anti-humant livin i primær fortynningsløsning (Invitrogen) over natten ved 4 ° C. Etter vasking i TBST, ble vevene farget ved hjelp av Dako, Fast
TM Envision HRP /DAB deteksjonssystem (Dako). Farget vev ble sett og fotografert under et lysmikroskop.
Evaluering av Livin uttrykk
immunostained prøvene ble vurdert uavhengig av to observatører uten kjennskap til clinicopathological data. Hvis det var en forskjell, er en konsensus nådd etter videre evaluering. Intensiteten av positive cancerceller ble gradert på en skala på fire: 0, ingen farging av kreftceller; 1, svak flekker; 2, moderat farging; 3 sterk farging. Prosentandelen av farget kreftceller ble også gradert på en skala fra fire: 0, none; 1, 10%; 2, 10-50%; 3, 50%. Intensiteten vurdering ble multiplisert med prosent flekken fra å få en samlet poengsum. Gjennomsnittlig samlet poengsum for de 161 svulster som ble analysert var 4,0. Dermed ble den gjennomsnittlige total poengsum på 4,0 valgt som cut-off point for kresne Livin uttrykk status. Prøver med en poengsum . 4 ble sett på som positiv, og de med en score ≤ 4 ble sett på som negativt uttrykk
Vurdering av tumor celleproliferasjon
prolifererende tumorceller ble visualisert ved farging immunohistochemically ved hjelp av et anti-Ki-67-antistoff (MIB-1; fortynnet 1: 150, Dakopatts, Glostrup, Danmark). Tydelig atom Ki-67 immunoreaktivitets ble ansett positiv. Ki-67-merkeindeksen (KI) blir presentert som antall Ki-67-positive kjerner /1000 tumorcellekjerner. KI har blitt brukt til å estimere den proliferative evne til kreftceller.
Terminal deoksynukleotidyltransferase (TdT) -mediert deoxyuridine trifosfat (dUTP) nick slutten merking (TUNEL) assay
apoptotiske celler og organer var oppdaget ved hjelp av blindgaten
TM Colorimetric TUNEL System (Promega, Madison, WI, USA), i henhold til produsentens protokoll. Kort fortalt ble vevssnitt avvokset og hydrert gjennom en gradert alkohol serien. Permeabilization ble så utført i proteinase K-løsning i 15 min. Merkingen ble utført ved å tilsette enzymet TdT reaksjonsblandingen til vevssnitt på skinnene i 60 minutter i en 37 ℃ fuktet kammer. Merkede celler ble utviklet ved hjelp av streptavidin HRP og 3,3-diaminobenzidin enzymsubstrat. En kvantitativ metode for beregning av apoptotiske celler ble brukt av to uavhengige patologer. Alle seksjonene ble undersøkt under høy effekt felt (forstørrelse på 40 x 10). Feltene ble valgt i høyeste merket område for hvert enkelt tilfelle. Den apoptotiske indeks (AI) ble uttrykt som antall positive kjerner inkludert apoptotiske legemer blant 1000 tumorcellekjerner.
Statistisk analyse
Data fra minst tre uavhengige eksperimenter ble brukt til å sammenligne mellom grupper . Data er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik. Elevens
t
-test ble benyttet for å bestemme statistisk signifikans for de intergruppe sammenligninger. Den χ
2-testen og Fishers eksakte test, der det er hensiktsmessig, ble brukt til å sammenligne Livin uttrykk med ulike clinicopathological parametere. Sammenhengene mellom Livin uttrykk og KI eller AI ble evaluert av studentens
t
-test. Estimat overlevelse av pasienter med positiv eller negativ Livin uttrykk ble evaluert i henhold til Kaplan-Meier-metoden, og forskjellene ble testet med en log-rank test. Statistisk Package for Social Sciences (SPSS /PC + 15,0, Chicago, IL, USA) ble brukt for alle analyser. En p-verdi 0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
Virkningen av Livin på invasjon, migrasjon og spredning av menneskelige kolorektal kreft celler
For å undersøke funksjonen av Livin på onkogene biologisk atferd kolorektal kreftceller, livin siRNA eller pcDNA3.1-livin ble brukt til å styre den endogene livin genekspresjon i SW480 og DKO1 humane kolorektale cancercellelinjer. Livin genuttrykk i alle testede celler, viste en spesifikk nedgang på mRNA og proteinnivåer ved transfeksjon av Livin siRNA og en spesifikk økning av transfeksjon av pcDNA3.1-Livin. Antallet invaderende Livin siRNA-transfekterte SW480 og DKO1 celler var 30,2 ± 3,1 og 55,3 ± 11,0, mens 51,8 ± 9,5 og 115,3 ± 10,3 celler ble observert for egge siRNA-transfekterte celler. Celler ble målt i seks tilfeldige 0,5 x 0,5 mm
2 mikroskopiske felt ved hjelp av 10 pg /ml fibronektin som et kjemotiltrekkende. Forskjellen mellom de to celletyper var signifikant (p = 0,015 og p 0,001, respektivt). I motsetning til dette ble antallet invaderende celler signifikant økt i pcDNA3.1-livin transfektert SW480 og DKO1 celler sammenlignet med tom-pcDNA3.1 transfekterte celler (p = 0,024 og p = 0,012, henholdsvis) (figur 1A). Den kunstige såret gap i plater av egge siRNA-transfekterte celler ble betydelig smalere enn i Livin siRNA-transfekterte celler på 48 timer i SW480 og ved 24 timer i DKO1 celler (p = 0,012 og p = 0,016, henholdsvis). Den kunstige sår gap i pcDNA3.1-livin transfektert SW480-celler ble betydelig smalere enn den i tom-pcDNA3.1 transfekterte celler ved 24 og 48 timer (p = 0,034 og p = 0,008, henholdsvis) (figur 1B). Analysen celleformering ble utført ved 2, 3, 4, og 5 dager etter transfeksjon av livin siRNA eller pcDNA3.1-livin for å få tilgang til potensialet for livin på celleproliferasjon. Prolifererende celler, som bestemt ved absorbans, redusert vesentlig i de livin siRNA-transfekterte SW480-celler sammenlignet med de kodede siRNA-transfekterte celler ved 3, 4 og 5 dager (p = 0,005, 0,001 og 0,022, respektivt), men ingen signifikant forskjell ble observert i DKO1 celler. I tillegg, i alle testede celler, var det ingen signifikant forskjell på celleproliferasjon mellom pcDNA3.1-Livin og tom-pcDNA3.1 transfekterte celler (figur 1C).
(A) Virkningen av Livin på invasjonen av kolorektal kreftceller. Invasjonen analysen ved hjelp av siRNA eller pcDNA3.1-transfekterte celler ble utført. Farget invaderende celler ble tellet, og er representert som en graf mellom gruppene. Antallet LS-transfekterte celler som invaderte var signifikant lavere enn den til SS-transfekterte celler. Antallet av invaderende celler som var signifikant høyere i LV-transfekterte celler sammenlignet med EV-transfekterte celler (gjennomsnitt ± standardavvik [SE], n = 6; * p 0,05). (B) Virkningen av Livin på migrasjon av kolorektal kreft celler. Den sårheling analysen bruker siRNA eller pcDNA3.1-transfekterte celler ble utført og grafer av cellevandring vises som relative helbredende avstander. Cellemigrasjon ble betydelig forstyrret i LS-transfekterte SW480 og DKO1 celler og økt i LV-transfekterte SW480 celler (gjennomsnitt ± SE, n = 3; * p 0,05). (C) Virkningen av Livin på spredning av kolorektal kreft celler. Absorbansen indikerer prolifererende levedyktige celler ble redusert i LS-transfekterte SW480-celler, men det var ingen signifikant forskjell av celleproliferasjon mellom LV og EV transfekterte celler (gjennomsnitt ± SE, n = 3; * p 0,05). SS; rykke siRNA, LS; Livin siRNA, EV; Tom-pcDNA3.1, LV; pcDNA3.1-Livin.
Virkningen av Livin på apoptose i menneskelige kolorektal kreft celler
Vi utførte flowcytometrisk analyser for å evaluere virkningen av Livin på apoptose. Cellen apoptotiske rente indusert av transfeksjon av Livin siRNA økt betydelig, sammenlignet med indusert av transfeksjon av egge siRNA (6,9
vs.
19,6%) i SW480 celler, men Livin knockdown hadde en minimal påvirkning på apoptose (11,3
vs.
16,7%) i DKO1-celler (figur 2A). 5-FU er vel kjent for å indusere apoptose og påvirke cellesyklus av kreftceller. Overekspresjon av Livin ved transfeksjon av pcDNA3.1-Livin hemmet apoptose av SW480 celler som respons på 5-FU, men overekspresjon av Livin hadde en minimal innflytelse på apoptose i DKO1 celler (figur 2A). Vi undersøkt videre caspase-spesifikke aktiviteter for å bestemme aktivering av caspases under knockdown og overekspresjon av Livin. Spaltes caspases-3 og -7 og PARP uttrykk ble oppregulert i SW480 og DKO1 celler etter Livin knockdown og nedregulert etter overekspresjon av Livin (figur 2B). Som vist i figur 2C, ble det Survivin proteinnivået redusert på grunn av livin knockdown i SW480 og DKO1 celler, men XIAP og SMAC /DIABLO proteinnivåer ble ikke endret som reaksjon på livin knockdown. I tillegg ble det Survivin, XIAP og SMAC /DIABLO protein nivåer ikke endret etter overekspresjon av Livin.
(A) Andelen av apoptotiske celler indusert av transfeksjon av LS var større enn det indusert av transfeksjon av SS (6,9 vs. 19,6%) i SW480 celler, men livin knockdown hadde en minimal innflytelse på apoptose (11,3 vs. 16,7%) i DKO1 celler. Overekspresjon av Livin ved transfeksjon av LV inhiberte apoptose av SW480-celler som respons på 5-FU, men overekspresjon av livin hadde en minimal innflytelse på apoptose i DKO1-celler (B) Ekspresjon av spaltet caspase-3, -7, -9, og PARP proteiner. Den caspase-3, ble -7 og PARP uttrykk økt i SW480 og DKO1 celler etter Livin knockdown, og sank etter overekspresjon av Livin (C) Uttrykk for apoptose regulatoriske proteiner. Survivin proteinnivået sank etter Livin knockdown i SW480 og DKO1 celler, men XIAP og SMAC /DIABLO proteinnivåene ble ikke endret som svar på Livin knockdown. I tillegg ble Survivin, XIAP og SMAC /DIABLO protein nivåer ikke endret etter overekspresjon av Livin. PARP; Poly (ADP-ribose) polymerase, XIAP; X-kromosom bindende IAP, SMAC /DIABLO; andre mitokondrier-avledet aktivator av caspases /direkte IAP bindende protein med lav pI, SS; rykke siRNA, LS; Livin siRNA, EV; Tom-pcDNA3.1, LV; pcDNA3.1-Livin, 5-FU; 5-fluorouracil, 7-AAD; 7-amino-actinomycin D.
Virkningen av Livin på cellesyklus arrest i menneskelige kolorektal kreft celler
Vi utførte flowcytometrisk analyser for å avdekke om Livin kunne endre cellesyklus distribusjon. Livin knockdown resulterte i cellesyklus-stans i G0 /G1 fase av SW480-celler og S-fasen av DKO1-celler (figur 3A). 5-FU behandling indusert cellesyklus arrest i subG1 fasen av SW480 og G0 /G1 fasen av DKO1 celler. Overekspresjon av Livin hemmet 5-FU-indusert cellesyklus arrest i SW480 celler og hadde en minimal innflytelse i DKO1 celler (figur 3A). Neste, vi evaluert effekten av Livin på ulike CDK-hemmere (CDKIs) som er involvert i cellesyklus arrest i menneskelige kolorektal kreftceller. Som vist i figur 3B, økt p27-proteinet nivå betydelig ved livin knockdown, og redusert med overekspresjon av livin i SW480 og DKO1 celler. Imidlertid ble p21, p57, p15 og p16 protein nivåer ikke endret som følge av knockdown og overekspresjon av Livin. Cykliner og CDK er negativt regulert av CDKIs. Derfor, undersøkte vi effekten av livin på uttrykt nivåer av cyklin D1, cyklin D3, cyklin B1, CDK4 og CDK6. Som vist i figur 3C, cyklin D1, cyklin D3, CDK4, CDK6 og proteinnivåer ble signifikant redusert ved livin knockdown, og økte cyklin D1 CDK4 og ved overekspresjon av livin i SW480 og DKO1 celler.
( A) livin knockdown resulterte i cellesyklus-stans i G0 /G1 fase av SW480-celler og S-fasen av DKO1 celler. 5-FU behandling indusert cellesyklus arrest i subG1 fasen av SW480 og G0 /G1 fasen av DKO1 celler. Overekspresjon av Livin hemmet 5-FU-indusert cellesyklus arrest i SW480 celler og hadde en minimal innflytelse i DKO1 celler. Ett representativt eksperiment av de tre uavhengige eksperimenter er vist. (B) Ekspresjon av cyklin-avhengig kinase (CDK) inhibitor proteiner. Den p27 protein nivået var signifikant økt med Livin knockdown og redusert med overekspresjon av Livin i SW480 og DKO1 celler. Imidlertid ble p21, p57, p15 og p16 protein nivåer ikke endret som følge av knockdown eller overekspresjon av Livin. (C) Ekspresjon av cykliner og cyklin-avhengige kinase (CDK) proteiner. Cyclin D1, cyclin D3, CDK4 og CDK6 proteinnivåer ble signifikant redusert med Livin knockdown og økt cyclin D1 og CDK4 ved overekspresjon av Livin i SW480 og DKO1 celler. SS; rykke siRNA, LS; Livin siRNA, EV; Tom-pcDNA3.1, LV; pcDNA3.1-Livin.
Virkningen av Livin på intracellulære signalveier involvert i apoptose og cellesyklus arrest i menneskelige kolorektal kreft celler
Vi har studert effekten av Livin på stimulering av intracellulære signalveier som fører til apoptose og cellesyklus arrest i SW480 og DKO1 celler til å utforske mulige mekanismene som er involvert i apoptose og cellesyklus arrest. Fosforyleringen nivåer av ERK1 /2, JNK og p38 ble nedregulert i Livin knockdowned SW480 og DKO1 celler (figur 4). Men Akt og P65 fosforylering nivåer forble uendret etter Livin knockdown. I tillegg ERK1 /2, JNK, p38, Akt og p65 fosforylering nivåer forble uendret ved overekspresjon av Livin.
fosforyleringen nivåer av ERK1 /2, JNK og p38 redusert følgende Livin knockdown av SW480 og DKO1 celler. Men Akt og p65 fosforyleringen nivåer viste ingen endring etter Livin knockdown. I tillegg ERK1 /2, JNK, p38, Akt og p65 fosforylering nivåer ble ikke endret ved overekspresjon av Livin. SS; rykke siRNA, LS; Livin siRNA, EV; Tom-pcDNA3.1, LV; pcDNA3.1-Livin.
Livin uttrykk i menneskelig tykktarmskreft og metastatisk lymfeknute vev
For å bekrefte resultatene av kolorektal kreft cellelinje studier, vi evaluert Livin uttrykk på RNA og proteinnivåer ved RT-PCR, Western blotting og immunhistokjemi i menneskelige kolorektal kreft vev, sammen normal kolorektal slimhinne, og metastatisk og ikke-metastatisk lymfeknute vev av samme pasientene hentet fra colonoscopic biopsi og kirurgiske prøver. I de colonoscopic biopsiprøver, bekreftet vi oppregulering av livin-ekspresjon i kreftvev, sammenlignet med den i sammenkoblet normal slimhinne på RNA og proteinnivåer (p = 0,035 og p = 0,020, henholdsvis) (figur 5A, B). I parafin vevssnitt, Livin protein ikke eller bare svakt immunostained i normal kolorektal slimhinne (Figur 6A). Farging av livin protein ble hovedsakelig funnet i kjernen av kreftcellene, men var ikke påvisbart i tumoren stroma (figur 6A). Farging av Livin i metastatisk lymfeknute vev var betydelig sterkere enn i ikke-metastatisk lymfeknute vev (Figur 6b). Den totale poengsummen for Livin farging med metastatisk lymfeknute vev var betydelig høyere enn i ikke-metalymfeknute vev (
P
0,001) (figur 6C)
(A) Livin mRNA uttrykk. (B) Livin protein uttrykk. Uttrykk for Livin er oppregulert i kreftvevet i forhold til paret normal slimhinne på mRNA og proteinnivåer i friske colonoscopic biopsiprøver. Hver søyle representerer gjennomsnitt ± SE av 20 tilfeller. * P 0,05 versus normal kolorektal slimhinne. T; kolorektal kreft vev, N; paret normal kolorektal slimhinne.
(A) Livin protein ble hovedsakelig immunostained i kjernen av kreftceller, men ikke eller bare svakt immunostained i normal kolorektal slimhinne (× 100). (B) farging av Livin i metastatisk lymfeknute vev var betydelig sterkere enn i ikke-metastatisk lymfeknute vev (× 100). (C) Den totale poengsummen for Livin farging med metastatisk lymfeknute vev var betydelig høyere enn i ikke-metastatisk lymfeknute vev (* p 0,001). T; kolorektal kreft vev, N; paret normal kolorektal slimhinne, NL; ikke-metastatisk lymfeknute vev, ML; metastatisk lymfeknute vev.
Korrelasjon mellom Livin uttrykk og tumor celleproliferasjon og apoptose i humane kolorektal kreft
Ki-67 immunoreaktivitets ble hovedsakelig funnet i kjernen av kreftceller (figur 7A ). Den KI for 161 svulster varierte 21,9 til 85,6 med en midlere KI på 52,8 ± 15,1. Det ble ikke observert noen signifikant forskjell mellom livin uttrykk og Kl (p = 0,504) (tabell 1). Standard morfologiske kriterier for apoptotiske celler ved anvendelse av TUNEL-analysen er tilstedeværelse av perler eller krympet kromatin og apoptotiske legemer med en klar halogen (figur 7B). AI 161 svulster varierte 0,6 til 30,0 med en midlere AI på 8,8 ± 5,6. Den midlere verdi av AI Livin-positive tumorer var 6,4 ± 3,7, som var betydelig lavere enn den AI av livin-negative tumorer (p = 0,009) (tabell 1).
(A) Farging av Ki-67 . Farging av Ki-67 viser sterke kjerne positivitet i kreftcellene, men er sjelden positivt i normal kolorektal slimhinne (× 200). (B) Påvisning av apoptotiske celler (pil) etter TUNEL farging. Apoptotiske celler med klassiske trekk ved DNA kondens er vist å ha en glorie som består av pyknotic kjernen og krympet cytoplasma (pil hode) i kolorektal kreft vev men TUNEL farging er ikke positivt i normal kolorektal slimhinne (× 400). TUNEL, terminal deoksynukleotidyltransferase (TdT) -mediert deoxyuridine trifosfat (dUTP) nick slutten merking. T; kolorektal kreft vev, N; paret normal kolorektal slimhinne.
Indekser Totalt (n = 161)
Livin uttrykk
p-verdi
Negative (n = 86)
positiv (n = 75)
KI (Mean ± SD) 52,8 ± 15.151.1 ± 14.754.3 ± 15.60.504AI (Mean ± SD) 8,8 ± 5.611.3 ± 6.46.4 ± 3.70.009Table 1 . Korrelasjoner mellom Livin uttrykk og tumor celleproliferasjon og apoptose i kolorektal kreft
KI, Ki-67-merkeindeksen.; AI, apoptotisk indeks;
