Abstract
epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) tyrosinkinasehemmere (TKI), for eksempel gefitinib, har vist seg å effektivt hemme proliferasjonen av en undergruppe av ikke-små-celle lungekreft (NSCLC). Dessverre, de fleste av NSCLC uttrykker villtype EGFR er primært motstandsdyktig mot EGFR-TKI behandling. Her viser vi at spredning av den gefitinib-resistente cellelinjer NSCLC H460 og A549 reduseres med lite molekyl SecinH3 som indirekte demper EGFR aktivering ved inhibering av cytohesins, en klasse av nylig oppdaget cytoplasmiske EGFR-aktivatorer. SecinH3 og gefitinib viste en synergistisk antiproliferativ effekt, som korrelert med en dyp hemming av Akt aktivering og Survivin uttrykk. Behandling av mus med H460 xenografter med SecinH3 viste antiproliferative og pro-apoptotisk effekt av SecinH3 in vivo. Våre data tyder på at målretting EGFR indirekte ved å hemme dets cytoplasmatiske aktivatorer, de cytohesins, har potensial til å forbedre behandlingen av primært EGFR-TKI resistent lungekreft
Citation. Bill A, Schmitz A, König K, Heukamp LC, Hannam JS, Famulok M (2012) Anti-proliferativ effekt av Cytohesin Hemming i Gefitinib-Resistant lungekreft celler. PLoS ONE syv (7): e41179. doi: 10,1371 /journal.pone.0041179
Redaktør: Anna Maria Delprato, BioScience Project, USA
mottatt: May 15, 2012; Godkjent: 18 juni 2012; Publisert: 18.07.2012
Copyright: © 2012 Bill et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Deutsche Forschungsgemeinschaft og Samarbeids Forskning Senter 645 (SFB 645). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Dr. Schmitz og Dr. Famulok er medeiere i et patent på lite molekyl cytohesin hemmere med tittelen «bruk av cytohesin hemmere for kjemisk induserende levetid» (WO2008058995, USA 20100048594). Dr. Famulok er co-oppfinner på en patentsøknad med tittelen «Cytohesin hemmere» (den europeiske patentsøknad EP2286808 (WO2006053903). Dette ikke endrer forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
innføringen av epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR) tyrosinkinase-inhibitorer (TKI) inn i terapi av ikke-små-celle lungekreft (NSCLC) som bærer aktiverende mutasjoner i EGFR har forskjøvet seg til behandling paradigmet fra en kjemoterapeutiske til en målrettet tilnærming. Dessverre, bare 20 prosent av adenokarsinomer i lungene bjørnen aktiverende mutasjoner i EGFR og reagerer på EGFR-rettet behandling. Videre pasienter under EGFR-målrettet TKI terapi utvikle sekundær resistens under behandling. mutasjoner i EGFR spill en avgjørende rolle i responsen av svulsten til EGFR-rettet behandling. Aktivering mutasjoner, særlig i eksoner 19 og 21, er prediktiv for en gunstig første reaksjon til EGFR-TKI [1], [2], [3]. Tvert imot, mutasjon av den såkalte gatekeeper stilling i det ATP-bindende lomme av EGFR kinase domene, det vil si erstatning av treonin 790 av metionin, gjør cellene resistente [4], [5], [6]. Gatekeeperen mutasjonen er den vanligste årsak til utvikling av sekundær motstand av responderende tumorer. Flertallet av NSCLCs uttrykker villtype-EGFR og er derfor i første rekke motstandsdyktig mot EGFR-TKI [7]. Omtrent 25% av disse NSCLCs bærer en mutert form av Ras proto-onkogen, KRAS G61H eller G12V, og tilstedeværelsen av denne mutasjon er en nesten umiskjennelig indikator på resistens mot EGFR-målrettet terapi [8]. Ikke desto mindre, in vitro studier ved bruk av siRNA-mediert knock-down av EGFR indikerer at proliferasjonen av NSCLC-celler som uttrykker villtype-EGFR og peiling mutert KRAS er fortsatt avhengig i noen grad av EGFR [9], [10], [11 ], [12] som tyder på at EGFR-TKI-resistente celler er ikke helt uavhengig av EGFR og at derfor rettet mot EGFR ved andre enn TKI kan føre til redusert spredning, selv i EGFR-TKI-resistente celler midler. Her viser vi at behandling med SecinH3 av NSCLC-cellelinjer som uttrykker villtype-EGFR demper EGFR-aktivering og signalering, reduserer spredning av cellene in vitro og in vivo, og gjør dem mottakelige for EGFR-TKI gefitinib. Som SecinH3 hemmer cytoplasmatiske EGFR aktivatorer av cytohesin familien [13] våre data tyder på at målretting EGFR indirekte ved å hemme sine aktivatorer kan representere en lovende tilnærming for å utvikle EGFR-målrettet terapi for de fleste NSCLCs som ikke uttrykker mutant EGFR.
Materialer og metoder
Material
SecinH3, Secin16 og XH1009 ble syntetisert som beskrevet [14], [15], gefitinib ble kjøpt fra Biaffin. H460 og A549-celler var fra ATCC og dyrket i RPMI 1640 (PAA) med 10% føtalt kalveserum (Lonza). Identiteten av cellelinjene ble bekreftet ved slutten av forsøksperioden basert på mikro genotyping av den cellelinje ECACC Identity bekreftelse tjenesten. STR profiler matchet profilene til cellelinjene som deponert i ATCC og ECACC STR databaser.
Proliferation Assay
3 × 10
3 celler per 96well ble sådd på en klar, flat bunn 96well plate (TPP). Etter 24 timer ble cellene behandlet med de angitte konsentrasjoner av inhibitorer eller løsningsmiddel (endelig DMSO-konsentrasjon 0,4%) i RPMI inneholdende 50 ng /ml EGF eller IGF-1 (Peprotech), respektivt. Mediet ble skiftet daglig i 3 dager og celleproliferasjon ble analysert med et 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) assay (Promega) som beskrevet i produsentens protokoll ved anvendelse av en Varioscan mikroplateleser (Thermo Scientific). Alle analyser ble utført i det minste i tre paralleller. For beregning av den relative spredning hastighet, den midlere absorbans i DMSO-behandlede celler ble satt til 1.
Colony Forming Assay
klonogene vekstanalyser ble utført som beskrevet [16]. I korthet, 3000 celler /brønn ble sådd ut i seks-brønns plater, tillates å overholde over natten og ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av forbindelse eller DMSO i 72 timer. Celler ble forskyves utsådd i seks-brønns plater og dyrket i 7 til 10 dager i normale vekstmedia. Koloniene ble farget med 0,1% Coomassie, 10% eddiksyre, 30% metanol i PBS og analysert ved hjelp av en Odyssey nær-infrarød skanner (LI-COR biovitenskap).
Tumor Xenotransplantat
Alle dyr prosedyrer var i samsvar med de tyske lovene for dyrevern og ble godkjent av den lokale dyrevernutvalget og de lokale myndighetene (Bezirksregierung Köln, Tyskland). Svulster ble samlet ved s. c. injeksjoner av 5 x 10
6 H460 celler i nu /nu athymiske hannmus. Etter tumor etablering mus ble randomisert i to grupper, kontroll (kjøretøy) og SecinH3-behandlede mus. Mus ble behandlet ved daglig i. s. injeksjoner (100 ul 2,5 mM SecinH3 i 50% DMSO /50% isoton glukoseløsning eller bærer). Tumor volum ble målt daglig og beregnes ved hjelp av formelen:
D
L
= større diameter;
D
S
= mindre diameter.
tunel Analysen ble utført i henhold til produsentens manual (ApopTag Plus Peroxidase In Situ apoptose Kit, Merck Millipore).
kløyvet caspase 3 ble bestemt ved immunhistokjemi på formalinfiksert og parafininnebygde deler vev ved hjelp av et antistoff spesifikt for kløyvde caspase 3 (1:750, Cell Signaling Technology) etter antigen gjenfinning ved pH 6 som beskrevet [17].
A, strukturer av inhibitorene som anvendes i denne studien. B – C, spredning av A549 (B) og H460 (C) celler ble bestemt ved MTT-assay i nærvær av de angitte inhibitorer. ***, P. 0,001 forhold til DMSO-behandlede celler
immunoblotter
Celler ble serum-sultet over natten i nærvær av den indikerte inhibitor eller DMSO (endelig DMSO konsentrasjon 0,4 %). Mediet og hemmere ble oppdatert 1 time før stimulering. Stimulering ble i 5 minutter med 50 ng /ml EGF eller IGF-1, respektivt. Celler ble lysert i lyseringsbuffer (20 mM Tris-Cl, pH 7,5 /150 mM NaCl /1 mM EDTA /1 mM EGTA /2,5 mM natriumpyrofosfat /1 mM β-glycerofosfat /1 mM natriumvanadat /1% Triton X-100 ) supplert med protease-inhibitor-blanding HP (Serva). Normaliserte mengder protein ble separert ved 6% SDS-PAGE og overført på nitrocellulose. Følgende antistoffer ble brukt: Pakt (Thr473) (Cell Signaling Technology), pEGFR (Tyr1086) (Epitomics), pIRS1 (Tyr612) (Life Technologies), EGFR, survivin, p27 (Santacruz Biotechnology), Hsc70 (Enzo Life Sciences). Deteksjon ble utført på en reise skanner ved hjelp av DyLight800 merkede sekundære antistoffer (Thermo Scientific)
-. B, proliferasjon av H460-celler i nærvær av gefitinib eller SecinH3 alene eller i kombinasjonen ble bestemt ved MTT-assay ( A) eller ved kolonidannelsesbestemmelsen (B). I A gi numrene den relative verdien av proliferasjon med ubehandlede celler som angitt 1. Spredning anta en additiv effekt av SecinH3 og gefitinib (forventet) blir sammenlignet med verdien funnet ved forsøkene (observert). Observerte verdier under de forventede verdier indikerer synergisme
-. C, H460 celler ble behandlet over natten med en mikrometer gefitinib, 15 mikrometer SecinH3 eller deres kombinasjon. A, uttrykk for p27Kip og survivin ble analysert ved western blot. B, C, Statistisk evaluering av den vestlige blot data vist i A. ** i B indikerer p 0,01 i forhold til DMSO-behandlede kontroller, samt å gefitinib-behandlede celler. *** I C indikerer p 0,001 forhold til DMSO-behandlede kontroller. n = 3.
A – D, serum-sultet-celler ble stimulert med EGF i 5 minutter og analysert ved western blot for aktivering av de angitte proteiner. A, representant Western blot. B – D, Statistisk evaluering av fosforylering av EGFR (B), IRS1 (C), og Akt (D) i EGF-stimulerte H460-celler i nærvær av gefitinib, SecinH3, eller en kombinasjon av begge inhbitors. p angir den fosforylerte, dvs. aktivert form av proteinet. Signalene ble normalisert for lasting kontroll Hsc70. Feilstolpene gi standard feil. *, P 0,05, **, p 0,01, ***, p 0,001 forhold til EGF-behandlede celler med unntak av de sammenligninger som er godkjent av brak
statistikker
Resultatene er gitt som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet (SEM). Statistiske analyser ble utført med Prism (GraphPad programvare) anvende enveis ANOVA med Tukeýs post-test for in vitro-forsøk og t-test for xenografter. Forskjeller av midler ble ansett som signifikant på et signifikansnivå på 0,05.
Resultater
NSCLC celler som uttrykker Wild-type EGFR Svare på SecinH3
Selv om NSCLC celler som uttrykker villtype EGFR ikke svare på klinisk relevante konsentrasjoner av EGFR-TKI deres spredning synes å avhenge til en viss grad på EGFR-signalering som har blitt vist av EGFR-knockdown eksperimenter [9], [10], [11], [12]. Derfor spurte vi om spredning av NSCLC cellelinje A549, som uttrykker villtype EGFR og Kras med aktiverende mutasjon G12S ble påvirket av å behandle cellene med SecinH3 (Fig. 1a). SecinH3 er en cytohesin inhibitor [14], [15], og ikke inhiberer tyrosinkinase-aktiviteten av EGFR direkte [13]. Cytohesins har lenge vært kjent som guanin nukleotid-utvekslingsfaktorer for små G-proteinene i ARF familien [18], men det er nylig blitt vist å bidra til EGFR-aktivering [17]. Mekanismen for cytohesin-mediert EGFR aktivering, som er foreløpig ukjent i detalj, innebærer direkte interaksjon av cytohesins med EGFR, er ARF-uavhengig, og kan inhiberes av SecinH3. Når A549-celler ble behandlet med SecinH3 eller den beslektede cytohesin inhibitoren Secin16 [19] en konsentrasjonsavhengig reduksjon i proliferasjon ble observert (Fig. 1B). Sammenlignet med de sterkt EGFR-avhengige PC9 celler som uttrykker EGFR som bærer en delesjon i exon 19 [20], spredning ble fullstendig inhibert av hvilke i det 15 uM SecinH3 [17], reduksjon i proliferasjon var mindre uttalt i A549-celler som er i samsvar med mindre avhengighet av A549-celler på EGFR-signalisering. Inhibering ble ikke sett i celler behandlet med en kontrollforbindelse XH1009 som er strukturelt relatert til SecinH3, men hemmer ikke cytohesins [14]. Gefitinib anvendes ved terapeutisk konsentrasjon på 1 uM bare marginalt hemmet proliferasjonen av A549-celler. Aktiviteten av den anvendte gefitinib ble bekreftet ved å behandle gefitinib-sensitive cellelinjen PC9 [20] hvor 100 nM gefitinib hemmet celleproliferasjon nesten fullstendig (data ikke vist). For å utelukke at effekten av SecinH3 var begrenset til A549-celler eksperimentene ble gjentatt i H460-celler, en cellelinje som uttrykker NSCLC også villtype-EGFR men en annen Kras mutant, nemlig G61H (Fig. 1C). Som i A549-celler, 15 uM SecinH3 resulterte i omtrent 50% reduksjon av proliferasjon. Denne verdien passer rimelig godt til den halv-maksimal hemmende konsentrasjon av SecinH3 for den katalytiske aktivitet av rensede cytohesins som er 10-12 uM [14].
SecinH3 og Gefitinib er Synergistic
Etter å ha vist at SecinH3 svekket spredning av gefitinib bestandig NSCLC celler vi ba om behandling med SecinH3 kan gjøre cellene reagerer på gefitinib og dermed virke synergistisk med denne EGFR-TKI. Derfor ble proliferasjonen av H460-celler som bestemt ved en 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT) assay i nærvær av 1 uM gefitinib og økende konsentrasjoner av SecinH3 (Fig . 2A). For hver kombinasjon inhibering forventet for Bliss uavhengighet av de to forbindelsene ble beregnet ved fraksjonert produkt metoden [21] og sammenlignet med den observerte grad av inhibering [22]. For alle tre kombinasjoner testet, ble en synergistisk effekt av gefitinib og SecinH3 funnet. MTT-analysen bestemmer proliferasjon indirekte ved å måle metabolsk aktivitet i cellepopulasjonen. For å få ytterligere og mer direkte bevis for inhibering av proliferasjon en kolonidannelse Analysen ble utført (fig. 2B). Også i denne analysen, er kombinasjonen av SecinH3 med gefitinib var mer effektiv enn hver inhibitor alene.
A, H460-celler ble serum-sultet og behandlet over natten med 0,5 uM AG1024, 15 uM SecinH3 eller deres kombinasjon. Etter stimulering med IGF1 i 5 min fosforyleringstilstanden av de angitte proteiner ble analysert ved hjelp av western blot. Grafene oppsummere 3 eksperimenter, feil barer gi standard feil. *, P 0,05, **, p 0,01, ***, p 0,001 forhold til IGF1-behandlede celler med unntak av de sammenligninger som er spesifisert av parentes. B, spredning av H460-celler i nærvær av de angitte inhibitorer ble bestemt ved MTT-assay. Tallene gir den relative verdien av proliferasjon med ubehandlede celler som angitt 1. Spredning hvis en additiv effekt av SecinH3 og gefitinib antas (forventet) blir sammenlignet med verdien funnet ved forsøkene (observert). Observerte verdier under de forventede verdier indikerer synergisme. ***, P. 0,001
inhibering av EGFR-signalisering i EGFR-avhengige celler er kjent for å resultere i cellesyklus-stans og å føre til induksjon av apoptose. Som surrogatmarkører for cellesyklus og apoptose, bestemt vi uttrykk for cellesyklusprogresjon inhibitor p27Kip1 og apoptose inhibitor survivin (Fig. 3A). Behandling av cellene med SecinH3 eller gefitinib resulterte i en reduksjon i Survivin (Fig. 3B) og en økning i p27Kip1 (Fig. 3C), respektivt. Denne effekten var mer uttalt i celler behandlet med begge inhibitorer.
Som ekspresjon av begge proteiner, p27Kip1 og Survivin, reguleres av Akt aliserte fosforylering av Akt ble analysert som respons på EGF stimulering av cellene (fig. 4A). Mens den EGF-induserte fosforylering av EGFR og adapteren proteininsulinreseptoren substrat 1 (IRS1) ble drastisk redusert ved gefitinib (fig. 4B, C) fosforylering av Akt ble ikke (fig. 4D), som indikerer at Akt signale var uendret i gefitinib behandlet H460 celler. I motsetning til dette, SecinH3 hadde en mindre hemmende effekt på EGFR og IRS1 fosforylering, men viste en betydelig inhibering av Akt aktivering. Følgelig er kombinasjonen av SecinH3 og gefitinib resulterte i nesten fullstendig inhibering av fosforyleringen av alle tre proteiner. Disse data indikerer at den antiproliferative effekt av kombinert SecinH3 /gefitinib behandling er på grunn av effektiv inhibering av EGFR -. Akt signale akse
Mus som bærer subkutane H460-xenotransplantater ble behandlet med SecinH3 ved daglige intraperitoneale injeksjoner. A, tumorvolumet ble bestemt hver dag. På dag 9 hadde forsøket stoppes fordi tumorvolumet hos kontrolldyrene overskredet 1 cm
3. B, fordelingen av tumorvolum på dag 9. C – D, ble graden av apoptose analysert i deler av tumorer på dag 9. C, ble antall fragmenterte kjerner bestemt ved TUNEL-farging. D, spaltes, dvs. aktivert, kaspase-3 ble påvist ved imunohistochemistry. Representative tumorsnitt er vist. 5 × og 40 × angir forstørrelsen på objektivet. For alle grafer, betyr og standardavvik er vist (n = 14). *, P 0,05, **, p 0,01, ***, p. 0,001
SecinH3 Reduserer IGF1R avhengig signalering og spredning
I tillegg til EGFR, insulin-like growth factor-1 reseptoren (IGF1R) er en viktig regulator av Akt aktivering og krysstale mellom IGF1R og EGFR eller EGFR familiemedlemmer som Her2 har blitt rapportert som en mekanisme av resistens mot legemidler rettet mot EGFR eller Her2 i flere typer kreft [16], [23], [24], [25], [26]. Som SecinH3 hemmer signaliserer nedstrøms insulinreseptoren [15], [27] som deler viktige funksjoner med IGF1R signal vi testet om behandling av H460 celler med SecinH3 resulterte i redusert aktivering av IGF1R – Akt signalveien (Fig. 5A). I overensstemmelse med resultatene oppnådd for insulinreseptoren, ble autofosforylering av IGF1R ikke redusert ved SecinH3 behandling, men øket. Ikke desto mindre, aktivering av IRS1 og Akt ble vesentlig redusert. Inhibering av Akt-aktivering ble ikke sett på gefitinib behandling. Økningen i IGF1R fosforylering ved behandling med gefitinib og SecinH3 er i overensstemmelse med tidligere observasjoner at inhibering av EGFR resulterer i øket aktivering av IGF1R [16], [22], [25], [26]. Vi deretter spurt om SecinH3 redusert proliferasjon i nærvær av IGF1 (Fig. 5B). Faktisk ble spredning reduseres ved SecinH3 behandling og reduksjonen var synergistisk med IGF1R inhibitor AG1024. Kombinasjonen av gefitinib og AG1024 viste også en synergistisk antiproliferativ effekt riktignok mindre markert enn kombinasjonen av SecinH3 og gefitinib.
SecinH3 forsinker Vekst av H460 xenografter in vivo
Etter å ha vist at SecinH3 reduserer spredning av EGFR-villtype NSCLC celler in vitro vi spurte om tumorvekst vil hemmes også in vivo. Derfor ble nakne mus med subkutane H460-xenotransplantater behandlet med daglige intraperitoneale injeksjoner av SecinH3. Behandling med SecinH3 signifikant forsinket tumorvekst (Fig. 6A). Når musene ble avlivet etter 9 dagers behandling signifikant mindre svulster ble observert i SecinH3-behandlede gruppe sammenlignet med oppløsningsmiddel-behandlede gruppe (Fig. 6B). I histologiske snitt av tumorene TUNEL-farging viste en økt hastighet av apoptose i de behandlede dyr (fig. 6C), som var også tydelig av caspase-3-farging (fig. 6D). Oppsummert våre data viser at SecinH3 in vitro og in vivo reduserer spredning av NSCLC-celler som uttrykker villtype EGFR.
Diskusjoner
I denne rapporten viser vi at NSCLC celler viser primær motstand mot EGFR-TKI gefitinib responderer på behandling med SecinH3, som hemmer EGFR indirekte ved å målrette sine cytoplasmatiske aktivatorer av cytohesin familien. Dette resultatet kan vises uventet fordi motstanden mot gefitinib kan tolkes som uavhengighet av EGFR signalering. Dette er imidlertid ikke tilfelle. Behandling med EGFR-spesifikke sirnas av forskjellig EGFR-TKI-resistente NSCLC-cellelinjer som uttrykker villtype-EGFR resulterte i redusert spredning av cellene [9], [10], [11], [12] som angir at EGFR-TKI motstand og EGFR uavhengighet er i alle fall ikke alltid tilsvarende. Følgelig har det blitt vist at EGFR bidrar til overlevelse av kreftceller uavhengige av dets kinaseaktivitet [28]. Disse data indikerer at den kinase-inhibert EGFR er fortsatt i stand til å aktivere signalveier som stimulerer proliferasjon eller inhiberer celledød. Til støtte for denne antagelsen er observasjonen at hemming av EGFR av erlotinib induserer heterodimerisering av EGFR med IGF1R som aktiverer IGF1R og av signalanlegget til nedstrøms kinaser inkludert Akt [16]. Cytohesins er blitt vist å direkte kommunisere med EGFR og derved å påvirke dens konformasjon [17]. Som en spesiell konformasjon av EGFR, den asymmetriske dimer, er en forutsetning for kinase-aktivering [29], og modulering av EGFR konformasjon vært implisert i aktivering av EGFR ved cytohesins, en prosess som hemmes av SecinH3. Som behandling av H460-celler med SecinH3 resultert i en økt fosforylering av IGF1R en lignende funksjon av cytohesins under aktivering av IGF1R av EGFR kan utelukkes. Tilsynelatende SecinH3 hemmer signalering av EGFR-aktiverte IGF1R nedstrøms for reseptoren. Dette funnet er i full overensstemmelse med tidligere observasjoner som SecinH3 ikke påvirke insulin reseptoraktivering men hemmet aliserte nedstrøms for reseptoren på nivået av adapteren proteinet insulinreseptor substrat-1 som resulterer i redusert Akt aktivering [15], [27], [ ,,,0],30]. Således kan anti-proliferativ aktivitet av SecinH3 i EGFR-TKI motstandsdyktig NSCLC-celler forklares med sin todelte hemmende effekt på både EGFR og IGF1R signalering, som kan hindre at cellene omgår EGFR inhibering av økt IGF1R signalering. Vi ønsker å påpeke at våre data ikke utelukke at den synergistisk anti-proliferativ effekt av SecinH3 med gefitinib kan skyldes SecinH3 påvirker signale av RTK i tillegg til IGF1R. Spesielt amplifikasjon av hepatocytt-vekstfaktor-reseptor-c-MET [31] og tilstedeværelsen av den EML4-Alk-fusjonsprotein [32] har vært knyttet til EGFR-TKI motstand. Aktivering av disse RTK av cytohesins har imidlertid ennå ikke blitt undersøkt, og dermed vi vet foreløpig ikke om signale av disse RTK kan bli påvirket av SecinH3.
Forbedret aktivering av IGF1R har blitt anerkjent som en viktig årsaken til motstanden mot EGFR-målrettet behandling i kreftceller av ulik opprinnelse. Følgelig, i vitro-eksperimenter viste kombinerte hemming av IGF1R og EGFR aktivitet for å redusere tumorcellevekst synergistisk [16], [23], [24], [25], [26]. Dessverre er disse resultatene ble ikke oversatt til kliniske studier der, inntil nå, kombinasjonsterapier søker EGFR og IGF1R målretting behandlinger ikke klarte å vise betydelige forbedringer i forhold til enkelt terapi [33], [34]. Årsakene til disse skuffende resultater er foreløpig ukjent, men kan ligge i ufullstendig forståelse av molekylære detaljene i crosstalk mellom EGFR og IGF1R signale som utelukker rasjonell utvelgelse av pasienter som kan ha nytte av kombinasjonsbehandling. Mutasjoner som forut respons på målrettet terapi, som for EGFR, har ikke blitt rapportert for IGF1R [35] og kan derfor ikke brukes til å velge pasienter. I en klinisk studie etter biomarkører forutsi nytte kombinert EGFR /IGF1R hemming muterte KRAS ble identifisert [36]. In vitro studier viste imidlertid motstridende data på den antiproliferative effekt av kombinert inhibering av EGFR og IGF1R i KRAS-muterte H460-celler. Mens én studie ikke fant synergi [25] En annen studie gjorde [16]. I vår studie en svak synergisme av gefitinib og AG1024 ble funnet mens sterkere synergi ble funnet for kombinasjoner av noen av disse forbindelsene med SecinH3. Disse uoverensstemmelsene markere den oppfatningen at å hemme identiske mål med forskjellige hemmere eller hemming strategier kan føre til ulike biologiske resultater. Derfor kan tilnærminger som ikke er avhengige av direkte hemming av EGFR og IGF1R kinase aktiviteter, men er rettet mot disse reseptorene indirekte via sine aktivator eller adapter molekyler gi mer fullstendig forståelse av disse signalveier og dermed gi ennå ikke resultatførte mål for nye terapeutiske tilnærminger.
takk
Vi takker Y. Aschenbach-Paul, A. Florin og U. Rommerscheidt-Fuss for teknisk assistanse.
