Abstract
Bakgrunn
Forbedret lysosomal menneskehandel er assosiert med metastatisk kreft. I et forsøk på å oppdage kreft relevant lysosomal motor proteiner, sammenlignet vi lysosomale proteom fra paren MCF-7 brystkreftceller med de fra sterkt invasive MCF-7-celler som uttrykker en aktiv form av ErbB2 (Sn-ErbB2).
metodikk /hovedfunnene
Massespektrometri analyse identifisert kinesin tunge kjeden protein KIF5B som eneste microtubule motor forbundet med lysosomene i MCF-7 celler, og ektopisk Godkjent: 18 desember 2008; Publisert: 10 februar 2009
Copyright: © 2009 Cardoso et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. CMP Cardoso var en mottaker av tilskudd fra den portugisiske Foundation for Science and Technology (SFRH /BPD /14448/2003). Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra den danske Kreftforeningen (MJ), den danske National Research Foundation (MJ), den danske Medical Research Council (JN og MJ), Meyer Foundation (MJ), den M.L. JÃ? ¸rgensen og Gunnar Hansens Foundation (MJ), Novo Foundation (MJ og MHH), Vilhelm Pedersen Foundation (JN og MJ), den danske Cancer Research Foundation (MJ) og EU-kommisjonen FP7 APO-SYS konsortium (MJ og JSA). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
lysosomer er membranbundne dynamiske organeller som representerer den endelige destinasjonen for endocytic, sekretorisk og autophagic trasé [1]. Den fysiologiske betydningen av lysosomer er markert med en rekke sykdommer som skyldes feil i det lysosomale biogenesis og funksjon [2]. Tvert imot, den forbedrede syntese, trafficking og ekstracellulære frigjøring av lysosomale proteaser (Katepsiner), er viktige kjennetegn på malignitet og knytte med invasiv og metastatisk kapasitet på kreftceller [3], [4]. Interessant, lysosomale endringene forbundet med immortalisering og transformasjon av kreftceller også sensibilisere kreftceller for å programmert celledød baner som involverer lysosomal membran permeabilization [5], [6]. Når utløses, lysosomal membran permeabilization resulterer i utslipp av katepsin og andre lysosomale hydrolaser til cytosol, hvor de kan utløse den mitokondrielle ytre membran permeabilization fulgt av caspase-mediert apoptose [7], [8] eller mediere caspase-uavhengig programmert celledød [9]. Således synes inhibering av lysosomale handel /exocytose som et lovende mål for cancerterapi. Det ville ikke bare hemme cathepsin-mediert invasjon, men også hindre generell menneskehandel og muligens resultere i akkumulering av lysosomer bestemt for sekresjon og dermed ytterligere bevisstkreftceller til lysosomal celledødsveier. Denne hypotese støttes av data som viser at vincristin, et mikrotubulus-destabiliserende anti-kreft legemiddel, ikke bare hemmer lysosomet handel, men induserer også en rask økning i volumet av det lysosomale rom fulgt av lysosomale lekkasje og cathepsin-avhengig celledød [10] .
Fordi medikamenter som forstyrrer mikrotubuli-nettverket viser høy generell toksisitet, vi spekulert på at en mer spesifikk interferens med lysosomet handel kan resultere i anti-kreft-strategier med færre bivirkninger. Derfor ønsket vi å identifisere og karakterisere motor proteiner viktige for lysosome transport i kreftceller. Motor proteiner ved anvendelse av cytoskjelettet som substrat for bevegelse er delt inn i myosin motorer som beveger seg langs actin-mikrofilamenter og kinesin /dynein motorer som bruker mikrotubuler gjennom interaksjon med tubulin for deres bevegelse [11]. Motor proteiner er drevet ved hydrolyse av ATP og omdanne kjemisk energi til mekanisk arbeid gjør dem i stand til å flytte lasten (vesikler, proteiner og lipider) over lange avstander. Mikrotubul-motorer spesifikke består av to grunnleggende typer mikrotubul-motorer.: Pluss-ende motorer og minus-end motorer, avhengig av i hvilken retning de beveger seg langs filamentene inne i cellen [12]
avkortet form av ErbB2-reseptoren finnes ofte over-uttrykt i brystkreft og dets ekspresjon og aktivitet korrelerer med økt invasivitet, motilitet og dårlig prognose [13]. Følgelig ektopisk uttrykk for Gene Expression Omnibus). KIF5B er en N-kinesin (Plus-ende motor) som tilhører superfamilien av kinesin-1 molekylære motor proteiner som sammen med cytoplasmatisk dynein er ansvarlig for mikrotubulus-avhengig transport av gods i eukaryote celler [17]. Å belyse rollen KIF5B i kreftceller vi undersøkt sin funksjon i ulike lysosomale trasé inkludert lysosomal celledød vei, den resealing respons etter plasmamembranskade (eksocytose) og macroautophagy.
Materialer og Metoder
Cellekultur kultur~~POS=HEADCOMP og behandlinger
MCF-7, HeLa og U2OS celler stammer fra menneskelig brystkreft, livmorhalskreft og osteosarkom, respectivly. MCF-7-EGFP-LC3 cellelinje er en enkelt celle klon av MCF-7-celler som uttrykker et fusjonsprotein som består av forsterket grønt fluorescerende protein (EGFP) og rotte LC3 [18]. MCF-7-ΔNErbB2 og MCF-7-pTRE cellelinjer er enkelt celle kloner av MCF-7 som uttrykker tetracyklin transaktivator transfektert med pTRE-ΔNErbB2 og pTRE, henholdsvis [14]. HeLa-LIMP1-EGFP celler er HeLa-celler som uttrykker EGFP-merket lysosome integrert membran protein-1 (LIMP-1) [19] (vennlig levert av Dr. J.P. Luzio, University of Cambridge). Kreftceller og deres transfekterte varianter ble dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen) supplert med 6% varme-inaktivert føtalt kalveserum (FCS; Biological Industries) og penicillin-streptomycin. Mediet av MCF-7-ΔNErbB2 og MCF-7-pTRE ble ytterligere supplert med 5 ug /ml tetracyklin. For å indusere # 9202) og fosfo-p70
S6K1 (# 9206) (fra Cell Signal Technology), og glyseraldehyd-3-fosfat (GAPDH, biogenesis, Poole, UK) etterfulgt av hensiktsmessige konjugert sekundære antistoffer fra DAKO A /S (Glostrup, Danmark).
for immunocytochemistry, celler på dekk ble løst ved hjelp av iskald metanol i 10 min eller 3,7% formaldehyd i 30 minutter ved 25 ° C. Cellene ble farget med de angitte primære antistoffer inkludert mus anti kråkebolle KIF5B (1:20; SUK4), mus anti-human cytokrom
c product: (klone 556 432 til 1: 350, BD PharMingen, San Diego, CA) , geit anti-humant γ-tubulin (SC-7396, Santa Cruz Biotechnology) og muse anti-humant LAMPE-2 (1:100). Etter vasking, ble prøvene inkubert med den aktuelle Alexa Fluor-488 og Alexa- Fluor-546/594-koblede sekundære antistoffer (molekylære prober). Confocal bilder ble tatt med en Zeiss Axiovert 100 M Confocal Laser Scanning Microscope utstyrt med LSM 510 system (Carl Zeiss MicroImaging, Inc.).
RNA ekstraksjon, cDNA syntese og revers transkripsjon-PCR (RT-PCR)
RNA ble høstet fra cellekultur med RNeasy kolonner (QIAGEN) og cDNA syntese ble gjort med TaqMan RT Kit (Roche) med oligo- (dT)
16 primere. PCR reaksjoner ble utført i henhold til standard betingelser med følgende primere:
KIF1A-forw: GACACGCTGGTCTGAGATGA. KIF1A-rev: TGGCTTAGGCACTCCTCACT; KIF3A-forw: GACTATGCTGAGGCTGCAA. KIF3A-rev: TGTCTTTGGCCTTGCTTTC; KIF5A-forw: CAGCTTGACGACAAGGATGA. KIF5A-rev: GGTGTCCACTGACCTCCTGT; KIF5B-forw: GATGGATCGGAAGTGAGCAT. KIF5B-rev: ATCACGACCGTGTCTTCTCC; KIF5C-forw. GCAACTGGAACAGGAGAAGC
KIF5C-rev: ACCTCACCCAAACACTCCAG. PBGD-forw: CATGTCTGGTAACGGCAATG; PBGD-rev: AGGGCATGTTCAAGCTCCTT. Porphobilinogen deaminase (PBGD; PubMed oppføring BC000520) ble brukt som intern kontroll sammen med genet av interesse. PCR produktene ble size-separert på en 1,5% -agarose gel som inneholder etiumbromid visualisert under UV-lys, fotografert ved hjelp av Polaroid film.
subcellulære fraksjone
For tettshetsgradient fraksjone celler ble slått sammen i iskald homogeniseringsbuffer (250 mM sukrose, 20 mM Hepes, 1 mM EDTA, pH 7,4) og lysert i en Dounce homogenisator på is. Homogenatene ble sentrifugert, og supernatanten ble sentrifugert ned ved 3000 g i 10 min ved 4 ° C og pelleten ble kastet. Supernatanten ble sentrifugert ved 17 000 g i 20 min ved 4 ° C. Iodixanol gradienter ble dannet ved sekvensiell tilsetning av 4, 10, 16 og 24% oppløsninger i homogeniseringsbuffer ved 25 ° C i en time, noe som resulterer i dannelsen av en kontinuerlig gradient. Den endelige pellet ble resuspendert i homogeniseringsbuffer og applisert på en kontinuerlig 4-24% iodixanol gradient og sentrifugert ved 20 000
g
i en SW41Ti rotor (Beckman) i 17 timer ved 4 ° C. Gradienter ble separert i en total av tyve 500 pl fraksjoner, samlet opp fra bunnen. Tettheten av hver fraksjon ble bestemt ved måling av OD ved 244 nm. Katepsin B /L,
N
-acetylglucosaminidase (NAG) og sure fosfatase aktivitet ble målt for hver fraksjon etter tilsetting av digitonin.
Analyse av eksocytose aktivitet på plasmamembranen såret
Membran såret ved elektroporering ble utført som beskrevet tidligere [21]. I korthet ble cellene suspendert i Hanks balanserte saltoppløsning (HBSS) (Gibco, Invitrogen), underkastet elektroporering ved 200 V med varierende nivåer av kapasitans i et 0,2 cm elektrode Gene Pulser kyvette (Bio-Rad), og inkubert i 1 min ved 37 ° C. Cellene ble deretter inkubert med anti-LAMPE-1 (SC-20011, Santa Cruz Biotechnology) antistoff på is i 30 min, vasket, fiksert og farget med Alexa Fluor 488 sekundære antistoffer (Molecular Probes). Flowcytometri på 10000 celler per prøve ble utført med en FACS (Becton Dickinson) og dataene ble analysert ved hjelp av Cellquest-programvare (Becton Dickinson). For å måle induserte ionomycin exocytose aktivitet cellene ble inkubert i HBSS inneholdende 10 uM ionomycin (Sigma). En cathepsin B-spesifikk probe, zfr-AMC (VWR International) ble tilsatt til hver brønn til en sluttkonsentrasjon på 100 uM ved tiden 0 og 10 min. Frekvensen av substrathydrolyse, målt ved frigjøring av AMC (eksitasjons bølgelengde 400 nm, emisjonsbølgelengde 489 nm). Ved 30 ° C på en Spectramax Gemini fluorometer (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)
Resultatene
ΔNErbB2 øker nivået av KIF5B i lysosomer
MCF-7 brystkreft celler uttrykker amino-terminalt avkortet konstitutivt aktiv form av ErbB2 reseptortyrosinkinasehemming (ΔNErbB2) viser en svært bevegelige fenotype kjennetegnet ved omfattende membran rusket, plasmamembranfremspring og spredning av cellene (fig. 1A). Videre induserer ekspresjon ΔNErbB2 lokalisering av lysosomer til filopodia (fig. 1A) og en 3-4-fold oppregulering av lysosomal cystein cathepsin aktivitet [6] som tyder på at linearitet av iodixanol gradient profilen ble bestemt ved å måle OD ved 244 nm (lavere graf).
(A) Protein nivåer av KIF5B, 48 timer etter uttømming med varierende siRNA konsentrasjoner (KIF5B-en siRNA ) i HeLa og MCF-7; β-tubulin fungert som intern kontroll. Oligof: kontrollceller behandlet med oligofectamine alene. (B) Representant fasekontrast bilder av HeLa, MCF-7 og MCF-7- Cellene ble deretter fiksert og farget for KIF5B. (C) HeLa celler transfektert med angitte sirnas var (etter 48 h) stimuleres til exocytose med 10 mikrometer ionomycin. Ekstracellulær sekresjon av lysosomale katepsin ble målt ved hjelp av en zFR-AMC enzymanalyse og verdier (hjelp av triplikate målinger ± SD) ble uttrykt som prosent av totalt cellulært LDH-innhold. (D) Kvantifisering av overflate LAMPE-1 i elektroporerte HeLa-celler ved flow cytometri. Rød og grønn indikerer celler i to forskjellige porter. Prosentandelen av celler i den røde gate ble anvendt for å beregne mengden av overflateeksponerte LAMPE-1 +/- elektroporering. FL1-H: fluorescens intensitet. FSC-H. Forover side scatter
Siden KIF5B fungerer som en
pluss
-end motor, det vil si en motor som transporterer last fra sentrosomen til cellen periferien [24], akkumulering av lysosomer til cellen periferien i KIF5B-utarmet celler kan skyldes en perifer lokalisering av sentrosomen eller en svikt i lysosomene til å smelte sammen med plasmamembranen. For å teste den første muligheten, farget vi HeLa-EGFP-LIMP1 celler med et antistoff mot γ-tubulin å markere centrosomes. Imidlertid gjorde de lysosomale klynger ikke samle seg rundt centrosomes (Fig. 3A). For å undersøke om KIF5B er avgjørende for lysosomal eksocytose, søkte vi tre forskjellige metoder (mekanisk skrape, electroporation og ionomycin) for å indusere plasmamembran lesjoner som utløser Ca
2 + strøm og induksjon av resealing respons som innebærer eksocytose av lysosomer [25 ]. En skalpell ble brukt til å ripe på en semi-sammenflytende lag av HeLa-celler for å indusere mekanisk plasmamembranskade, og lysosomal exocytose ble umiddelbart analysert ved anvendelse av et antistoff detektere en luminal epitop av lysosomal LAMPE-1 på celleoverflaten. Overflaten fluorescens lampe-1 ble signifikant øket ved skadestedet indikerer lysosomal membran forsegling, og en ytterligere ko-lokalisering og akkumulering av KIF5B ved skadestedet ble observert noe som tyder på at KIF5B er involvert i denne respons (fig. 3B). Etter denne metoden er ikke egnet for kvantitative studier, brukte vi electroporation å indusere små hydrofile porene i plasmamembranen for å undersøke om KIF5B var vesentlig i transportprosessen av lysosomer til skadesteder. Fremgangsmåten er mye brukt for å innføre proteiner og DNA inn i celler og avhenger av cellene evnen til å forsegle deres plasmamembranen etter elektroporasjon [26]. HeLa celler ble electroporated med økende kapasitans og umiddelbart etter at de ble farget for overflate LAMP-1 (Fig. 3D). Kvantifisering av LAMP-en eksponert på plasmamembranen ved flowcytometri avslørte en påviselig nivå av LAMP-en på 3,3% av ubehandlede celler. I motsetning til dette, når celler ble elektroporert ved 125 og 250 uF, ble LAMPE-1 detektert på overflaten på 11,4 og 21% av cellene henholdsvis. Celler utarmet for KIF5B og eksponert for 125 uF ikke viser noen signifikant endring i overflate LAMPE-1 sammenlignet med kontroll-behandlede celler eksponert for 125 uF (Fig. 3D). Tilsvarende ionomycin-indusert lysosomal eksocytose av luminal proteaser var upåvirket av KIF5B mangel (figur 3C). Disse dataene viser at KIF5B er ikke avgjørende for det lysosomale eksocytose og plasmamembran resealing. Videre opptaket av Alexa Mel 488-dekstran (10 kDa) ble ikke påvirket av KIF5B uttømming indikerer at KIF5B ikke er nødvendig for væskefase endocytose (data ikke vist).
Nedbryting av KIF5B induserer peri-atom opphopning av autophagosomes
Deretter undersøkte vi om KIF5B spiller en rolle i autofagi, de store lysosomal degradering veien. For dette formål, behandlet vi MCF-7-celler som stabilt uttrykker den autophagosome-assosierte LC3 protein fusjonert til den forbedrede grønn fluorescens protein (MCF-7-LC3-EGFP) med enten rapamycin som induserer autofagi ved å inaktivere pattedyr-målet for rapamycin kompleks 1 ( mTORC1) eller concanamycin A som hemmer vacuolar V-ATPase aktivitet i lysosomer som resulterer i redusert omsetning på autophagosomes samt induksjon av autophagosome dannelse via hemming av mTORC1 [27]. Interessant, uttømming av KIF5B av tre ikke-overlappende sirnas betydelig redusert evne til rapamycin å utløse dannelsen av LC3-postive autophagic vesikler (Fig. 4A). Denne effekten ble ikke forårsaket av endringer i evnen til rapamycin å hemme mTORC1 siden uttømming av KIF5B ikke har noen innflytelse på mTORC1 aktivitet som analyseres ved fosforylering status av p70 S6 kinase 1 (p70
S6K1) (Fig. 4B). For å utforske fenomenet videre, vi fulgt autophagosome formasjonen i MCF-7-LC3-EGFP celle behandles med rapamycin (ikke vist) eller concanamycin En av tid lapse video mikroskopi i 45 min. Overraskende, fordelingen av autophagosomes ble dramatisk endret av KIF5B uttømming. I KIF5B utarmet celler autophagosomes dukket opp og akkumuleres i hovedsak rundt kjernen (fig 4C-E;. Video S3) mens i celler behandlet med kontroll siRNA de ble fordelt diffust gjennom cytoplasma (fig 4C,. Video S4). De perinukleære autophagosomes i KIF5B uttømte celler ble plassert i umiddelbar nærhet til Golgi-apparatet som visualisert ved farging med et antistoff mot en
trans
-Golgi nettverk membranprotein Golgin-97 (fig. 4F og video S5).
