Abstract
Innledning
Økende bevis har vist at immun overvåking er svekket i en svulst fremmende mikromiljø for pasienter med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), og kan gjenopprettes ved passende kjemoterapi.
Metoder
for å teste denne hypotesen, analyserte vi mikromatriser genuttrykk profiler av perifere mononukleære blodceller fra 30 pasienter med nydiagnostisert avansert stadium NSCLC, og 20 alders-, sex- og komorbiditet-matchet friske kontroller. Alle pasientene fikk en median på fire kurer med cellegift med cisplatin og gemcitabin for en 28-dagers syklus som førstelinjebehandling.
Resultater
Seksti-ni differensielt uttrykte gener mellom pasienter og kontroller , og 59 differensielt uttrykte gener før og etter kjemoterapi ble identifisert.
IL4
veien ble betydelig anriket på både tumorprogresjon og kjemoterapi signaturer.
CXCR4 Hotell og
IL2RG
ble nedregulert, mens
DOK2 Hotell og
S100A15
var oppregulert hos pasientene, og uttrykk for alle de fire genene ble helt eller delvis reversert etter kjemoterapi. Real-time kvantitativ RT-PCR for fire oppregulert (
S100A15, DOK2
) og nedregulert (
TLR7, TOP1MT
) gener i pasientene, og de seks oppregulert (
TLR7, CRISP3, TOP1MT
) og nedregulert (
S100A15, DOK2, IL2RG
) gener etter kjemoterapi bekreftet gyldigheten av microarray resultater. Videre immunhistokjemisk analyse av parafininnstøpte lungekreftsvev identifiserte sterk S100A15 nukleær farging ikke bare i trinn IV NSCLC i forhold til scenen IIIB NSCLC (p = 0,005), men også hos pasienter med stabil eller progressiv sykdom sammenlignet med de med en delvis respons (p = 0,032). En høy andel av S100A15 atom fargede celler (HR 1,028, p = 0,01) var den eneste uavhengige faktoren i forbindelse med treårs total dødelighet.
Konklusjoner
Våre resultater tyder på en mulig rolle
IL4
veien i immun overvåking av avansert stadium NSCLC, og immunpotensering av kombinasjonskjemoterapi. S100A15 kan tjene som en potensiell biomarkør for svulst staging, og en prediktor for dårlig prognose i NSCLC
Citation. Chen Y-C, Hsiao C-C, Chen K-D, Hung Y-C, Wu C-Y, Lie C-H, et al. (2013) Perifere immun celle genuttrykk Endringer i avansert ikke-småcellet lungekreft hos pasienter behandlet med første linje kombinasjonskjemoterapi. PLoS ONE 8 (2): e57053. doi: 10,1371 /journal.pone.0057053
Redaktør: Sai Yendamuri, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 14. august 2012; Godkjent: 16 januar 2013; Publisert: 25 februar 2013
Copyright: © 2013 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning (CCMP96-RD-202) fra komiteen for kinesisk medisin og farmasi ved Institutt for helse, direktør Yuan, Taiwan, og også støttet delvis med tilskudd fra Chang Gung Memorial Hospital (CMRPG891301 til KD Chen, og CMRPG881031 til YC Chen). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er den vanligste årsaken til kreftrelaterte dødsfall på verdensbasis. Den gjennomsnittlige 5-års overlevelse er mindre enn 15%, noe som har vært stort sett uendret de siste tre tiårene. Flertallet av NSCLC pasienter til stede med avansert sykdom ved diagnose, og de diagnostisert med tidlig stadium sykdommen ofte opplever tilbakefall og metastatisk sykdom [1], [2], [3].
vertens immunceller mekle immun overvåking av utrydde avvikende celler, og dette er svekket i et tumorfremmende mikromiljø for mange pasienter med lungekreft. Flere immundefekter, inkludert en forskyvning mot type 2 hjelper-T-celle (Th2) fenotype, er tydelig i lungekreftpasienter [4], [5]. Imidlertid kan de samme immunceller fremme tumorvekst og metastase gjennom angiogenese og invasjon av den ekstracellulære matriks [6], [7]. Forstå de grunnleggende molekylære prosesser som forårsaker disse feilene vil gi en mulighet til å utvikle innovative terapier. I tillegg immun-celleresponser er montert ved hjelp av forskjellige histopatologiske typer og stadier av tumor lungekreft kan være forskjellig; imidlertid er studier på dette problemet mangelfull.
Flere immunundertrykkende molekyler som blir produsert av tumorer, så som interleukin-10 (IL-10), transformerende vekstfaktor-beta (TGF-β), eller syklooksygenase-2 ( COX-2) metabolitter; imidlertid, kan spesifikke terapier slik som kjemoterapi og strålebehandling bidrar til endring av immunsystemets funksjon [4], [6], [8]. Økende bevis tyder på at en fasett av immunovervåkning kan gjenopprettes ved egnede kjemoterapeutika. For eksempel har den nukleosidanalog gemcitabin (GEM) blitt vist å selektivt øke den adaptive immunrespons og fremme den celleformidlede immunrespons i løpet av den humorale immunrespons i tillegg til konvensjonelle apoptotiske effekter [9] – [12]. I tillegg er den platinabasert middel, cisplatin (CDDP), har blitt vist å øke anti-tumor virkningene av cytotoksisk T-lymfocytt-mediert immunterapi [13]. Det er også påvist at bruk av platina-basert dobbel kjemoterapi gir en betydelig fordel i form av tumorrespons og overlevelse sammenlignet med en mono diett [14]. Den underliggende mekanismen for immunpotense for kombinasjonskjemoterapi er i stor grad ukjent.
Formålet med denne studien var å bedre forståelsen av de molekylære mekanismene som regulerer immunosurveillance eller tumorprogresjon hos immunceller av pasienter med avansert stadium NSCLC etter undersøke uttrykk for gener i perifere mononukleære blodceller (PBMC) som kan være involvert i disse effektene. Vi antok at genekspresjon av PBMC involvert i immunresponsen til avansert stadium NSCLC ville være vesentlig forskjellig fra den hos friske, og at ytterligere forskjeller ville bli sett mellom kreftpasienter med adenokarsinom (AC) og plateepitelkarsinom (SCC) eller mellom stadium IIIB og IV. Videre ønsket vi å bedre forståelsen av de molekylære mekanismene som regulerer immunopotensering indusert av kombinasjonskjemoterapi med CDDP og GEM, med håp om at nye gener kan bli funnet å være over- eller under uttrykte etter behandling, og dermed tilby ny innsikt i å forbedre effekten av cellegift
En rekke studier har søkt DNA mikromatriseteknologi for å undersøke genekspresjon hos pasienter med NSCLC [15] -. [24]. I en av disse studiene, som fokuserte på genekspresjon i blod leukocytter i stedet for tumorvev, ble 29 gener funnet å være endret hos pasienter med tidlig stadium NSCLC forhold til de med ikke-maligne lungesykdommer. I hvilken grad de leukocytter gener spiller en rolle i avansert NSCLC, og virkningene av histopatologi og tumorstadium på gen signaturer er uklart [23]. Derfor utvidet vi vår undersøkelse i avansert stadium NSCLC ved å analysere hel-genom genuttrykk profiler i PBMC fra pasienter med nydiagnostisert avansert stadium NSCLC og histopatologi av enten AC eller SCC. Videre, for å etablere en direkte kobling mellom genuttrykk og kjemoterapi, etterbehandling PBMC fra 17 pasienter som fikk minst fire kurs av kombinasjonskjemoterapi med CDDP og GEM ble oppnådd, og virkningene av kjemoterapi på global genekspresjon profiler ble evaluert ved hjelp av microarray analyse.
Materialer og metoder
studiet ble godkjent av Institutional Review Board of Chung Gung Memorial Hospital, Taiwan. Deltagerne ble rekruttert fra lunge klinikker og helseundersøkelse sentrum av Kaohsiung Chung Gung Memorial Hospital i perioden august 2007 til januar 2009. Alle de inkluderte pasientene var i alderen 18 år eller eldre med histologisk bekreftet, nylig diagnostisert, ubehandlet, stadium IIIB eller IV NSCLC, med ett eller flere målbare (dimensjonal) lesjon med en diameter på 10 mm eller større målt ved hjelp av datastyrte tomografi, histopathologic subtype av AC eller SCC, og en Eastern Cooperative Oncology Group funksjonsstatus 0, 1 eller 2. Hver svulst ble diagnostisert i henhold til histopathologic subtype og grad av en patolog. Klinisk stadium ble dømt i henhold til International Union Against Cancer (UICC) Tumor Node Metastase klassifisering (6
th edition, 2002). Totalt 42 pasienter med lungekreft ble screenet for valgbarhet for registrering. Pasienter med førstelinjebehandling regimer annet enn CDDP og GEM kombinasjonskjemoterapi (4 pasienter), de som samtidig strålebehandling (2 pasienter), alvorlig ukontrollert medisinsk eller psykiatrisk sykdom (1 pasient), historien om andre malignitet i løpet av de siste 5 årene (1 pasient ), og nekte å tilveiebringe en blodprøve for studien (4 pasienter) ble ekskludert. Tretti pasienter fullførte oppfølging og ble inkludert for endelige analysen. Alle 30 pasienter fikk første linje kjemoterapi med CDDP (gjennomsnittlig dose 70 mg /m2) på dag 1 pluss GEM (GEMZAR®, Eli Lilly and Company, Indianapolis, IN, mener dose 1000 mg /m2) på dag 1, 8 og 15 av en 28-dagers syklus. Behandlingen ble planlagt for maksimalt seks sykluser (median 4, range 1-6) med mindre det ble avviklet på grunn av progressiv sykdom, stabil sykdom, uakseptabel toksisitet eller død. Etter baseline evaluering, ble tumorrespons vurdert en uke etter siste dose i henhold til de Response evalueringskriterier i solide svulster. En fullstendig respons (CR) ble definert som den fullstendig forsvinning av alle tegn på sykdom. En delvis respons (PR) ble definert som en reduksjon på minst 30% av den største diameter for hvert mål lesjon, uten at utseendet av nye lesjoner. Progresjon ble definert som en økning på minst 20% av den største diameter for hvert mål lesjon, eller utseendet av ett eller flere nye lesjoner. Total overlevelse ble definert som tiden fra diagnose til død uansett årsak i 3-års oppfølgingsperiode. Tjue friske personer uten tidligere malignitet i løpet av de siste 5 år eller nyere infeksjonssykdom ble innrullert som kontrollgruppen.
Prosesser av RNA Isolation og cRNA Synthesis
Tilleggsfullblod (15 ml) ble samlet etter informert samtykke var innhentet fra 30 pasienter med nylig diagnostisert histopathologically bekreftet NSCLC, og 20 alders-, sex-, og komorbiditet-matchet friske kontroller (HC). En annen 15 ml blod ble samlet igjen en uke etter siste dose av CDDP og perle fra 17 pasienter som fullførte minst fire kurs av kombinasjonskjemoterapi. PBMC ble isolert ved Ficoll-Hypaque gradientsentrifugering (HISTOPAQUE®-119, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO USA) i løpet av 90 min for å trekke blod, vasket i PBS, og deretter lagret i RNAlater (Ambion Inc. , Austin, TX, USA) ved -80 ° C inntil RNA isolering. En RNeasy® Plus Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) ble anvendt for isolasjon av høy kvalitet total-RNA, og behandlet med DNase etter fremstillingen protokollen. RNA ble deretter eluert i RNase-fritt vann. Prøvene ble kjørt på en RNA 6000 Nano Gel System (Agilent Technologies Inc., Palo Alto, CA, USA) ved anvendelse av et Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent) for å bestemme kvaliteten av RNA, og 2 ul RNA ble anvendt for å bestemme konsentrasjonen av RNA ved hjelp av en NanoDrap spektrofotometer (Thermo Science, Wilmington, DE, USA). Bare prøver med A260 /A280-forhold på 1,9 til 2,1 ble brukt for videre analyse. Totalt 300 ng RNA ble brukt for syntese av første cDNA og in vitro transkripsjon av cRNA ved hjelp av en Illumina Totalprep RNA Amplication kit (Ambion, Inc.).
Gene Expression Profilering og microarray dataanalyse
Illumina (San Diego, California) HumanRef-8v2 perle mikromatriser ble brukt sammen med 750 ng merket cRNA for hver prøve i henhold til produsentens protokoll. Menneskelig Ref-8 versjon 2 arrays bestå av 22,184 sonder som representerer 18,189 unike menneskelige gener på en åtte-stripen format array. Alle uttrykk datasett har blitt deponert i NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) med tiltredelse nummer GSE39345. Statistisk analyse av microarray data ble utført ved hjelp GeneSpring programvareversjon 11 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA). For å gjøre uttrykket verdier uavhengig av sted intensitet og plassering, en ytterligere per gen normalisering ble påført pre-normaliserte data innenfor hver gruppe ved å dividere rådata ved medianen av ekspresjonsnivået for genet i prøver fra friske forsøkspersoner. Rådata generert etter scanning av mikromatriser med bakgrunn korrigert ble lastet fra Illumina er Beadstudio Expression modul til Genespring GX. Dette trinnet ble etterfulgt av quantile normalisering og log2 transformasjon. En sonde sette filter ble brukt for å fjerne gener som ikke ble detektert på en pålitelig måte. Overall, 22150 sonder av de totale 22184 prober (99,8%) viste hvor minst en av 67 prøver hadde blitt flagget i P (nåværende) eller M (marginal) flagg i forhold til bakgrunnsnivå. En ikke-parametrisk U test for uparede sammenligninger av de to uavhengige grupper eller Wilcoxon signert rank test for å sammenligne genuttrykk nivåer før og etter kjemoterapi ble brukt. Vi brukte Benjamini-Hochberg falske funnrate (FDR) korreksjonsmetode kontrollere for falske positiver og en korrigert p-verdi cutoff på 0,05 ble brukt til å velge sett med betydelig opp- og ned-regulerte gener med lavest FDR. De gensettene deretter gruppert i funksjonelle kategorier etter Gene ontologi biologiske prosesser klassifisering. Den veien berikelse prosessen ble brukt til å identifisere de funksjoner fra betydelig endret undergrupper av gener mellom fenotypiske grupper og finne direkte sammenhenger mellom gener av interesse. Dette ble utført i GeneSpring programvare med «enkel og direkte interaksjon» algoritme. Informasjonen brukes av algoritmen ble hentet fra PubMed litteratur ved hjelp av naturlig språk prosessering algoritmer for å søke søkeord og relasjoner i abstracts. Hierarkisk clustering analyse ble utført ved clustering og tre-building-programmer, basert på de filtrerte gener som møtte de statistiske kriterier, ved hjelp av den sekskantede boble metoden.
Verifisering av Gene Expressions bruker TaqMan Kvantifisering Real-time revers transkriptase-polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
for å bekrefte uttrykk mønstre av enkelte kandidat gener, ble uttrykkene analysert ved hjelp av RT-PCR i en 32-brønners format. For hvert gen av interesse, ble en enkelt RT-PCR-reaksjonen utført på samme RNA-prøve av PBMC fra kreftpasienter (n = 30) og HC (N = 20). Huset holder genet Menneskelig surt ribosomalt protein (HuPO) ble valgt som en endogen kontroll for å normalisere uttrykket data for hvert gen. Alle PCR primere (tilfeldige heksamer) og TaqMan prober ble designet og kjøpt fra Roche i henhold til selskapets protokoller (www.roche-applied-science.com), og deres sekvenser er gitt i tabell S1, som er publisert som tilleggsinformasjon på PLoS One nettsted. I korthet, ble to-trinns kvantitativ RT-PCR utført. Førstetråds-cDNA ble syntetisert fra 5 ug av RNA ved anvendelse av en LightCyclerTaqManMaster sett (Roche, Tyskland). PCR-reaksjonene ble kjørt i en syklus Roche Lys 2,0 maskin. Enkelt sanntid PCR-forsøk ble utført på hver prøve for hvert mål gen, fordi den Roch Lys Cycler system har vist høy reproduserbarhet ved hjelp utmerket termisk kontroll og deteksjon sonde format (https://www.roche-applied-science.com/sis /rtpcr/LCNano/index.jsp?id=LCNano_100000). Relative uttrykk nivåer ble beregnet ved hjelp av ΔΔCq metoden med medianverdien for HC gruppen som kalibratoren, slik det ble gjort med microarray data [25].
Immunohistochemistry (IHC) Farging av Lung Cancer Vev for S100A15
Tissue parafinsnitt ble deparaffinized i xylen, rehydrert gjennom graderte etanolløsninger til destillert vann, og deretter vasket i Tris-bufret saltvann. Antigen gjenfinning ble utført ved oppvarming seksjoner i 10 mM natriumsitrat i 10 minutter i en mikrobølgeovn. Endogen peroksidaseaktivitet ble stoppet ved inkubering i 3% H
2o
2 i metanol i 5 min. Ikke-spesifikke bindingsseter ble blokkert ved hjelp Protein Block (Dako, Carpinteria, California, USA) for 20 min. Vevssnittene ble så inkubert i 1 time ved romtemperatur med anti-human S100 kalsiumbindende protein A15 (anti-hS100A15, 1:5000, en gave fra Stuart H. Yuspa, Laboratory of Cancer Biology and Genetics Center for Cancer Research, National Cancer Institute, USA) over natten, etterfulgt av 30 min inkubering med geite-anti-mus IgG konjugert til pepperrot-peroksidase-merket polymer (Envision + system; DakoCytomation, Carpinteria, California, USA). Slides ble utviklet for 5 min med 3,3′-diaminobenzidin kromogen og kontra med haematoxylin. I de negative kontroll vevssnitt ble det primære antistoff erstattes av isotypen spesifikke ikke-immun mus IgG.
Evaluering av immunhistokjemisk farging for S100A15
Hver side ble evaluert for S100A15 farging ved hjelp av en semi- kvantitative poengsystem for både fargeintensitet og prosentandelen av positive tumor /pulmonære epitelceller. IHC farging oversikt ble utført av en uavhengig trent leser (TYW), som var blindet for den kliniske utfall, tumor stadium, og histopatologi. De vevssnitt ble scoret av manuelt telle ≥1000 celler basert på prosentandelen av immunostained celler som: 0-10% = 0; 10-30% = 1; 30-50% = 2; 50-70% = 3 og 70-100% = 4. Snittene ble også mottok en semi-kvantitativt på grunnlag av fargeintensitet som negativ = 0; mild = 1; moderat = 2; og intens = 3. En total poengsum ble oppnådd ved å legge resultatet av prosent positivitet og fargeintensitet, med kjernefysiske og cytoplasma farging scoret uavhengig [26].
Statistical Analysis
Kontinuerlig verdier ble presentert som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Mann-Whitney, Wilcoxon rangert sum, Kruskal-Wallis H, og chi-kvadrat tester ble brukt for å vurdere forskjellene mellom ulike grupper der det er hensiktsmessig. Pearson korrelasjon test ble brukt til å vurdere korrelasjonen mellom to kontinuerlige variabler. Kaplan-Meier metoden ble brukt til å beregne total overlevelse, og Cox regresjonsanalyse med trinnvis frem utvalget ble brukt til å evaluere uavhengige prognostiske faktorer assosiert med overlevelse. Alle testene var to tailed og nullhypotesen ble avvist på p 0,05. En statistisk programvarepakke (SPSS, versjon 15.0, SPSS Inc., Chicago, IL) ble brukt for alle analyser.
Resultater
Mikromatriser fra de 50 fagene som bestått kvalitetskontroll filtre var inkludert i denne studien. De demografiske og kliniske data for disse fagene (30 pasienter med avansert stadium NSCLC og 20 HC), er presentert i tabell ble observert 1. Ingen signifikante forskjeller mellom pasienter og HC med hensyn til alder, kjønn, komorbiditet, og røyking historie . De kreftpasienter inkludert ni stadium IIIB AC, 12 stadium IV AC, 5 stadium IIIB SCC, og fire stadium IV SCC.
Forskjellig uttrykte gener i PBMC Associated med tumorprogresjon
Fra de 22,150 sonder, 4463 (20,16%) transkripsjoner ble uttrykt forskjellig mellom pasientgruppen og HC gruppe ved hjelp av en Mann-Whitney uparede test med en Benjamini-Hochberg FDR av 0,05. For scenen avhengig endring i mRNA uttrykk nivåer fra pasienter med stadium IIIB og IV sammenligne med HC-gruppe, en Kruskal-Wallis test med Benjamini-Hochberg FDR av 0,05 ved en samtidig 1,5 ganger økning ble brukt og 3989 forskjellig uttrykt transkripsjoner ble identifisert. Videre 3858 av disse transkripsjonene krysses med de som finnes i Mann-Whitney test. Ved hjelp av de funksjonelle sti kategorier av GeneSpring sti analyseverktøyet som utvalgskriteriene for videre validering, ble 3858 gensettene deretter analysert for funksjonell annotering på veien nivå. Elleve statistisk forskjellige funksjonskategorier ble kartlagt, og 70 genet transkripsjoner (69 unike gener) som er involvert i utskillelsen, DNA topoisomerase aktivitet, metyltransferase aktivitet, histon acetyltransferase aktivitet, vekstfaktor aktivitet, protein tyrosin fosfatase aktivitet, membran lipid metabolske prosessen, medfødte immunrespons , celleadhesjonsmolekyl bindende, metalloendopeptidase hemmer aktivitet, og cytokin /chemokin mediert signalveier ble identifisert som mulige signaturer av disse funksjonene (Tabell S2).
Forskjellig uttrykte gener i PBMC etter kombinasjonskjemoterapi med CDDP og GEM i Cancer pasienter
for å vurdere virkningene av kjemoterapi på perifere immunceller, ble genuttrykk profiler i de sytten pasienter som fullførte minst fire kurs av CDDP og GEM behandling sammenlignet før og etter kjemoterapi ved hjelp av Mann-Whitney U test for parede observasjoner (p 0,05), og differensial uttrykk for 3576 transkripsjoner ble identifisert. I tillegg ble totalt 669 transkripsjoner krysses mellom forskjellig uttrykt transkripsjoner i sammenkoblede tilfeller ved kjemoterapi og 3858 transkripsjoner identifisert med kreft /staging spesifisitet. Bruke sti analyseverktøyet i GeneSpring GX, ble ni funksjonelle kategorier kartlagt, og 62 genet transkripsjoner (59 unike gener) som involverer medfødte immunrespons, cytokin produksjon, microtubule basert prosess, organisk kation transtransportøraktivitet, sekretoriske vei, DNA topoisomerase (ATP -hydrolyzing) aktivitet, histon metyltransferase aktivitet, histon acetyltransferase aktivitet, og protein tyrosin fosfatase aktivitet ble identifisert fra dette settet med 669 genet transkripsjoner (Tabell S3). Seks gener med høyere uttrykk med tumorprogresjon viste enda høyere uttrykk etter kjemoterapi:
Cysteine rike sekresjonsprotein 3 plakater (
CRISP3
; medfødte immunrespons protein),
signal svinger og aktivator av transkripsjon en product: (
STAT1
cytokin og vekstfaktor reseptor signalise mellommann),
oppløst stoff carrier familie 22 medlem fire plakater (
SLC22A4
; ergothioneine transporter),
synapsin II, avskrift variant IIa product: (
SYN2
; synaptisk transmisjon),
Brain-derived neurotrophic faktor product: (
BDNF
, vekstfaktor for overlevelse og differensiering av nevroner og synaptisk transmisjon),
Kalium stor ledningsevne kalsium-aktivert kanal, underfamilien M, alfa-medlem 1 product: (
KCNMA1
, synaptisk overføring, cellesyklus, og celle migrasjon). Spesielt,
S100A15 plakater (også kalt
S100A7A;
epidermal modning og antimikrobielle forsvar) var oppregulert med tumorprogresjon og snudd til det normale etter kjemoterapi
interleukin 4 (IL4. ) Pathway
Vi har funnet 69 gener for å bli vesentlig forskjellig uttrykt mellom pasienter og friske kontroller, og 59 gener forskjellig uttrykt etter kjemoterapi. For å undersøke om de genene ble uttrykt forskjellig i avansert stadium NSCLC og med kjemoterapi i felles trasé, studerte vi deres tilkobling bruker GeneSpring veien analyseverktøy.
IL4
veien ble betydelig anriket i begge signaturene til tumorprogresjon og kjemoterapi. Blant de 49 gener som er involvert i IL4 vei, ble 11 unike gener (12 genet transkripsjoner) uttrykt forskjellig mellom pasienter og normale kontroller, og 16 unike gener (19 genet transkripsjoner) ble uttrykt forskjellig før og etter kjemoterapi. Skjæringspunktet mellom begge sammenligninger resulterte i 7 unike gener (figur 1 og tabell 2). Spesielt,
chemokin CXC motiv receptor 4 product: (
CXCR4
, 7-trans G-protein kjemokinreseptor for
CXCL12
) var oppregulert, og
docking protein 2 product: (
DOK2
, underlaget av chmeric p210bcr /abl oncoprotein) og
interleukin 2 reseptoren, gamma product: (
IL2RG
, interleukin-reseptor felles gammakjede for
IL2, IL4, IL7, IL9, IL15
, og
IL21
) ble nedregulert med tumorprogresjon, mens uttrykk for disse tre genene endret seg i motsatt retning etter kjemoterapi. På den annen side,
fosfolipase C, gamma 1 product: (
PLCG1
, guanin nucleotide utveksling faktor for kjernefysisk GTPase),
phosphoinositide-3-kinase, katalytisk, delta polypeptid
(
PIK3CD;
autofosforyleringsaktivitet), og
protein kinase C, zeta product: (
PRKCZ
, atypisk isozyme av serin-treonin protein kinase C) som viste redusert uttrykk med tumorprogresjon ble ytterligere nedregulert med kjemoterapi, mens
STAT1
som viste en økt uttrykk med tumor progresjon var lenger oppregulert med kjemoterapi.
elleve av de 49
IL4
sti-involverte gener ble kartlagt i reaksjonsveien anrikning analyse på 3,858 differensielt uttrykte transkripter i PBMC hos pasienter med fremskredet ikke-liten ell lungekreft (NSCLC) og normale kontroller, mens 16 unike gener ble kartlagt for de 669 differensielt uttrykte transkripter i PBMC fra pasienter med fremskreden fase NSCLC før og etter kjemoterapi. Syv krysses gener mellom de to gen-sett ble identifisert og presentert i et Venn diagram. Den blå sirkelen indikerer forskjellig uttrykt gener assosiert med tumorprogresjon utelukkende, den røde sirkelen med kjemoterapi alene, og den lilla sirkelen med begge effekter.
Tydelige uttrykk mønstre Across Tumor Stages og histopatologiske Subtyper
for ytterligere å klargjøre virkningene av både tumorstadium og histopatologiske subtyper på gense signaturer av PBMC ble differensielt uttrykte gener gruppert ved hjelp av en hierarkisk clustering algoritmen med en gjennomsnittlig kobling metode og Euklidsk avstand beregning i Genespring GX. Figur 2 viser todimensjonal hierarkisk clustering av alle kreftpasienter og HC basert på 73 gener som var forskjellig uttrykt blant stadium IIIB AC, stadium IV AC, stadium IIIB SCC, stadium IV SCC, og HC. Klynge 0 er karakterisert ved høye uttrykk i trinn IIIB AC, AC stadium IV, stadium IIIB SCC, og en tilsvarende uttrykk i trinn IV SCC sammenlignet med HC, med en topp uttrykk i stadium IV AC. Dette mønsteret ble sett for 19 av de 73 genene. Klynge 1 ble karakterisert ved høye uttrykk i trinn IIIB AC, stadium IV AC, stadium IIIB SCC, og stadium IV SCC sammenlignet med HC, og en lav ekspresjon i trinn IIIB SCC alene sammenlignet med stadiet IV AC, med en topp uttrykk i stadium IV AC. Dette mønsteret ble sett for 16 av de 73 genene. Cluster 2 var preget av høye uttrykk i stadium IIIB, stadium IV AC, og stadium IV SCC, og en tilsvarende uttrykk i stadium IIIB SCC sammenlignet med HC. Dette mønsteret var den vanligste og sett for 20 av de 73 genene. Klynge 3 ble også karakterisert ved høy uttrykk i trinn IIIB, stadium IV AC, og stadium IV SCC, og en tilsvarende uttrykk i trinn IIIB SCC sammenlignet med HC, men en høyere intensitet av relativ genekspresjon i hvert gen, sammenlignet med det i klynge 2. Dette mønsteret ble sett for 18 av de 73 gener (tabell S4). Blant disse 73 genene, ti overlappet med de 69 genene identifisert i sammenligningen mellom scene IIIB /IV kreftpasienter og friske kontroller:
Transforming growth factor beta 2 plakater (
TGFB2
, modulering av proliferativ aktivitet, cellulær differensiering, og embryologiske utvikling),
Inhibin beta E product: (
INHBE
; apoptotisk funksjon),
platefaktor 4 product: (
PF4;
regulering av leukocytter trafficking),
v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarkom viral onkogen homolog product: (
kIT;
blodkreft vedlikehold, vekst og differensiering),
Protein tyrosin fosfatase reseptor typen N product: (
PTPRN;
hormon og neuropeptid sekresjon),
Phospholipid scramblase fire plakater (
PLSCR4;
transbilayer bevegelse av fosfolipider over plasmamembranen),
inte beta 8 product: (
ITGB8;
TGF-beta aktivering),
S100A15
,
Komp komponent en q delkomponent C-kjeden product: (
C1QC;
utløse komplement klassiske veien og forsterke fagocytose), og
CRISP3
.
(A) Hierarkisk gruppering av pasienter med nydiagnostisert avansert stadium ikke-småcellet lungekreft (n = 30) og friske kontroller (n = 20) i henhold til uttrykk av de 69 genene forskjellig uttrykt blant stadium IIIB adenokarsinom (AC), stadium IV AC, stadium IIIB plateepitelkarsinom (SCC), stadium IV SCC, og friske kontroller (HC). Dataene er presentert i en matrise format: hver rad representerer et gen på microarray og hver kolonne en undergruppe av mRNA prøver. Forholdet mellom hybridisering av fluorescerende cDNA-prober var et mål på relativ genekspresjon i hver forsøksprøve til en referanse mRNA prøve, og er angitt i henhold til følgende fargeskala: rød indikerer et høyt nivå av ekspresjon; blå, lavt nivå av ekspresjon; og gul, betyr ekspresjonsnivået. (B) Normalisert median genuttrykk verdier for klyngen 0-3 gener i fem fagområde (stadium IIIB AC, stadium IIIB SCC, stadium IV AC, stadium IV SCC, HC). Merk at klyngen 1 gener viste høyere uttrykk i alle lungekreftpasienter i forhold til HC. Cluster 0 gener viste lignende uttrykk i stadium IV SCC og HC. Begge klase 2 og 3 genene viste lignende uttrykk i stadium IIIB SCC og HC. Boksplottene viser
th 25, 50
th og 75
th percentil, maksimum og minimum.
Bekreftelse av microarray resultater ved bruk av TaqMan Real-time RT -PCR
for å bekrefte resultatene oppnådd med mikromatriser, ble uttrykket nivåer av seks av de differensielt uttrykte gener med hensyn til avansert stadium lungekreft eller cellegift behandling vurderes av en uavhengig metode for RNA kvantifisering, TaqMan real- time RT-PCR, med de samme RNA prøver som ble brukt for microarray analyse. Sammenligninger av de relative uttrykk nivåer av sanntids kvantitativ RT-PCR for 4 gener som var oppregulert (
S100A15
, p = 0,001, figur 3A;
DOK2
, p 0,001 Figur 3B) eller nedregulert (
toll-like receptor 7 product: (
TLR7
; medfødt immunitet), p 0,001, figur 3C;
topoisomerase I mitokondrie product: (
