Abstract
Nedbrytning av den ekstracellulære matriks (ECM), et avgjørende skritt i kreft metastase, bestemmes av balansen mellom MMP (matriksmetalloproteinaser) og deres hemmere TIMPs (vev hemmere av metalloproteinaser). I kreftceller, er denne balansen forskjøvet mot MMP, fremme ECM degradering. Her viser vi at EZH2 spiller en aktiv rolle i denne prosessen ved å undertrykke uttrykket av TIMP2 og TIMP3 i prostatakreftceller.
TIMP
gener derepressed av knockdown av EZH2 uttrykk i menneskelige prostata kreft celler, men undertrykt av overekspresjon av EZH2 i godartede menneskelige prostata epitelceller. EZH2 katalyserer H3K27 trimethylation og påfølgende DNA metylering av
TIMP
genet arrangører. Overekspresjon av EZH2 overfører en invasiv fenotype på godartet prostata epitelceller; imidlertid denne fenotype trykkes ved cooverexpression av TIMP3. EZH2 knockdown reduserer markant den proteolytiske aktiviteten til MMP-9, og dermed redusere invasiv aktiviteten av prostata kreftceller. Disse resultatene tyder på at transkripsjonen undertrykkelse av
TIMP
gener ved EZH2 kan være en viktig mekanisme for å forskyve MMP /TIMPs balansen i favør av MMP-aktivitet, og derved å fremme ECM nedbrytning og påfølgende invasjon av prostatakreftceller.
Citation: Shin YJ, Kim JH (2012) The Role of EZH2 i forskrift av aktiviteten til matrise metalloproteinaser i prostata kreft celler. PLoS ONE 7 (1): e30393. doi: 10,1371 /journal.pone.0030393
Redaktør: Dean G. Tang, The University of Texas M.D Anderson Cancer Center, USA
mottatt: 02.11.2011; Godkjent: 20 desember 2011; Publisert: 17. januar, 2012 |
Copyright: © 2012 Shin, Kim. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av Grant GM087470 (J-HK) fra National Institute of General Medical Sciences, National Institute of Health. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
eller metastaser-spredning av kreftceller fra en primær område til andre deler av kroppen er et felles trekk ved maligne tumorer. Prosessen med kreft metastaser består av flere, sekvensielle trinn; kreftceller flykte fra den primære svulsten, inn i blodbanen, reiser til fjerne steder, og ekstravasere å danne sekundære kreft nettsider [1]. I løpet av metastasis, kreft celler invadere og migrere gjennom de normale molekylære begrensninger, slik som den ekstracellulære matriks (ECM) [2]. ECM, ofte referert til som bindevevet, er en organisert nettverk av ekstracellulære materialer som omgir og støtter cellene. ECM er sammensatt av et bredt utvalg av polysakkarider og proteiner, slik som laminins, kollagen, fibronektin og proteoglykaner, og spiller en viktig rolle i å bestemme form, utvikling, og biokjemisk funksjon av celler [2]. Stoffet av ECM proteiner utgjør basalmembran (BM) som ligger til grunn for basal overflaten av epitelvev og danner en fysisk barriere mot tumorinvasjon. Kreftceller er i stand til å nedbryte ECM-barrieren ved hjelp av enzymer, noe som resulterte i oppløsning av BM. Mest fremtredende blant de enzymene er matriksmetalloproteinaser (MMP) [3].
MMP er en stor familie av sink-avhengige endopeptidaser og ansvarlig for nedbrytning av ECM [4]. MMP’er har lenge vært kjent for å være assosiert med fysiologiske og patologiske prosesser så som vev-omforming, sårheling, angiogenese, kreft og progresjon [5] – [8]. MMP’er vises i latente proteiner i cytosol (pro-MMP) og gjennomgår proteolytisk spaltning for å gi de modne enzymer, som er i sin tur utskilt og assosiert med celleoverflaten og ECM [9], [10]. Når vist på celleoverflaten, men er MMP’er hemmet av de endogene vev inhibitorer av metalloproteinaser (TIMPs), som direkte binder til de katalytiske domener av MMP i et 01:01 støkiometri [11]. Derfor er balansen mellom MMP og TIMPs avgjørende for eventuell ECM ombygging og degradering. Det menneskelige genom koder fire TIMPs (TIMP1-TIMP4) som er funksjonelt overflødig og hemmer 23 humane MMP [12]. I mange ondartede svulster, er ekspresjon av TIMPs nedregulert, i samsvar med deres rolle som MMP-inhibitorer [13], [14]. Undertrykkelse av TIMP uttrykk ved antisense RNA overfører onkogenisitet på sveitsiske 3T3 celler [15], [16]. Omvendt, overekspresjon av TIMPs resulterer i inhibering av invasjon og metastase av kreftceller [17] – [23]. Disse observasjonene tyder på at undertrykkelse av
TIMP
gener kan være en viktig reguleringsmekanisme for kreft progresjon, men den underliggende mekanismen er fortsatt ikke fullt ut forstått.
EZH2 (polycomb gruppe protein Enhancer av Zeste homolog 2 ) er den katalytiske subenhet av polycomb undertrykkende komplekset 2 (PRC2) [24], [25], og er overuttrykt i mange humane cancere [26]. Tidlige studier har vist at høye nivåer av EZH2 ekspresjon er forbundet med invasjon og metastaser av ondartede tumorer så som bryst og prostata cancer [27] – [31] og det EZH2 overekspresjon forvandler godartet prostataceller RWPE-1 [32] og BPH1 [33 ] og udødeliggjort bryst epitelceller [28]. Nylig, EZH2 har også blitt funnet å regulere signalveier assosiert med cellulær metabolisme som Ras-GTPase-aktiverende protein DAB2IP [34], [35], og den adrenerg reseptor-beta-2 ADRB2 [36], fremme kreft progresjon. EZH2 ser ut til å mekle transkripsjonen stanse ved enten metylering lysin 27 i histon H3 (3meH3K27) [23], [24] eller rekruttere DNA metyltransferaser (DNMTs) til sine mål gener som katalyserer de novo DNA metylering [37]. Imidlertid har de siste rapportene også vist at H3K27 trimethylation av EZH2 ikke er alltid forbundet med promoter DNA metylering for taushet av visse EZH2-målgener [38] – [41]. Den funksjonelle rollen til EZH2 i prostata cancer progresjon har blitt identifisert av genekspresjon profilering av RNA fra nontumorigenic humane prostata epitelceller som overuttrykker EZH2 [27]. Imidlertid ble de resultater som ble funnet ikke å endre betydelig ekspresjonsnivåene til mange metastase-assosierte gener som ble identifisert ved genetisk profilering av humane prostatacancerceller [42]. Naturen i dette avviket er uklart, men det kan oppstå forskjeller i uttrykk nivåer av EZH2 i prostata kreft celler testet.
I denne studien har vi undersøkt hvilken rolle EZH2 i aktivering av MMP å fremme invasjon og metastase av prostata kreft celler. For å identifisere de metastaseassosierte gener reguleres av EZH2 i prostatakreft, mRNA uttrykk i svært invasive prostata kreft celler der EZH2 uttrykk ble slått ned ble profilert bruker menneskelige metastase PCR arrays. Vi fant at høye nivåer av EZH2 uttrykk under kreft progresjon indusere undertrykking av
TIMP
gener (
TIMP2 Hotell og
TIMP3
), som fører til økt aktivitet av MMP-9 og dermed til økt invasiv aktivitet av prostatakreftceller. Disse resultatene gir for første gang bevis for at EZH2 spiller en aktiv rolle i skiftende MMP /TIMPs balanse mot MMP og dermed fremme metastasering av prostata kreft celler.
Resultater
EZH2 knockdown reduserer invasive og trekkende aktiviteter prostata kreft celler
for å undersøke om høye nivåer av EZH2 uttrykk er korrelert med invasiv fenotype av prostata kreft celler, vi først bestemt protein nivåer av EZH2 i menneskelige prostata cellelinjer (LNCaP, PC3, og DU145). Vår Western blot-analyse viste at EZH2 signifikant forhøyet i kreftcellelinjer enn i den humane benign prostata epitelcellelinje RWPE-1 (figur 1A). Vi undersøkte deretter invasiv aktivitet av prostata kreft celler uttrykker ulike nivåer av EZH2 protein ved hjelp av Transwell Boyden kammeret analysen. For å oppnå dette, ble EZH2 uttrykk slått ned ved hjelp av to ulike EZH2 spesifikke shRNAs, SH1 eller sh2 (figur 1C, øverst). PC3 og DU145 cellene var meget inngripende, sammenlignet med de godartede RWPE-1 celler (Figur 1b). Men EZH2 knockdown betydelig redusert invasivitet av prostata kreft celler (figur 1C, midten); bare 18~20% av prostata kreft celler infisert med lentivirus som uttrykker EZH2 målretting shRNA penetrert BME membranen i kammeret (SH1 og SH2), sammenlignet med de celler infisert med kontroll (NT, nontargeting shRNA) lentivirus (figur 1C, bunn ). Tvert imot, overekspresjon av EZH2 tillagt en invasiv fenotype på RWPE-1-celler (figur 1D, WT); Men RWPE-1 celler som overuttrykker en mutant EZH2 protein (EZH2-H689A) med betydelig redusert HMT aktivitet [44] ikke vise invasiv aktivitet (figur 1D, H689A). Fordi EZH2 spiller en aktiv rolle i prostatakreft invasjon (Tall 1C og 1D), undersøkte vi videre den vandrende aktivitet DU145 cellene ved hjelp av sårhelende migrasjon analysen (figur 1E, øverst). Vi fant at celler DU145 fylle ~80% og -50% av de sårede områder før (NT) og etter (SH1) knockdown av EZH2 uttrykk, respektivt, ved 24 timer etter skraping (figur 1E, nederst). Disse resultatene antyder sterkt at høye nivåer av ekspresjon EZH2 fremme invasjon og migrering av prostata kreftceller.
(A) Western blot-analyse av EZH2 ekspresjon i benign prostata cellelinje RWPE-1 og ondartet prostatacancercellelinjer LNCaP, DU145 og PC3 (øverst). Aktin ble anvendt som en intern kontroll. Proteinbåndene ble kvantifisert ved hjelp Antall Én programvare (Bio-Rad) (nederst). (B) Invasion analyse av RWPE-en, PC3 og DU145 cellene. Celle invasivitet ble bestemt ved invasjon av celler gjennom BME-belagte innsatser i Transwell Boyden kammer (øverst). Invasjonen Hastigheten ble bestemt ved å telle cellene som migrerte gjennom innleggene og uttrykt som prosent i forhold til kontroll (RWPE-1, satt til 100%) (nederst). Hver søyle representerer gjennomsnitt ± bred singlett av fem felt telles. (C) Western blot analyse av EZH2 uttrykk i PC3 og DU145 cellene etter en infeksjon med EZH2 spesifikke shRNA lentivirus (SH1 eller sh2, to forskjellige EZH2-spesifikke shRNAs) eller med ubehandlet shRNA (NT, kontroll) lentivirus (øverst) . Invasjon analysen av PC3 eller DU145 cellene etter en infeksjon med EZH2 spesifikke shRNA (SH1 eller sh2) eller kontroll (NT) lentivirus (i midten). Representative felt av invadert og fargede celler er vist (i midten). Hver søyle representerer middelverdi ± bred singlett av fem felt telles (nederst). (D) Western blot-analyse av overekspresjon av vill-type (WT) og mutant (H689A, enzymatisk inaktive) EZH2 proteiner i RWPE-1 celler infisert med EZH2 (WT) -GFP, EZH2 (H689A) -GFP, eller kontroll (GFP vektor) lentivirus. EZH2 proteiner ble uttrykt fra CMV-promoter (til venstre). Invasjon analyse av RWPE-1 celler infisert med EZH2 (WT) -GFP, EZH2 (H689A) -GFP, eller kontroll (GFP vektor) lentivirus (høyre). (E) sårtilheling analyse av DU145 celler infisert med EZH2 spesifikke shRNA (SH1) eller kontroll shRNA (NT) lentivirus. Bilder ble tatt før (0 timer) og etter at såret (24 h) (øverst). Resultatene ble uttrykt som prosentandel av det resterende området bestemmes ved å normalisere arealet av såret etter 24 timer til utgangs sårområdet ved 0 t (fastsatt til 100%). Hver søyle representerer gjennomsnitt ± SE av fem felt målt (nederst)
* P. 0,05
,
** p 0,005 *** p 0,001 plakater (sammenlignet med kontrollverdier) .
Identifikasjon av nedstrøms målgener av EZH2 forbundet med spredning av prostatakreft
for å identifisere metastaseassosierte gener hvis uttrykk er regulert av EZH2 undersøkte vi genuttrykk endringer i invasiv prostata kreft celler etter EZH2 knockdown. Uttrykk av forskjellige mRNA i prostatakreftceller ble vurdert ved hjelp av menneskelig metastase RT
2
Profiler
™ PCR Array (PAH-028D) designet for å representere 84 gener som er kjent for å være involvert i metastase (figur 2A og 2B). Resultatene viste at ekspresjon av 12 og 32 genene er endret 2-fold i DU145 (tabell S1) PC3 (fig S1A og S1B og Tabell S2) -celler, respektivt, ved knockdown av EZH2 uttrykk. Blant disse genene, ble TIMP3 funnet å være genet som er mest sterkt oppregulert i både DU145 og PC3-celler (figurene 2B og S1B), som fører til den hypotese at TIMP3 kan være et primært mål for undertrykkelse av EZH2. For å teste denne hypotesen, vi undersøkte proteinnivåer TIMP3 og EZH2 ved immunhistokjemi hjelp av anti-EZH2 og anti-TIMP3 antistoffer (Figur 2C). Som vist på bildene immunofarging, TIMP3 proteinnivåer var høy i normalt vev prostata (figurene 2C-e og 2C-f), men knapt synlig i prostata kreftvev (figurene 2C-2C og g-h). Lignende resultater ble oppnådd ved RT-PCR-analyse som viser at TIMP3 mRNA-nivåer blir markert redusert i PC3 og DU145-celler, sammenlignet med de RWPE-1-celler (Figur S1C). I motsetning til dette, EZH2 proteinnivåer var meget høy i prostata kreftvev (figurene 2C-c og 2C-d) sammenlignet med normalt vev prostata (figurene 2C-a og 2C-b). Disse observasjonene tyder på at uttrykk for TIMP3 og EZH2 er negativt korrelert, sannsynligvis på grunn av nedregulering av TIMP3 uttrykk ved EZH2.
(A) RT
2 profiler PCR utvalg for menneskemetastase gener i DU145 cellene etter en infeksjon med EZH2 spesifikke shRNA eller kontroll (NT) lentivirus. Den punktplott av testen
vs
kontrollprøvene indikerer gyldigheten av forsøket. (B) 12 gener som uttrykk er sterkt påvirket av EZH2 knockdown vises (også se tabell S1 og S2). Total RNA ble isolert fra DU145 cellene etter en infeksjon med EZH2 spesifikke shRNA eller kontroll (NT) lentivirus og behandlet for immunfluorescens bilder av normal prostata (Normal 1 og Normal 2) og vevssnitt (PCa1 og PCa2 prostata svulst PCR array (C) ), ved anvendelse av anti-EZH2 antistoff (grønn) og anti-TIMP3 antistoff (rød). Kjerner ble farget med DAPI (blå).
nedregulering av TIMP3 uttrykk ved EZH2 i prostatakreftcellelinjer
For å undersøke dette nærmere transkripsjons undertrykkelse av TIMP3 uttrykk ved EZH2, vi kvantitativt bestemmes TIMP3 mRNA og proteinnivåer i tre prostatakreft cellelinjer (LNCaP, PC3 og DU145) med og uten knockdown av EZH2 uttrykk. TIMP3 mRNA-nivåer ble funnet å være ~10-13 ganger høyere i kreftceller behandlet med EZH2 spesifikke shRNA (SH1) enn ubehandlede kontrollceller med shRNA (figur 3A), og som et resultat ble TIMP3 protein nivåer betydelig øket ved knockdown av EZH2 uttrykket (figur 3B). I motsetning til dette ble overekspresjon av den funksjonelle EZH2 (WT), men ikke av den mutante EZH2 protein (H689A), vist seg å redusere TIMP3 mRNA og proteinnivåene i RWPE-1-celler (Figur 3C). Nedregulering av ekspresjon av TIMP3 EZH2 ble også bekreftet ved immunfarging av TIMP3 i DU145 celler infisert med EZH2 spesifikke shRNA lentivirus (SH1) eller kontroll (nontargeting shRNA) lentivirus (NT) (figur 3D). TIMP3 proteinnivåer var lav i DU145-celler (figur 3D-c), men signifikant forhøyet ved knockdown av EZH2 uttrykket (figur 3D-h). Dermed kan TIMP3 være et mål av EZH2 for undertrykkelse i prostata kreft celler.
(A) QRT-PCR analyse av uttrykk for TIMP3 i prostatakreftceller (LNCaP, DU145 og PC3) etter en infeksjon med EZH2 spesifikke shRNA (SH1) eller kontroll shRNA lentivirus (NT).
* P 0,05
,
** p 0,005 plakater (sammenlignet med kontroll (NT)). (B) Western blot analyse av endogene nivåer av EZH2 og TIMP3 protein i prostatakreftceller (LNCaP, DU145 og PC3) infisert med EZH2 spesifikke shRNA (SH1) eller kontroll shRNA virus (NT). Aktin ble anvendt som en intern kontroll. (C) Western blot (øverst) og QRT-PCR (nederst) analyser av ekspresjon av EZH2 og TIMP3 i benign prostata RWPE-1-celler etter en infeksjon med EZH2 (WT) -GFP, EZH2 (H689A) -GFP, eller kontroll (GFP vektor) lentivirus. Aktin ble anvendt som en intern kontroll.
* P 0,05
,
** p 0,005 plakater (sammenlignet med kontroll (vektor)). Den solide pilen indikerer EZH2-GFP uttrykt fra CMV arrangøren, den stiplede pilen indikerer endogen EZH2. (D) Farging av EZH2 og TIMP3 uttrykt i DU145 celler infisert med EZH2 spesifikke shRNA (SH1) eller kontroll (NT) lentivirus, ved anvendelse av anti-EZH2 antistoff (grønn) og anti-TIMP3 antistoff (rød). Kjerner ble farget med DAPI (blå). De sammenslåtte bildene ble også vist (EZH2 /TIMP3 og DAPI /TIMP3).
epigenetisk stanse av TIMP3 uttrykk ved EZH2
EZH2 er en del av PRC2 som katalyserer trimethylation av H3K27 ( 3meH3K27) [24], [25]. For å utforske den underliggende mekanismen av epigenetisk undertrykkelse av TIPM3 av EZH2 undersøkte vi effekten av histone metylering inhibitor 3-deaza-naplanocin A (DZNep) på uttrykk for TIMP3. DZNep behandling resulterte i reduserte nivåer av TIMP3 protein (figur 4A), sannsynligvis ved å forårsake derepresjon av TIMP3 uttrykk (figur 4B). Videre invasiv potensialet i PC3 cellene var ~ 5-ganger redusert med DZNep behandling (Figur 4C).
(A) Western blot analyse av endogene nivåer av EZH2, TIMP3 og 3meH3K37 i prostatakreftceller (PC3 celle) etter behandling med DZNep (5 uM) eller DMSO (kontroll) i 2 dager. Aktin ble anvendt som en intern kontroll. (B) QRT-PCR analyse av uttrykk for TIMP3 i PC3 celler behandlet med DZNep (5 mm) eller DMSO (kontroll). (C) Invasion analyse av PC3 celler behandlet med DZNep (5 mm) eller DMSO (kontroll).
For å studere videre den molekylære mekanismen av transcriptional undertrykkelse av TIMP3 uttrykk ved EZH2, vi utførte chip analyser i DU145 og PC3-celler ved bruk av anti-EZH2 og anti-3meH3K27 antistoffer. Fordi PCG proteiner er rekruttert til DNA via DNA-bindende protein YY1 [45], ble immunopresipitert DNA analysert ved PCR med primer sett designet for å forsterke regioner som inneholder YY1-bindingsseter i
TIMP3
promoter ( Figur 5A). Resultatene tyder på at: 1) EZH2 binder til
TIMP3
promoter og katalyserer trimethylation av H3K27 (3meH3K27) (Tall 5B og 5C), men binder seg ikke til
GAPDH
promoter, servert som en negativ kontroll (figur 5C); 2) RNA polymerase II (rnap II) binder sterkt til
GAPDH
arrangøren, men har ingen vesentlig binding til
TIMP3
promoter (figur 5C). Disse resultatene tyder på at EZH2-mediert trimethylation av H3K27 hindrer rnap II fra binding til
TIMP3
promoter og dermed resulterer i transcriptional stanse av genet.
(A) Skjematisk fremstilling av promoter-regionen av
TIMP3
genet. Den bøyde pilen representerer transkripsjon startsider (+1). Linjene under
TIMP3
locus representerer regionene forsterket av PCR. (B-C) immunopresipitert DNA ble analysert ved PCR med spesifikke primersett (se også tabell S3). Kromatin oppnådd fra PC3 (B) og DU145 (C) celler ble immunopresipitert ved anvendelse av antistoffer for å EZH2, trimetyl-histon H3K27 (3meH3K27), RNA polymerase II (Pol II), og IgG. Den immunopresipitert DNA ble analysert ved PCR med primeren sett for å forsterke området 4 i figur 5A.
GAPDH
promoter ble brukt som en negativ kontroll. Hver brikke eksperiment ble gjentatt minst tre ganger, og et representativt eksperiment er vist. (D) epigenetisk regulering av TIMP3 uttrykk i PC3 celler. ChIP Analysen ble utført ved anvendelse av antistoffer mot EZH2, 3meH3K27, MeCP2, rnap II (Pol II), og IgG-kontroll etter behandling med DZNep (1 uM), 5-Aza (10 uM), DMSO (kontroll), eller EZH2- spesifikk shRNA (shRNA1). Den immunopresipitert DNA ble analysert ved PCR med primeren sett for å forsterke området 4 i figur 5A. (E) QRT-PCR-analyse av ekspresjon av TIMP3 i PC3-celler etter behandling med DZNep (1 uM), 5-Aza (10 uM) eller DMSO (kontroll) i 2 dager. Forsøkene ble gjentatt minst to ganger, og resultatene ble uttrykt som et forhold mellom TIMP2 eller TIMP3 mRNA for GAPDH mRNA kontroll.
* P 0,05
,
** p 0,005 plakater (sammenlignet med kontroll (DMSO))
neste avgjort om H3K27 trimethylation er kombinert med. promoter DNA metylering for undertrykkelse av TIMP3, behandlet vi PC3 celler med DZNep eller DNA metylering hemmer 5-Aza fulgt av Chip analyse. EZH2 knockdown eller DZNep behandling markert hemmet både H3K27 trimethylation og DNA metylering (MeCP2, metyl CpG bindende protein 2) i
TIMP3
arrangøren; i motsetning til 5-Aza behandling inhiberte bare DNA-metylering, men hadde ingen signifikant effekt på H3K27 trimethylation av promoteren (figur 5D). Videre behandling av PC3-celler med DZNep eller 5-Aza resulterte i derepresjon av TIMP3 uttrykk til nesten den samme grad (figur 5E). Dermed disse resultatene tyder på at transkripsjonen undertrykkelse av
TIMP3
genet skjer gjennom EZH2-mediert H3K27 trimethylation og påfølgende DNA metylering.
epigenetisk stanse av TIMP2 uttrykk ved EZH2
Vi neste undersøkt om, som TIMP3, er tre andre TIMPs (TIMP1, TIMP2 og TIMP4) transcriptionally trykt av EZH2. Vår RT-PCR-analyse viste at TIMP1 ikke ble regulert av EZH2, mens TIMP4 ble undertrykt når EZH2 uttrykk er slått ned (figur 6). I motsetning til dette ble TIMP2 ekspresjon betydelig øket ved EZH2 knockdown, men ble ikke øket når den mutante EZH2 proteinet (EZH2-H689A) blir uttrykt. Våre Chip studier viser at TIMP2, som TIMP3, er også underlagt EZH2-mediert histon metylering og påfølgende promoter DNA metylering (figur 7). Nedregulering av
TIMP2
genet i prostatakreftceller ble vist å være assosiert med arrangøren metylering [13], noe som tyder på at epigenetiske regulatoriske faktorer, som HDAC og DNMT, kan være involvert i reguleringen av TIMP2. Våre resultater viser at det modifiserende middel epigenetisk EZH2 kan være den faktor som formidler epigenetisk inaktivering av TIMP2
(A-C) QRT-PCR-analyse av ekspresjon av
TIMP
gener (A, TIMP1.; B, TIMP2, C, TIMP4) i prostatakreftceller (LNCaP, DU145 og PC3) etter en infeksjon med EZH2 spesifikke shRNA (SH1) eller kontroll shRNA lentivirus (NT).
* P 0,05
,
** p 0,005 plakater (sammenlignet med kontroll (NT)). (D-F) QRT-PCR analyse av uttrykk for
TIMP
gener (D, TIMP1, E, TIMP2 F TIMP4) i benign prostata cellelinje RWPE-en etter en infeksjon med EZH2 overekspresjon lentivirus ( WT eller H689A) eller kontroll virus for 4 dager. Resultatene ble uttrykt som forholdet mellom
TIMP
mRNA til
GAPDH
mRNA kontroll.
* P 0,05
,
** p 0,005 plakater (sammenlignet med kontrollgruppen (GFP))
(A) Skjematisk fremstilling av promotorområdene av.
TIMP2
genet. Den bøyde pilen representerer transkripsjon startsider (+1). Linjene under
TIMP2
locus representerer regionene forsterket av PCR hjelp primersett (sett 1, sett to, og satt tre i (B), satt to i (C) og (D)) designet for å forsterke regioner som inneholder YY1-bindingsseter (se tabell S3). (B-C) Chromatin immunoutfellingsstudier (chip) eksperimenter ble utført med kromatin isolert fra PC3 (B) og DC145 (C) celler ved anvendelse av antistoffer mot EZH2, 3meH3K27, og IgG. Resultater av vår chip i begge PC3 og DU145 cellene er svært lik hverandre. Vist er chip resultater i DU145 cellene. (D) epigenetisk regulering av TIMP2 uttrykk i PC3 celler. ChIP Analysen ble utført ved anvendelse av antistoffer mot EZH2, 3meH3K27, MeCP2, rnap II (Pol II), og IgG-kontroll etter behandling med DZNep (1 uM), 5-Aza (10 uM), DMSO (kontroll), eller EZH2- spesifikk shRNA (shRNA1). (E) QRT-PCR-analyse av ekspresjon av TIMP2 i PC3-celler etter behandling med DZNep (1 uM), 5-Aza (10 uM) eller DMSO (kontroll) i 2 dager. Forsøkene ble gjentatt minst to ganger, og resultatene ble uttrykt som forholdet mellom
TIMP2
mRNA til
GAPDH
mRNA kontroll.
* P 0,05
,
** p. 0,005 plakater (sammenlignet med kontroll (DMSO))
Transkripsjonell undertrykkelse av TIMP3 av EZH2 fremmer invasjon av prostata kreft celler
for å vurdere den funksjonelle sammenhengen mellom nedregulering av TIMP3 av EZH2 (figur 3) og redusert invasiv fenotype av prostatakreftceller ved EZH2 knockdown (Tall 1C og 1D), overexpressed vi EZH2 og TIMP3 separat eller sammen i RWPE-1-celler (figur 8A) og undersøkt invasiv aktiviteten av cellene ved hjelp av Transwell Boyden kammer analysen (figur 8B). Den invasiv fenotype av RWPE-1 celler ble indusert av EZH2 overekspresjon observert ovenfor (figur 1D), men det var betydelig undertrykt av cooverexpression av TIMP3 (figur 8B), som gir direkte bevis for at undertrykkelsen av TIMP3 av EZH2 resulterer i økt invasiv aktivitet av prostata kreft celler.
(A) Western blot analyse av EZH2 og TIMP3 uttrykk i RWPE-1 celler etter en infeksjon med de angitte kombinasjoner av lentivirus uttrykker EZH2, TIMP3 og kontroll virus. (B) invasjon analyse av RWPE-1-celler etter en infeksjon med de angitte kombinasjoner av lentivirus som uttrykker EZH2, TIMP3 og kontrollvirus. Top: a, EZH2 (-) /TIMP3 (-); b, EZH2 (-) /TIMP3 (+); c, EZH2 (+) /TIMP3 (-); d, EZH2 (+) /TIMP3 (+). (C) Gelatin zymographic assay for MMP-2 og MMP-9 aktivitet i PC3 og DU145 celler infisert med EZH2 spesifikke shRNA (SH1) eller kontroll shRNA virus (NT). De øvre og nedre bånd indikerer aktiv MMP-9 (92 kDa) og aktiv MMP-2 (62 kDa), respektivt. Zymographic bandet intensiteter ble kvantifisert ved densitometri hjelp Antall Én programvare (Bio-Rad). Hver søyle representerer gjennomsnitt ± bred singlett av tre felt telles.
* P 0,05
,
** p 0,005
,
*** p 0,001 plakater (sammenlignet med kontroll (NT))
MMP-2 og MMP-9 er kjent for å være de fremtredende MMP’er som er ansvarlige for nedbrytning ECM, og dermed vi undersøkt hvorvidt enzymatisk aktivitet av disse to MMP’er er regulert ved hjelp av EZH2 gelatin zymografi analysen. MMP-2 aktivitet ble funnet ikke å være vesentlig endret ved EZH2 knockdown. Imidlertid ble MMP-9 aktivitet ble redusert med ~28% i PC3-celler og -50% i DU145-celler, respektivt, ble behandlet med EZH2 spesifikk shRNA, sammenlignet med kontrollceller (NT) (figur 8C). Samlet utgjør disse resultatene tyder på at EZH2-mediert transcriptional undertrykkelse av TIMP3 direkte fører til aktivering av MMP-9.
Diskusjoner
Balansen mellom MMP og TIMPs er en kritisk parameter for nedbrytning av ECM og dermed et viktig skritt for kreft invasjon og metastasering. I denne studien, viser vi at avvikende oppregulering av EZH2 uttrykk i prostatakreftceller skifte denne balansen mot MMP og dermed fremme nedbrytning av ECM. EZH2 gjør dette ved downregulating uttrykk for
TIMP
gener (
TIMP2 Hotell og
TIMP3
). TIMP2 og TIMP3, sammenlignet med TIMP1 og TIMP4, hemme et bredt spekter av MMP og flere av disintegrin-metalloproteinaser, Adams og ADAMTSs [12]. Videre er TIMP3 den eneste medlem av TIMP familien som er tett bundet til ECM, og således er implisert i patogenesen sykdom [9], [10]. TIMP3 har også en hemmende effekt på angiogenese ved blokkering av VEGF-bindingen til VEGF-reseptor-2 [46] og en evne til å fremme apoptose [47] – [49]. Derfor transkripsjons undertrykkelse av TIMP2 og TIMP3 av EZH2 sannsynlig forbedrer ECM degradering og angiogenese men reduserer apoptotisk aktivitet, favoriserer kreftcelle invasjon og metastasering.
Tilstedeværelsen eller forhøyet uttrykk for noen av MMP er positivt assosiert med kreft progresjon [3], [50]. Våre metastase PCR rekke analyse viser at noen
MMP
gener, for eksempel
MMP7 Hotell og
MMP13
, i PC3 cellene ble markert nedregulert med knockdown av EZH2 uttrykk (figur S1) . Dermed synes EZH2 å fungere som en aktivator, i stedet for en repressor, av ekspresjonen av disse gener. Imidlertid, disse resultatene var ikke tydelig observert i DU145-celler, kanskje på grunn av forskjellige genetiske bakgrunner mellom de to cellelinjene [51]. Mens transkripsjonsregulering av MMP gener ved EZH2, som var ute av omfanget av denne studien, er for tiden under etterforskning, støtter våre resultater muligheten for at overekspresjon av EZH2 med metastatisk prostata kreft celler kan heve generelle MMP aktivitet både ved å redusere nivåene av TIMPs (TIMP2 og TIMP3) og ved å øke nivåene av enkelte MMP’er slik som MMP-9.
promotor-DNA-metylering er den vanligste epigenetisk modifikasjon assosiert med genet Slå på kreft. EZH2 ser ut til å rekruttere DNMTs til sine mål gener, noe som resulterer i metylering av tilstøtende CpG øyer og påfølgende genet Slå [37]. I denne modellen, kan EZH2-mediert H3K27 metylering være en forutsetning for promotor-DNA-metylering. Våre resultater støtter denne ideen, som vi har observert at
TIMP2 Hotell og
TIMP3
, som andre EZH2 målgener som
MSMB product: [31],
RUNX3
[52], og
SLIT2 product: [39], er brakt til taushet gjennom histon (H3K27) metylering fulgt av DNA metylering (figur 5 og 7). Imidlertid er promotor-DNA-metylering ikke alltid er nødvendig for undertrykkelse av de EZH2 målgener. For eksempel, EZH2-mediert stanse av E-cadherin genet skjer gjennom H3K27 metylering men krever ikke promoter DNA metylering [38]. I tillegg er H3K27 trimethylation ikke forbundet med promotor-DNA-metylering for lyddemping av et betydelig antall EZH2 målgener i prostata kreft [41]. Derfor er videre studier er nødvendig å skille disse mekanismene.
For at kreftceller til å metastasere, må de bryte fri fra de vanlige fysiske barrierer, til migrasjon og invasjon, for eksempel ECM og celle-celle adhesjon. Videre nedbrytning av ECM frigjør signalmolekyler som er knyttet til ECM, slik som vekstfaktorer og cytokiner, som i betydelig grad påvirker metastase [53]. Således ECM nedbrytning av MMP’er er av sentral betydning for ikke bare å eliminere barrierer, men også å gjøre signaleringsmolekyler som er tilgjengelige for kreftceller. Som vist i denne studien, EZH2, som fungerer som en potensiell onkogen i ulike kreftformer, spiller en aktiv rolle i oppregulering av MMP aktivitet og fremme ECM degradering og påfølgende invasjonen av prostata kreft celler, noe som gir en ny innsikt i rollen som EZH2 i prostatakreft metastase
Materialer og metoder
Cell kultur
Alle cellelinjer brukt i denne studien ble innhentet fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD).. PC3, DU145 og LNCaP-celler ble dyrket i RPMI 1640 med 10% FBS og penicillin /streptomycin ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2.
