Abstract
Inhibering av carcinogenese kan være en konsekvens av dempning av oksidativt stress via aktivering av antioksidantforsvar system, restaurering og stabilisering av tumor-suppressor-proteiner sammen med modulering av inflammatoriske mediatorer. Tidligere har vi avgrenset betydelig rolle curcumin i løpet av sin langsiktige effekten i reguleringen av glykolysen og angiogenese, som igjen resulterer i forebygging av kreft via module stress aktivert gener. Studien var designet for å undersøke langsiktige effekten av curcumin i reguleringen av Nrf2 medierte fase-II antioksidant enzymer, tumor suppressor p53 og betennelse i henhold oksidativt svulstens mikromiljø i leveren av T-cellelymfom bærende mus. Inhibering av Nrf2 signaler observert under lymfom progresjon, resulterte i nedregulering av fase II antioksidantenzymer, p53, så vel som aktivering av inflammatoriske signaler. Curcumin forsterkes betydelig økning i Nrf2 aktivering. Det restaurerte aktivitet av fase II-antioksidant enzymer som GST, GR, NQO1, og tumor suppressor p53 nivå. I tillegg er curcumin modulerte betennelse via oppregulering av TGF-β og gjensidig regulering av iNOS og COX2. Studien antyder at under langvarig effekt, fører curcumin til forebygging av kreft ved å indusere fase II-antioksidant enzymer via aktivering av Nrf2 signalering, restaurering av tumor suppressor p53 og modulering av inflammatoriske mediatorer som iNOS og COX2 i leveren av lymfom bærende mus.
Citation: Das L, Vinayak M (2015) langsiktige effekten av Curcumin i Restaurering av Tumor suppressor p53 og fase-II antioksidant enzymer via Aktivering av Nrf2 Signale og Modulation av Betennelse i forebygging av kreft. PLoS ONE 10 (4): e0124000. doi: 10,1371 /journal.pone.0124000
Academic Redaktør: Gautam Sethi, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, SINGAPORE
mottatt: 03.12.2014; Godkjent: 24 februar 2015; Publisert: 10 april 2015
Copyright: © 2015 Das, Vinayak. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. arbeidet ble støttet med tilskudd fra Institutt for vitenskap og teknologi (Grant No.-SR /S0 /AS-97/2007), Government of India til MV. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Nuclear faktor E2 relatert faktor to (Nrf2) er en kritisk transkripsjonsfaktor som binder seg til promotor-regionen av et antall gener som koder for fase-II-antioksidant enzymer [1]. Nrf2 er korrelert med rutineavgiftningsprosessen og dens økte ekspresjon er beskrevet i murine lever, tarm, lunge og nyre. Det eksisterer høy likheten mellom Nrf2 bindingssekvens (NF-E2 konsensussekvensen) og antioksydant responselement (ER) som er regulerende elementer i promoter-regionen i fase-II-antioksidant enzymer som GST og NQO1. GST har beskyttende rolle mot oksidative prosesser og spiller en avgjørende rolle i avgiftning av ulike xenobiotics i ondartede celler eller vev. GST oppviser også flere ikke-katalytiske funksjoner som intracellulær transport av et bredt spekter av hydrofobe ligander og modulering av signaltransduksjon vei som fører til sekvestrerende av kreftfremkallende [2]. NQO1 er et cytosolisk flavoprotein, uttrykt konstitutivt i en lang rekke pattedyrvev og cellelinjer. Det katalyserer to-elektron-reduksjonen av flere miljøelektrofile forurensninger og endogene forbindelser, forhindrer generering av ROS, rensker oksygenradikaler og derved viser en direkte rolle i beskyttelsen mot oksidativt stress. NQO1 regulerer stabilitet av p53 som respons på oksidativt stress [3]. Tumor suppressor p53 begrenser unormale celler ved induksjon av veksthemming /utløser apoptose. p53 viser også antioksidant egenskap som beskytter genomet fra oksydasjon av ROS, noe som er en viktig årsak til DNA-skade og genetisk ustabilitet som fører til onkogene transformasjon [4, 5]. Nrf2 er kritisk for å opprettholde glutation (GSH) redox state via transkripsjonsregulering av GR [6]. GSH er et fremherskende intracellulær tiol inneholdende antioksidant i leveren. Det viser allsidige funksjoner som regulering av genekspresjon, apoptose og antioksidantforsvar mot modulering av celleproliferasjon. p53 mangelkreftceller er rapportert å oppvise redusert induksjon av Nrf2 målgener sammenlignet med p53-dyktige celler, noe som tyder viktig rolle i aktivering av p53 Nrf2 i kreftceller [7].
Wild-type p53 og TGF β er viktige kreftdemper som regulerer en rekke cellulære responser. p53 fysisk samhandler med Smads og co-ordinately induserer transkripsjon av en rekke sentrale svulst undertrykkende gener [8]. TGF-beta fungerer som en anti-proliferativ faktor på tidlige stadier av kreft og regulerer cellesyklus via nedstrøms målgener involvert i å drive celleproliferasjon [9, 10]. Det induserer apoptose i humane lymfomceller og undertrykker inflammasjon [11, 12, 13]. Fremme av betennelsen er regulert av COX2 via syntese av PGE2 i ulike vev. Ekspresjon av COX2 samt PGE2 produksjon blir regulert av TGF-β1 [14, 15, 16]. COX2 ofte co-uttrykt med iNOS og begge er involvert i kreftutvikling ved å regulere proliferasjon, apoptose og angiogenese etc. iNOS spiller en sentral rolle i mediering av inflammasjon via nitrogenoksid (NO) biosyntese, som i sin tur modulerer ekspresjon og COX2 PGE2-syntese i betennelsestilstand [17]. Moderat økt nivå av iNOS ekspresjon fremmer tumorvekst, mens ytterligere økning i nivået er rapportert å være cytotoksiske for tumorceller, således iNOS viser dobbeltrolle i løpet av tumorutvikling [18]. Liver er rapportert å ha en særegen eiendom der kreftceller induserer endogent NO frigjøring via oppregulering av iNOS, som fører til avliving av sinusformet svulst celle og redusert levermetastaser [19]. Å være en stor metabolske og avgifte organet i kroppen, tar leveren aktiv rolle i anti oxidative forsvarssystem og er sterkt påvirket i fremskreden kreft. Metastase og malignitet har blitt bekreftet tidligere i leveren for Dalton lymfom lageret (DL) mus [20].
Bruken av hel ekstrakt av urtekilde eller enkelt-isolerte bestanddel eller en metabolitt av en isolert bestanddel, for å oppnå ønskelig helsemessige fordeler har vært et problem de siste årene. Curcumin er et polyfenoliske phytochemical rapportert å hemme kjemisk indusert kreftutvikling på flere organ steder i ulike dyremodeller. Hurtig metabolisme og eliminering er viktige faktorer for lav biotilgjengelighet av curcumin ved vevsnivåer, uavhengig av administrasjonsveien, selv om metabolittene av curcumin forbli i lengre tid i forskjellige vev. Men langsiktige effekten av curcumin, etter uttak av administrasjonen er fortsatt å bli rapportert. Det er ikke klart hvorvidt antikreftfremkallende virkning av curcumin er på grunn av den kumulative virkning av dens metabolitter, eller på grunn av curcumin seg selv. Videre er det bevist at forbruket av hel eller delvis rensede mat ekstrakter er mer fordelaktig enn én isolert bestanddel på grunn av eksistensen av synergistiske interaksjoner mellom fytokjemikaliene i hele matvarer [20, 21]. Vi har tidligere rapportert at antikarsinogene virkning av curcumin i løpet av dens langvarig virkning medieres via regulering av glykolysen og angiogenese, som et resultat av den konsekvens for modulering av stressgener aktivert [20]. Denne studien er designet for å undersøke langsiktige effekten av curcumin i reguleringen av Nrf2 mediert fase-II antioksidant enzymer, tumor suppressor p53 og betennelse i henhold oksidativt svulstens mikromiljø i metastatisk lever av Dalton lymfom bærende mus.
Materialer og metoder
Chemicals
Alle kjemikalier var av analytisk og molekylærbiologi karakter, så vel som endotoksin fri, og anvendt uten ytterligere rensing. Curcumin, ble reagenser for RNA isolering, Taq-polymerase, PMSF, menadion, Sephadex G50 og HRP-konjugert anti-actin β antistoff innkjøpt fra Sigma Aldrich. Revers transkriptase, ribonukleasehemmer, tilfeldige primere (heksamer), 100 bp Plus DNA stigen og Klenow enzym fra Fermentase Life Science og TURBO DNA-Free
TM Kit jeg ble kjøpt fra Ambion. Genspesifikke primere for RT-PCR ble syntetisert fra Metabion. Anti-mus p53 antistoff fra Imgenix, anti-mus iNOS og COX2 antistoff fra Cayman og HRP-konjugert geit anti-kanin sekundært antistoff fra Bangalore Genie. Radiomerket α
32P-dCTP fra Board of Radiation og Isotope Technology (BRIT) og ECL (Super signal Kit) ble kjøpt fra Pierce Biotechnology HYSEL India Pvt. ; Eksporter
Dyr og induksjon T-cellelymfom (Dalton lymfom)
Mus (
Mus musculus
, AKR stamme) ble avlet og holdt under standard laboratorieforhold med riktig human omsorg, i henhold til retningslinjene i den institusjonelle dyr etisk komité, ved 25 ± 2 ° C under 12 timer lys /12 timer mørke tidsplan og utstyrt med vanlige mus fôr, drikkevann
ad libitum
. Alle dyreforsøk ble utført med godkjenning av Institutional Animal Etisk Komité, Banaras Hindu University. Friske voksne mannlige mus (30 ± 2 g, 16-20 uker gamle) ble anvendt i det eksperimentelle arbeidet. Dalton lymfom ascites-celler ble transplantert i voksne mannlige mus ved intraperitoneal (i.p.) serietransplantasjon, som tidligere beskrevet [20]. Dalton lymfom ascites celler ble begavet av professor Ajit Sodhi, School of Biotechnology, Banaras Hindu University, Varanasi, India. Dalton lymfom er en transplant non-Hodgkins murine T-cellelymfom, oppsto i thymus kjertel av DBA /2-mus ved National Cancer Institute, Bethesda, MD, i 1947. [22].
Utvikling av DL var bekreftet av abdominal hevelse og økt kroppsvekt, noe som var synlige tydelig på 10-11 dagen etter transplantasjon og DL mus overlevde i 20 ± 2 dager. Vekst av Dalton lymfom viste ikke noen stor endring i kroppsvekt og ascites væske opphopning i løpet av første 7-9 dager med start fra neste dag i DL transplantasjon (S1 fig). Således første 7-9 dagene kan bli sammenlignet med lag-fase /forberedende fase for sigmoid kurve for ascites cellepopulasjon vekst. Derfor tidsplan for curcumin behandling til DL mus ble valgt tilsvarende for 9 dager med start fra neste dag DL transplantasjon og mus ble avlivet på dag 18 av innlegget DL transplantasjon (før DL mus dør naturligvis) for å få den langsiktige effekten av curcumin. Hvis curcumin administreres gjennom i.v. /i.p., er det metaboliseres til dihydrocurcumin, tetrahydrocurcumin, hexahydrocurcumin og hexahydrocurcuminol. Curcumin er forventet å være fullstendig metabolisert til dets metabolitter i løpet av siste 9 dager etter behandling. Derfor bør effekten ikke skyldes direkte effekt av curcumin, men kan være på grunn av metabolitter av curcumin [20].
Oversikt over curcumin behandling til DL mus og vev samling
Seks grupper av musene ble tatt med 6 mus i hver gruppe (n = 6) og curcumin behandling for å DL mus ble planlagt som tidligere beskrevet [20]. Alle mus ble avlivet på dag 18 av innlegget DL transplantasjon (for å unngå septisk tilstand før DL mus dør på grunn av tumor) av humant euthanization (cervikal dislokasjon etter bedøvet; mus ble eksponert for eter presentert på en bomullsgas inne i et lite kammer og eter konsentrasjon var ca. 80μl /liter av volumet av beholderen). Leveren ble skåret ut umiddelbart etter avliving og vasket i avkjølt normalt saltvann og vev fra hver gruppe (n = 6) ble slått sammen og hakket aseptisk ved 4 ° C i gjennomsnitt resultat. Vevet ble anvendt umiddelbart eller konservert ved -80 ° C for videre studier.
Elektroforetisk mobilitet skift analyse (EMSA)
Nuclear protein ble trukket ut og bindingsaffiniteten til Nrf2-sekvenser ble bestemt ved elektroforetisk mobilitet skift analyse (EMSA) som tidligere beskrevet [23, 24, 25]. Rensede syntetiske oligonukleotidprober svarende til NF-E2-konsensussekvensen (forstand 5′-TGGGGAACCTGTGCTGAGTCA-3 «, antisense-5′-CTCCAGTGACTCAGCACAGGTTCC-3′ eller ER-konsensussekvensen (forstand 5»-AGTCACAGTGACTCAGCAGAAT-3 «, antisense-5»-AGATTCTGCTGAGTCACTGTGA -3 «) ble glødet, end merket med [α-32P] CTP hjelp Klenow enzym. Titrering for spesifisitet og bindende affinitet syntetisert oligonukleotid som tilsvarer ARE og NFE2 bindende element ble bestemt ved hjelp av umerket probe som spesifikk konkurrent og poly-dI /dC som uspesifikk konkurrent hhv. intensiteten av komplekset på autoradiogrammet ble fotografert og analysert ved densitometrisk skanning ved hjelp Alpha Image Analyser System (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA).
RNA isolering og RT-PCR
RNA-isolering, cDNA-syntese og amplifikasjon ble utført som beskrevet tidligere [20, 23, 24, 25]. Ekspresjon av Nrf2, isozymer av GST, GR, NQO1, p53, TGF-β1, iNOS og COX2 gener ble studert ved semi-kvantitativ RT-PCR ved anvendelse av syntetisert cDNA. De riktige primerpar (S1 Table) ble brukt for PCR reaksjoner ved hjelp av termosykler (Applied Biosystems). Band intensiteten av amplifiserte produkter ble visualisert, fotografert og analysert ved hjelp av Gel Doc System (Alpha Innotech
EC) og verdier ble normalisert med β-actin som intern kontroll.
Aktivitets gel analysen
aktivitet av GR og NQO1 så vel som aktivitet og isozym mønstre av GST ble målt ved gel-aktivitet farging. Ikke-denaturerende PAGE-analyse av antioksidantenzymer ble foretrukket fremfor immundeteksjon, fordi endringen i aktiviteten til et enzym som er assosiert med metabolske forandringer og fremgangsmåten benytter substratspesifisitet basert deteksjon av bare aktive delen av enzymer i den samme gel. Det regnes som svært relevant for å korrelere endring i nivået av en bestemt isozyme med at av metabolske forandringer på cellenivå [20].
glutation-S-transferase (GST).
Aktivitets gelen ble utført ved ikke-denaturerende PAGE, i henhold til fremgangsmåten ifølge Ricci et al. med mindre endring [26]. Lik mengde protein fra hver prøve ble separert ved 10% ikke-denaturerende PAGE ved 4 ° C. Gelen ble inkubert i 100 mM kaliumfosfatbuffer (pH 6,5) inneholdende 4,5 mm GSH, 1 mM CDNB og 1 mM NBT ved 37 ° C i 10-15 minutter under forsiktig omrøring. Deretter Gelen ble vasket i vann og overført til en oppløsning av 100 mM Tris-Cl (pH 9,6) inneholdende 3 mM PMS i 3-5 minutter og belyst i lys til utseende av blå formazen sammensatte bånd på gelen. Bandet intensiteten av forskjellige isozymer ble visualisert, fotografert og analysert ved hjelp av Gel Doc System (Alpha Innotech
EC).
glutation reduktase (GR).
Aktiviteten farging av GR ble utført i henhold til fremgangsmåten til Hou et al. [27]. Lik mengde protein fra hver prøve ble separert ved 8% ikke-denaturerende PAGE ved 4 ° C. Etter fullført elektroforese ble gelen fuktet i 50 mM Tris-Cl (pH 7,9) inneholdende 4 mM GSSG, 1,5 mM NADPH og 2 mM DTNB i 30 minutter ved RT, renset med 50 mM Tris-Cl (pH 7,9) og overført til 1,2 mM NBT og 1,6 mm PMS. GR-aktivitet ble negativt farget i mørket i 10-15 minutter ved romtemperatur med forsiktig rysting og deretter eksponert for lys til utseende av klare soner av GR aktivitet band. Gelen ble vasket i vann for avfarging og båndintensitet ble visualisert, fotografert og analysert ved hjelp av
NAD (P) H Gel Doc System (Alpha Innotech
EC):.. Kinin oksidoreduktase (NQO1)
i-gel aktivitet farging av NQO1 ble utført som beskrevet av Wrobel et al. [28]. Lik mengde protein fra hver prøve ble separert ved 10% ikke-denaturerende PAGE ved 4 ° C. Etter elektroforese ble gelen farget i 50 mM Tris-Cl (pH 7,5), 0,3 mg /ml MTT, 1 mM NADH og 30 mM menadion med forsiktig rotering i mørke inntil fargen utvikles (10-15 min) i de områder som har NQO1 aktivitet. Reaksjonen ble stoppet ved å overføre gelen til en 5% (v /v) løsning av eddiksyre. Band intensitet ble visualisert, fotografert og analysert ved hjelp av Gel Doc System (Alpha Innotech
EC).
Evaluering av Redox status
Totalt glutation og redusert glutation ble bestemt som total sulfhydryl (T- SH) innhold og ikke-protein sulfhydryl (NP-SH) innhold ved hjelp av henholdsvis molar absorpsjonskoeffisient på 13100 M
-1 cm
-1, og ble uttrykt i mikro-mol pr mg protein [29]. Redox status ble beregnet som et forhold av NP-SH til proteinbundet sulfhydryl (P-SH) innhold.
Western blotting
lik mengde protein fra hver prøve ble separert på 10% SDS -siden og overført til PVDF-membran over natten ved 4 ° C. Membranen ble blokkert i 5% ikke-fettholdig melk i PBS (pH 7,4) i 2 timer ved RT. Blottet ble inkubert over natten ved 4 ° C med kanin-anti-mus p53 (1: 500 fortynning, Imgenix) eller kanin-anti-mus iNOS (1: 200 fortynning, Cayman) eller kanin-anti-muse-COX2 (1: 500 fortynning, Cayman) i 1% BSA og 0,05% Tween-20 i PBS (pH 7,4). Blot ble vasket og inkubert med HRP-konjugert geite-anti-kanin-IgG (1: 2500 fortynning, Bangalore Genei) i PBS (pH 7,4) inneholdende 1% BSA og 0,05% Tween-20 i 2 timer ved RT. Immunreaktive proteiner ble påvist med ECL-signal supersett (Pierce Bioteknologi) på røntgenfilm. tetthetsverdier Band ble normalisert med β-aktin
Nitrogenoksid (NO) Analyse
NO nivå i leveren ble beregnet ved hjelp Griess reagens.; 100 ul av leverhomogenat ble blandet med 100 pl av Griess-reagens (0,1% naphthylethylenediamine-dihydroklorid, og 1% sulfanilamid i 5% fosforsyre), inkubert i 10 minutter ved romtemperatur og absorbansen ble målt ved 540 nm med en plateleser (ECL ELISA-leser) . Konsentrasjonen av NO ble bestemt ved anvendelse av en standardkurve, som genereres ved å ta kjente mengder av natriumnitritt og verdiene ble uttrykt som ug verdigheten av NaNO2 /mg protein
Statistisk analyse
Statistisk analyse var utført av SPSS programvare ved hjelp av enveis ANOVA etterfulgt av Tucky test. Verdier ble uttrykt som gjennomsnitt ± S.E.M. hentet fra tre ulike sett av eksperimenter, p. 0,05 ble tatt som statistisk signifikant (95% konfidensintervall) sammenlignet med N-gruppen (#) og DL + DMSO gruppe (*)
Resultater
Effekt av curcumin på binding av Nrf2 med eR konsensus sekvens
spesifisitet og bindende affinitet syntetisert oligonukleotid som tilsvarer antioksidant respons element (eR konsensus sekvens) ble validert. Titrering med umerket probe (kald sonde) som bestemt konkurrent og med uspesifikk konkurrent (poly-dI /DC) bekreftet spesifisitet og affinitet henholdsvis [Fig 1A og 1B]. Intensiteten av spesifikke DNA-proteinkompleks (ER-Nrf2) oppnådd i DL og DL + DMSO-mus var ca. 60% og 56% av normal mus respektivt. Signifikant aktivering og nukleær translokasjon av Nrf2 ble indusert ved curcumin behandling opp til 148%, 164% og 143% av DL + DMSO-mus med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg kroppsvekt henholdsvis [Fig 1 (C)].
Effekt av curcumin på DNA-bindende aktivitet av Nrf2 med ER konsensussekvenser. (A) Titrering med umerket probe som spesifikk konkurrent. (B) Titrering med poly-dI /DC som uspesifikk konkurrent. (C) autoradiogrammet viser Nrf2-er komplekse (D) Densitometrisk skanning av Nrf2-er komplekse. Liver av alle seks dyr i hver gruppe ble slått sammen separat og anvendt for ekstraksjon av kjerneprotein. Data representerer gjennomsnitt ± SEM # Og * angir signifikant forskjell sammenlignet med henholdsvis N og DL + DMSO gruppe. Cur er curcumin og BW er kroppsvekt. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 og DLT150 representerer normal, Dalton lymfom lager, Dalton lymfom bærende mus behandlet med DMSO og Dalton lymfom bærende mus behandlet med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg kroppsvekt oppløst i DMSO hhv.
Effekt av curcumin på binding av Nrf2 med NF-E2 konsensus sekvens
Titrering med umerket probe som spesifikk konkurrent og poly-dI /dC som uspesifikk konkurrent bekreftet spesifisitet og affinitet henholdsvis [fig 2A og 2B]. Intensiteten av spesifikke DNA-proteinkompleks (NF-E2 med Nrf2) i DL og DL + DMSO-mus var ca. 32% og 70% av normal mus respektivt. Intensiteten av komplekset ble funnet å være signifikant indusert med 100 mg curcumin /kg kroppsvekt som var tilnærmet opp til 144% av DL + DMSO-mus [Figur 2 (c)].
Effekt av curcumin på DNA-bindende aktivitet av Nrf2 med NFE2 konsensussekvenser. (A) Titrering med umerket probe som spesifikk konkurrent. (B) Titrering med poly-dI /DC som uspesifikk konkurrent. (C) autoradiogrammet viser Nrf2-NFE2 kompleks (D) Densitometrisk skanning av Nrf2-NFE2 kompleks. Liver av alle seks dyr i hver gruppe ble slått sammen separat og anvendt for utvinning av kjerneproteiner. Data representerer gjennomsnitt ± SEM # Og * angir signifikant forskjell sammenlignet med henholdsvis N og DL + DMSO gruppe. Cur er curcumin og BW er kroppsvekt. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 og DLT150 representerer normal, Dalton lymfom lager, Dalton lymfom bærende mus behandlet med DMSO og Dalton lymfom bærende mus behandlet med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg kroppsvekt oppløst i DMSO hhv.
Effekt av curcumin på uttrykk for Nrf2 mRNA
uttrykk for Nrf2 ble nedregulert i DL og DL + DMSO mus opp henholdsvis ca 63% og 73% av normal mus, som ble betydelig opp regulert opp mot normalt nivå av curcumin behandling. Ekspresjonen av Nrf2 var 107%, 127% og 108% av DL + DMSO med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg kroppsvekt henholdsvis [Figur 3].
Effekt av curcumin på mRNA-ekspresjon av Nrf2. (A) RT-PCR av Nrf2 og β-aktin. (B) Densitometrisk skanning av Nrf2 etter normalisering med β-aktin. Liver av alle seks dyr i hver gruppe ble slått sammen separat og anvendt for ekstraksjon av total RNA. Data representerer gjennomsnitt ± SEM # Og * angir signifikant forskjell sammenlignet med henholdsvis N og DL + DMSO gruppe. Cur er curcumin og BW er kroppsvekt. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 og DLT150 representerer normal, Dalton lymfom lager, Dalton lymfom bærende mus behandlet med DMSO og Dalton lymfom bærende mus behandlet med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg kroppsvekt oppløst i DMSO hhv.
Effekt av curcumin på mRNA uttrykk og enzymatisk aktivitet av GST isozymene
uttrykk og aktivitet av fem enzymene GST nemlig GSTa, GSTm, GSTp, GSTt og GSTo ble observert i mus leveren, hvor GSTa er funnet å være de mest tallrike isozymet. Sammenlignet med normale mus, ekspresjon av GSTa, GSTm, GSTp, GSTt og GSTo ble nedregulert omtrent opp til 30%, 71%, 80%, 50% og 71% henholdsvis i DL mus og ca 35%, 61%, 82% , 68% og 76% henholdsvis i DL + DMSO mus. Curcumin behandling induserte ekspresjon av fem isozymer med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg kroppsvekt, sammenlignet med DL + DMSO, som var som følger-GSTa: 137%, 180%, 150%; GSTm: 117%, 110%, 125%; GSTp: 113%, 107%, 108%; GSTt: 102%, 122%, 115%; GSTo.: 107%, 108% og 102% henholdsvis [Figur 4 (A)]
Effekt av curcumin på Uttrykket amp; enzymatisk aktivitet av GST isoenzymer (A) RT-PCR av GST-isozymer og β-aktin (B) Densitometrisk skanning av GST-isozymene etter normalisering med β-aktin. (C) Spesifikk farging som viser aktiviteten av GST isoenzymer. (D) Densitometrisk skanning av aktiviteten band av GST isoenzymer. Liver av alle seks dyr i hver gruppe ble slått sammen separat og anvendt for ekstraksjon av total RNA og proteiner. Data representerer gjennomsnitt ± SEM # Og * angir signifikant forskjell sammenlignet med henholdsvis N og DL + DMSO gruppe. Cur er curcumin og BW er kroppsvekt. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 og DLT150 representerer normal, Dalton lymfom lager, Dalton lymfom bærende mus behandlet med DMSO og Dalton lymfom bærende mus behandlet med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg kroppsvekt oppløst i DMSO hhv.
aktivitetene fem enzymene GST som GSTa, GSTm, GSTp, GSTt og GSTo ikke følger lignende variant mønster som for uttrykket. Aktiviteten av GSTa, GSTm og GSTp ble redusert i DL og DL + DMSO-mus, hvor som GSTt og GSTo isozymene viste indusert aktivitet i DL og DL + DMSO-mus sammenlignet med normale mus. Reduksjonen i aktivitet av GSTa: 46%, 41%; GSTm: 59%, 67% og GSTp: 35%, 21% og DL DL + DMSO-mus henholdsvis sammenlignet med normale mus. Imidlertid GSTt og GSTo isozymene viste indusert aktivitet opp til 172% og 123% i tilfelle av GSTt og 145% og 126% i tilfelle av GSTo henholdsvis i DL og DL + DMSO-mus sammenlignet med normale mus. Curcumin modulert aktivitet av enzymene GST mot normalt nivå. GSTa, GSTm og GSTp ble stimulert ulikt med forskjellige doser av curcumin behandling. Alle dosene av curcumin forhøyet aktivitet av GSTa og GSTp. GSTa ble løftet opp til omtrent 132%, 155%, 143% og GSTp opp til omtrent 247%, 366%, 420% av DL + DMSO-mus med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg kroppsvekt henholdsvis. Imidlertid ble aktiviteten av GSTm stimulert signifikant opp til 156%, 106% med 100 og 150 mg curcumin /kg kroppsvekt henholdsvis. Nedgang i aktivitet GSTt var opp til ca 94%, 81% med 50 og 100 mg curcumin /kg kroppsvekt henholdsvis og GSTo opptil ca 75% med 50 mg curcumin /kg kroppsvekt i forhold til DL + DMSO mus [Fig 4 (C)] .
Effekt av curcumin på mRNA-ekspresjon og enzymatiske aktiviteten til GR
ekspresjon av GR i leveren av DL og DL + DMSO-mus ble nedregulert opp til ca 58% og 72% av normale mus henholdsvis. Curcumin behandling induserte ekspresjon av GR i en doseavhengig måte. Oppregulering av ekspresjon av GR ved curcumin er omtrent 118%, 129%, 134% av DL + DMSO-mus med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg kroppsvekt henholdsvis [Fig 5A og 5B]. Aktiviteten av GR ble funnet å være redusert i DL og DL + DMSO mus opp til om lag 69% og 70% av de normale mus. Behandling av curcumin forhøyet aktivitet av GR vesentlig opptil omtrent 126%, 136%, 109% av DL + DMSO-mus med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg kroppsvekt henholdsvis [Figur 5C og 5D].
Effect av curcumin på uttrykk enzymatisk aktivitet av GR (A) RT-PCR av GR og β-aktin (B) Densitometrisk skanning av GR etter normalisering med β-aktin. (C) Spesifikk farging som viser aktiviteten av GR. (D) Densitometrisk skanning av aktiviteten band av GR. Liver av alle seks dyr i hver gruppe ble slått sammen separat og anvendt for ekstraksjon av total RNA og proteiner. Data representerer gjennomsnitt ± SEM # Og * angir signifikant forskjell sammenlignet med henholdsvis N og DL + DMSO gruppe. Cur er curcumin og BW er kroppsvekt. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 og DLT150 representerer normal, Dalton lymfom lager, Dalton lymfom bærende mus behandlet med DMSO og Dalton lymfom bærende mus behandlet med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg kroppsvekt oppløst i DMSO hhv.
Redox status
Redox status i leveren av Lymfekreft bærende mus ble målt i form av redusert versus oksidert form av glutation (NP-SH /P-SH), som redox status er også en viktig indikator for oksidativt stress. Statusen ble observert å være henholdsvis 51% og 58% av normale mus i DL og DL + DMSO mus. Alle de tre dosene forhøyet redoks-status betydelig, noe som var opp til omtrent 131%, 159% og 124% av DL + DMSO-mus med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg kroppsvekt henholdsvis [figur 6].
Effect av curcumin på mobilnettet redoks status i form av NP-SH /P-SH. Liver av alle seks dyr i hver gruppe ble slått sammen separat og anvendt for ekstraksjon av totale proteiner. Data representerer gjennomsnitt ± SEM # Og * angir signifikant forskjell sammenlignet med henholdsvis N og DL + DMSO gruppe. Cur er curcumin og BW er kroppsvekt. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 og DLT150 representerer normal, Dalton lymfom lager, Dalton lymfom bærende mus behandlet med DMSO og Dalton lymfom bærende mus behandlet med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg kroppsvekt oppløst i DMSO hhv.
Effekt av curcumin på mRNA uttrykk og enzymatisk aktivitet av NQO1
Lymfom bærende mus viste redusert uttrykk for fase II antioksidant enzymet NQO1. Uttrykket ble nedregulert i DL og DL + DMSO mus opp til ca. 66% og 77% av de normale mus. Curcumin behandling signifikant opp regulert ekspresjon mot normalt nivå (95% av normal) med en dose på 100 mg curcumin /kg kroppsvekt. Den økte ekspresjon av NQO1 av curcumin var omtrent 104% og 123% av DL + DMSO-mus med 50 og 100 mg curcumin /kg kroppsvekt henholdsvis [Fig 7A og 7B]. Aktiviteten av NQO1, observert av aktivitet gel-assay følger variasjonen mønster av dets ekspresjon. Den ble funnet å være redusert i DL og DL + DMSO mus opp til henholdsvis ca 52% og 51% av normale mus. Curcumin behandling med 100 og 150 mg /kg kroppsvekt forhøyet aktivitet NQO1 betydelig, noe som var omtrent opp til 134% og 115% av DL + DMSO mus henholdsvis [Fig 7C og 7D].
Effekt av curcumin på mRNA uttrykket amp; enzymatisk aktivitet av NQO1 (A) RT-PCR av NQO1 og β-aktin (B) Densitometrisk skanning av NQO1 mRNA etter normalisering med β-aktin. (C) Spesifikk farging som viser aktiviteten av NQO1. (D) Densitometrisk skanning av aktiviteten band av NQO1. Liver av alle seks dyr i hver gruppe ble slått sammen separat og anvendt for ekstraksjon av total RNA og proteiner. Data representerer gjennomsnitt ± SEM # Og * angir signifikant forskjell sammenlignet med henholdsvis N og DL + DMSO gruppe. Cur er curcumin og BW er kroppsvekt. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 og DLT150 representerer normal, Dalton lymfom lager, Dalton lymfom bærende mus behandlet med DMSO og Dalton lymfom bærende mus behandlet med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg kroppsvekt oppløst i DMSO hhv.
Effekt av curcumin på mRNA uttrykk og protein nivå av p53
p53 er en labil protein, degraderes raskt etter oksidativt stress. MRNA-ekspresjon av Trp53 (p53-genet) ble funnet å bli nedregulert i DL og DL + DMSO mus opp til ca 43% og 40% av de normale mus. Alle de tre doser av curcumin indusert ekspresjon av Trp53 betydelig. Oppregulering av ekspresjonen Trp53 var omtrent opp til 200%, 240% og 223% av DL + DMSO-mus med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg kroppsvekt henholdsvis [Figur 8A og 8B]. Nivået av tumor suppressor p53-protein på følgende måte lignende variant mønster av dets ekspresjon. Proteinnivået ble redusert i tilfelle av DL og DL + DMSO mus opp til henholdsvis ca 47% og 50% av normale mus.
