Abstract
Bakgrunn
stamceller (MSC) fremme tumorvekst ved å skille inn carcinoma-assosiert fibroblaster (kafeer) og komponering svulsten mikromiljøet. Imidlertid er de mekanismene som er ansvarlig for overgangen fra MSC til kafeer ikke godt forstått. Exosomes regulere cellulære aktiviteter ved å formidle celle-celle kommunikasjon. I denne studien ønsket vi å undersøke om kreftcelle-avledet exosomes var involvert i regulering av differensiering av menneskelige navlestreng-avledet MSC (hucMSCs) til kafeer.
metodikk /hovedfunnene
først viste at magekreftcelle-avledet exosomes indusert uttrykk av CAF markører i hucMSCs. Vi viste at magekreftcelle-avledet exosomes stimulert fosforylering av Smad-2 i hucMSCs. Vi videre bekreftet at TGF-β reseptor en kinase inhibitor svekket Smad-2 fosforylering og CAF markør uttrykk i hucMSCs etter eksponering for magekreft celle-avledet exosomes.
Konklusjon /Betydning
Våre resultater tyder at mage kreftceller utløste differensiering av hucMSCs til kafeer ved exosomes-mediert TGF-β overføring og TGF-β /Smad sti aktivering, som kan representere en ny mekanisme for MSC til kafeer overgang i kreft
Citation.: gu J, Qian H, Shen L, Zhang X, Zhu W, Huang L, et al. (2012) Gastric Cancer Exosomes Trigger Differensiering av navlestreng Avledet stamceller til carcinoma-assosiert fibroblaster gjennom TGF-β /Smad Pathway. PLoS ONE 7 (12): e52465. doi: 10,1371 /journal.pone.0052465
Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, USA
mottatt: 30 juni 2012; Godkjent: 13 november 2012; Publisert: 20.12.2012
Copyright: © 2012 Gu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av den store forsknings Plan of Natural Science Foundation of China National (Grant nr. 91129718), Natural Science Foundation National of China (Grant nr. 81071421, 31140063), Jiangsu-provinsen forsknings- og teknologi støtte Program (Grant no. BE2010703 ), 333 Prosjekt i Jiangsu-provinsen (Grant nr. 2.009.055) og Sci-Tech Innovation team og talenter i Jiangsu University (Grant ingen. 2008-018-02). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreftceller celler~~POS=HEADCOMP begynner å forme deres mikromiljøet i tidlig fase av ondartet progresjon [1]. Omfattende rapporter har vist den utbredte interaksjoner mellom svulsten mikromiljøet og kreftceller, som er kritisk for tumordannelse og tumorprogresjon [2], [3]. Tumor mikromiljøet kunne fremkalle reversible forandringer i fenotype av cancerceller og lette dens metastatisk spredning [4], og endringer i tumormikromiljøet til og med drastisk påvirke effekten av kreftterapi. Tumor mikromiljøet er sammensatt av forskjellige typer av celler, innbefattende karsinom-assosiert fibroblaster (kafeer), infiltrerende immunceller, blod og lymfe vaskulære nettverk, og stamceller (MSC) [4], [5].
kafeer er viktige determinanter i ondartet progresjon av kreft vekst, vaskularisering, og metastasering. Kafeer som uttrykker fibroblast aktivering protein (FAP) og α-glatt muskel aktin (α-SMA) kan skape en nisje for kreftceller og fremme deres motilitet [6], [7]. Faktisk, kafeer gjennomgå en differensierings prosess indusert av tumorceller og utvikle invasiv og trekkende egenskaper [8], [9].
stamceller er multipotente celler som kan bli isolert fra en rekke forskjellige vev, inkludert ben marg, fettvev, synovialhinne, skjelettmuskulatur, lever, ledningen blod, morkake og navlestreng [10] – [13]. MSC kunne bli overtalt til å differensiere i osteocytter, adipocytter, chondrocytes og muskelceller grunn av sin regenererende evne og multipotent kapasitet [14]. MSC hjem til og overleve på nettstedene til betennelser og skader samt svulster, bidra til dannelsen av tumor-assosiert stroma [15]. Studier har bekreftet at MSC kunne differensiere til myofibroblasts, karsinom-assosiert fibroblaster, fibrocytt eller pericytes under de tumor mikrobetingelsene [6], [16], [17]. I våre tidligere studier, har vi vist at benmarg MSC og deres avledede exosomes kunne fremme tumorvekst [18], [19]. Men mekanismen ansvarlig for denne effekten er fortsatt i stor grad ukjent.
Kreftceller kommuniserer med svulstens mikromiljø ved celle-celle interaksjon og paracrine mekanismer som produserer en rekke vekstfaktorer, chemokiner, og matrisenedbrytende enzymer som forbedrer proliferasjonen og invasjon av tumor [20]. I tillegg til de kjente mekanismer, er en ny mekanisme som tumorceller kan være en aktiv frigi exosomes dukker opp. Exosomes har en spesiell sammensetning re fl ecting deres opprinnelse og kan overføre ikke bare membrankomponenter, men også nukleinsyre mellom ulike celler [21], [22], med vekt på deres rolle i inter kommunikasjon [23]. Akkumulerende bevis har vist bidraget av exosomes til en mobil kommunikasjonsmodus, noe som fører til intercellulære overføring av molekyler [24]. Selv om regulerende rolle av exosomes i immunsystemet og deres anvendelse som vaksine i kreft immunterapi er lovende [25] -. [28], utfallet følgende samspillet mellom kreft exosomes og stromale celler er ikke godt forstått
Ondartet cellene tilbake MSC til kafeer som bidrar til å fremme tumorprogresjon har oppmuntret gransking av mulige mekanismer for sin overgang. Studier har vist at minst 20% av kafeer stammer fra benmargen og er avledet fra stamceller i musemodeller av inflammasjon i fl-indusert gastrisk kreft [16]. Vi antok at kreftceller kommunisert med MSC gjennom utgivelsen av exosomes og overføring av proteiner, derfor indusere differensiering av MSC til kafeer. I denne studien, viste vi at MSC kjøpte en CAF fenotype etter eksponering for kreftfrem avledet exosomes og differensiering av MSC til kafeer var assosiert med aktivering av TGF-β /Smad signalveien.
Materialer og Metoder
Cell Kultur
menneske~~POS=TRUNC navlestreng MSC ble oppnådd som tidligere beskrevet [12], [29]. Ferske navlestrenger ble samlet fra informerte, samtykkende mødre og behandlet innen 6 timer. Ledningene ble skyllet to ganger med fosfat-bufret saltvann (PBS) i penicillin og streptomycin og ble deretter fjernet ledningen fartøy. De vaskede ledninger ble skåret i stykker på 1-3 mm
2 størrelse og fløt i DMEM inneholdende 10% FBS (Invitrogen, USA), 1% penicillin og streptomycin. Bitene av ledningen ble deretter inkubert ved 37 ° C i fuktig luft med 5% CO
2, og mediet ble skiftet hver 3. dag etter den første plettering. Når velutviklede kolonier av fibroblast-lignende celler nådd 80% samløpet, ble kulturene trypsinert og passert inn i nye flasker for videre ekspansjon. Karakteristikken av isolerte hucMSCs inkludert morfologisk utseende, overflateantigener, differensiering potensial og gen-ekspresjon ble undersøkt som tidligere beskrevet [12]. Alle forsøksprotokoller ble godkjent av etikkomiteen i Jiangsu University. De hucMSCs fra passasjen 2 ble valgt for forsøkene. Menneskelige mage kreftceller (SGC7901 og HGC27) ble kjøpt fra Cell Bank, Type Culture Collection Committee (Chinese Academy of Sciences). Gastric epitelceller (GES-1) ble kjøpt fra Cwbiotech Company og vedlikeholdes i DMEM supplert med 10% FBS.
Exosome Isolering og rensing
SGC7901, HGC27 og mage epitelceller (GES-en ) avledet exosomes ble isolert og renset som tidligere beskrevet [30], [31]. I korthet ble cellene dyrket i DMEM supplert med 10% exosome-utarmet føtalt bovint serum. Føtalt bovint exosomes ble fjernet ved ultrasentrifugering over natten ved 100000 g i 16 timer ved bruk av en type 90 Ti fast Angel rotor (Optima L-90K, Beckman Coulter). Supernatanter fra sammenløpende kulturer (3-5 dager) ble sentrifugert ved 2000 g i 20 min for å fjerne celler og rester. Og den klarede supernatant ble konsentrert ved ultrafiltrering gjennom et 100-kDa MWCO hulfiber-membran (Millipore) ved 1000 g i 30 min. Den konsentrerte supernatant ble fylt i sentrifugerør (Beckman) og underlayed med 30% sukrose /D
2O tetthet pute (5 ml) som danner en synlig interfase og ultrasentrifugert ved 100.000 g og 4 ° C i 1 time i en SW-32Ti svingende-bøtte rotor (Optima L-90K, Beckman Coulter). Da begge putene exosomes sukrose tetthet (fraksjon 3) som er samlet fra de ultrasentrifuge-rør bunn og nonbanded fraksjoner (fraksjon 6 og 7) som inneholder nonmembrane proteinkomplekser som er samlet for anvendelse som exosomes kontroll (E-kontroll) ble slått sammen og vasket tre ganger gjennom et 100-kDa miniatyr hulfiberpatron (Millipore) ved 1000 g i 30 minutter som beskrevet ovenfor. Proteininnholdet ble målt ved anvendelse av BCA analyse kit (Pierce). De exosomes ble sterilisert gjennom et 0,22 um kapsel filter (Millipore) og lagret ved -70 ° C inntil anvendelse [30].
Elektronmikroskopi
En dråpe av exosomes (ca. 20 ul) oppnådd etter at differensialultrasentrifugering ble pipettert på formvar karbon-belagte gittere og fikk stå i 1 minutt ved romtemperatur. Etter fjernelse av overflødig væske med et stykke filter ble prøven farget med 2% (vekt /volum) fosfowolframsyre (pH 6,8) i 5 minutter og ble lufttørket under en elektrisk glødelampe, og analysert med et transmisjonselektronmikroskop (FEI Tecnai 12, Philips).
exosomes Merking og Intern
SGC7901 celler avledet exosomes og exosomes kontroll ble merket med CM-Dil (rød) i henhold til produsentens protokoll (Invitrogen). Exosomes fra GES-1-cellene ble anvendt som celle-kontroll. Det merkede exosome Suspensjonen ble filtrert med en 100-kDa MWCO hulfiber-membran (Millipore) og gjennomstrømnings ble anvendt som ubundet fargestoff kontroll. HucMSCs (1 x 10
4 /brønn) ble sådd ut i 12-brønners plater inneholdende lameller og inkubert ved 37 ° C med merkede exosomes (800 ug /ml) i 4 timer før innhøsting.
Immunofluorescent Farging
HucMSCs ble fiksert i 4% paraformaldehyde i 10 min. Merkede celler ble fremstilt for fluorescens mikroskopi ved per-mobilisering i 3 minutter med 0,1% Triton-X100, blokkert med 5% BSA og inkubert med kanin monoklonalt anti-β-aktin-antistoff over natten, etterfulgt av inkubasjon med Cy2-merket anti-kanin-IgG sekundære antistoff ved 37 ° C i 45 minutter (Jackson Immunoresearch). Kjernene ble kontra med DAPI. Confocal bilder ble sekvensielt kjøpt med TCS SP5 II-systemet (Leica) [32].
CAF Differensiering
HucMSCs ble sådd i 6-brønners plater (5 × 10
3 /brønn) . Tolv timer etter såing, ble hucMSCs behandlet med exosomes (800 ug /ml) for å utløse CAF differensiering i nærvær eller fravær av TGF-β reseptor-1 kinase inhibitor SD208 (Sigma) eller rekombinant humant TGF-β (5 ng /ml; Sigma). Mediet ble skiftet hver 3. dag i 14 dager. Cellene ble deretter samlet opp og klargjort for Western blotting og kvantitativ PCR-analyse.
Western blotting
celler ble oppsamlet og lysert med RIPA-buffer (10 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 0,1% SDS, 1 mM NaF, 1 mM Na
3VO
4, 1 mM PMSF, 1 mg /ml aprotinin, 1 mg /ml leupeptin). Aliquoter som inneholdt like mengder protein ble fraksjonert, og deretter overført til metanol pre-aktivert PVDF-membraner (Millipore, USA). Etter sekvensiell inkubasjon med det primære og sekundære antistoff ble det signal visualisert ved anvendelse av HRP-substrat (Millipore, USA) og analysert ved hjelp av MD bilde Quant Software. Kilder og fortynning faktorer av primære antistoffer var: kanin polyklonale anti-CD9 (1:1000; BioWorld), anti-CD81 (1:1000; Epitomics), anti-TGF-β (1:1000; BioWorld), anti-FAP ( 1:1000, Abcam), mus monoklonalt anti-α-SMA (1:1000, Santa Cruz), anti-VEGF (1:1000, Santa Cruz) og anti-vimentin (1:2000, Santa Cruz), anti-N -cadherin (1:1,000; BioWorld), anti-E-cadherin (1:500, SAB), og mus monoklonalt anti-GAPDH. (1:5000; Kangcheng)
Kvantitativ RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert med Trizol reagens (Invitrogen) og cDNA ble syntetisert ved anvendelse av en revers transkripsjon kit (Toyobo, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner. Primere ble produsert av Invitrogen Company (Shanghai, Kina). Sanntids RT-PCR ble utført for å påvise endringen av FAP, a-SMA, N-cadherin og IL-6-genekspresjon (Rotor-Gene 6000, Australia). For å kompensere for variasjoner i inngangs RNA og effektiviteten av revers transkripsjon, en endogen «housekeeping» gen (β-aktin) var også kvantifisert for å normalisere resultatene. Alle prøver ble kjørt i triplikat, og alle reaksjoner ble gjentatt 3 ganger uavhengig av hverandre for å sikre reproduserbarhet.
Migration Assay
HucMSCs (8 x 10
4 i 200 pl) ble suspendert i serum -fri medium ble lastet inn i det øvre kammeret, og 500 ul serumfritt medium (SFM) inneholdende 800 ug /ml exosomes i nærvær eller fravær av TGF-β reseptor-1 kinase inhibitor SD208 (2 uM) ble tilsatt til bunnen av Transwell (Corning). Etter kultur ved 37 ° C i 6 timer, cellene øvre membranen ble utryddet med en bomullspinne. Cellene som hadde migrert gjennom membranen ble fiksert med 4% paraformaldehyd og farget med krystallfiolett. Cellene ble observert etter mikroskopi og minst 10 felt av celler ble analysert for hver gruppe.
TGF-β Nøytralisering
HucMSCs ble behandlet med tumor exosomes (800 ug /ml) for å utløse CAF differensiering i nærvær eller fravær av TGF-β antistoff (R 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Exosomes Karakterisering og Intern
Vi isolert og identifisert de exosomes basert på deres unike størrelse og tetthet.. Som vist på fig. 1A-en, de exosomes hadde en karakteristisk skål-lignende form begrenset av et lipidbilag med en diameter varierte 40-100 nm. Vi bekreftet rikelig uttrykk for exosomal markører CD9 og CD81 i våre isolerte exosomes ved Western blotting (Fig. 1A-b). Etter våre tidligere studier, ble human navlestreng avledet MSC forberedt og preget (data ikke vist). For å undersøke internalisering av exosomes ved hucMSCs, merket vi exosomes med CM-Dil. Som vist i figur 1B, ble SGC7901 celler avledet exosomes internalisert og akkumulert i hucMSCs etter inkubasjon i 4 timer mens exosomes kontroll viste minimal effekt. Sammenlignet med SGC7901 gruppe, ble mindre GES-1 avledet exosomes tatt opp av hucMSCs.
A. Morfologi av exosomes og exosomal markør uttrykk. (A) morfologisk analyse av magekreft avledet exosomes. Scale bar = 100 nm. (B) CD9 og CD81 uttrykk i exosomes. B. Exosomes ble uptaken av hucMSCs. Exosomes merket med CM-Dil (rød) ved 37 ° C i 1 time ble tilsatt til hucMSCs og inkubert i 4 timer. Avløpet fra en filtrert suspensjon av CM-Dil-merket exosomes (kontroll) og CM-Dil-merket trukket exosomes fraksjonen (e-Exos) ble anvendt som kontroller. Cellene ble fiksert og farget for cytoplasma (CY2-aktin, grønn) og kjerner (DAPI, blå). Scale bar = 20 mikrometer.
Tumor-avledet Exosomes Fremme hucMSCs Differensiering til kafeer
Vi antok at tumor-avledet exosomes kan indusere differensiering av hucMSCs til kafeer
in vitro
. Kafeer ble definert som den økte ekspresjon av FAP og α-SMA-proteiner. HucMSCs monolayer var dyrket i medium som inneholdt 800 mikrogram /ml SGC7901 exosomes og GES-1 exosomes. Kvantitativ RT-PCR-analyser viste at SGC7901 exosomes men ikke GES-1-exosomes fremmet uttrykk for CAF markører i MSC 36 h (Fig. 2A) og 14 d (Fig. 2B) etter induksjon, henholdsvis. Sammenlignet med ubehandlede gruppen exosomes svulst behandling resulterte i en økning i FAP, α-SMA, N-cadherin og vimentin proteinnivåer (Fig. 2C). Samlet indikerer disse resultater at hucMSCs gjennomgå CAF differensiering i respons til tumor exosomes eksponering.
A.Quantitative analyser av FAP, IL-6 og α-SMA-mRNA-ekspresjon i hucMSCs. HucMSCs ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av SGC7901 exosomes eller GES-1 exosomes til 36 timer. B. kvantitative analyser av FAP, IL-6 og N-cadherin ekspresjon i hucMSCs. HucMSCs ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av SGC7901 exosomes eller GES-1 exosomes i 14 dager. C. Western blotting-analyser av FAP, α-SMA, N-cadherin og vimentin protein ekspresjon i hucMSCs behandlet med SGC7901 exosomes (800 ug /ml) i forskjellige tider. (A-d) Tetthet analyse av Western blotting band. * P 0,05 og # P 0,01, sammenlignet med den relative kontrollgruppen (n = 3)
Tumor-avledet Exosomes Fremme hucMSCs Migration
For å analysere om den vandrende evne. av hucMSCs ble påvirket av kreft exosomes, ble hucMSCs dyrket i transwell og indusert å migrere ved kreft exosomes. Som vist i figur 3A og 3B, ved 6 timer etter inkubering, tumor exosomes fremmet migrering av hucMSCs mer effektivt enn normale celle avledet exosomes. Vi har også vist at den økte migrering av hucMSCs av tumor exosomes ble blokkert ved samtidig behandling med TGF-β R1 inhibitor, SD208. I tillegg har vi undersøkt effekten av SGC7901 exosomes på migrering av hucMSCs ved hjelp av skrape analyse. Resultatene var i overensstemmelse med den av transwell migrasjon assay, som viser en redusert gap avstand i tumor exosome-behandlede gruppen (fig. S1). Samlet utgjør disse resultatene indikerer at kreft exosomes kan fremme migrasjon av hucMSCs
in vitro
.
A. HucMSCs ble behandlet med magecancercelle eller normale gastriske epitel-celle-avledet exosomes (800 ug /ml) i nærvær eller fravær av SD208 (2 uM) i 6 timer. Transwell migrering analysen ble utført for å analysere den vandrende egenskaper av cellene. B. Antallet migrerte celler som ovenfor ble evaluert. Disse eksperimentene ble gjentatt tre ganger. * P 0,05 og # P 0,01, n = 3. Scale bar = 50 mikrometer
Tumor-avledet Exosomes Aktiver Smad2 /3 og p38 i hucMSCs
TGF-β. har vist seg å være til stede på overflaten av exosomes [33] og kritisk for CAF differensiering. Vi deretter undersøkt om TGF-β veien var ansvarlig for induksjon av MSC overgang til kafeer ved kreft exosomes. Vi først viste nærvær av TGF-β i tumor exosomes (Fig. 4A). Sammenlignet med tumor exosomes, normale celle avledet exosomes viste lavere nivå av TGF-β ekspresjon. For å vurdere om differensiering av hucMSCs til kafeer er forbundet med TGF-β vei aktivering, vi undersøkte status av fosforylert Smad 2/3 etter svulst exosomes behandling. Resultatene viste at Smad 2/3 fosforylering ble øket med tumor exosomes ved 15 minutter etter behandling, og nådd det høyeste nivået ved 60 min etter behandlingen, mens den totale Smad 2/3 proteinnivåer ble ikke påvirket. Vi har også bestemt nivået av fosforylert p38 og fant at p38 fosforylering ble også øket ved tumor exosomes (Fig. 4B). I motsetning til dette kunne GES-1 avledet exosomes ikke aktivere Smad2 /3 og p38 (fig. 4C). Samlet utgjør disse resultatene indikerer at kreft exosomes spesifikt aktivere Smad2 /3 og p38 i hucMSCs.
A. Western blotting-analyser av TGF-β ekspresjon i magekreftcellen (SGC7901) og normale gastriske epitel-celle (GES-1) avledet exosomes. B. HucMSCs ble behandlet med SGC7901 avledet exosomes (800 ug /ml) i forskjellige tider som angitt. Nivåene av p-Smad2 /3, t-Smad2 /3, ble p-p38and t-p38 analysert ved Western blotting. TGF-β tjente som en positiv kontroll. C. HucMSCs ble behandlet med GES-1 avledet exosomes (800 ug /ml) i forskjellige tider som angitt. Nivåene av p-Smad2 /3, t-Smad2 /3, p-p38 og t-p38 ble analysert ved Western blotting.
TGF-beta Pathway Blokker Blocks Tumor Exosomes-indusert Smad2 /3 og p38 aktivering
for å vise om aktivering av Smad2 /3 og p38 er spesifikk for TGF-β signale utløst av tumor exosomes, blokkert vi TGF-β signalveien med TGF-β R1inhibitor og oppdaget nivåer av fosforylert Smad2 /3 og p38. Som vist på fig. 5A, økt fosforylering av Smad2 /3 og p38 følgende tumor exosomes behandling ble reversert ved TGF-β R1 inhibitor, SD208, på en doseavhengig måte. For ytterligere å demonstrere TGF-β fra tumor exosomes som aktiverer hucMSCs, nøytralisert vi TGF-β i tumor exosomes ved hjelp av et anti-TGF-β antistoff. I samsvar med resultatene fra TGF-β R1 inhibitor, ble økt fosforylering av Smad2 /3 og p38 i hucMSCs også reverseres av TGF-β-antistoff (Fig. 5B). I sammendrag, tyder disse data på at TGF-β fra tumor exosomes interagerer med TGF-β reseptor på hucMSCs, som fører til den sekvensielle aktiveringen av Smad2 /3 og p38 i hucMSCs.
A. HucMSCs ble behandlet med SGC7901 avledet exosomes (800 ug /ml) i nærvær eller fravær av SD208 (2 pM) i 1 time. Nivåene av fosforylert Smad2 og p38 ble undersøkt ved Western blotting. B. Magekreft celle (SGC7901) avledet exosomes ble pre-inkubert med anti-TGF-β antistoff (20 pg /ml) i 2 timer, og deretter tilsatt til hucMSCs. Seks timer senere ble cellene samlet og nivåene av fosforylerte Smad2 og p38 proteinene ble undersøkt ved Western blotting.
TGF-β Pathway Hemming reverserer Tumor Exosomes-indusert hucMSCs Differensiering til kafeer
å påvise TGF-β /TGF-β R1 interaksjonen er ansvarlig for differensieringen av hucMSCs til kafeer indusert av tumor exosomes, blokkert vi TGF-β signalering med SD208 og TGF-β nøytralisering antistoff, etterfulgt av tumor exosomes behandling. Som vist i figur 6A-en, behandling med SD208 (2 uM) i 14 dager sterkt reversert tumor exosomes-indusert ekspresjon av CAF markører inkludert FAP, α-SMA, N-cadherin og vimentin i hucMSCs. Vi bekreftet også denne virkning ved hjelp av exosomes fra HGC-27 magecancerceller (Fig. 6A-B). I tillegg behandling med anti-TGF-β antistoff førte til tilsvarende effekter som er observert i TGF-β R1 inhibitor (Fig. 6B). I sammendrag, Disse data viser at tumor exosomes mediere differensieringen av hucMSCs til kafeer gjennom aktivering av TGF-β /Smad signalveien.
A. HucMSCs ble behandlet med magekreftcelle avledet exosomes i nærvær eller fravær av SD208 (2 uM) i 2 uker. Ekspresjonen av FAP, α-SMA, vimentin og N-cadherin-proteiner ble bestemt ved Western blotting. (A) SGC7901; (B) HGC27. B. HucMSCs ble behandlet med magekreftcelle (SGC7901) avledet exosomes i nærvær eller fravær av TGF-β antistoff (20 pg /ml) i 2 uker. Kanin IgG ble anvendt som kontroll. Uttrykket av FAP og α-SMA proteiner ble bestemt ved Western blotting.
Diskusjoner
I denne studien har vi identifisert en ny mekanisme som kreftceller induserer differensiering av MSC til kafeer. Våre data indikerer at: (1) magekreftcelle avledet exosomes blir internalisert av hucMSCs; (2) magekreft celle avledet exosomes utløse hucMSCs differensiering til kafeer og (3) TGF-β /Smad sti formidler overgangen fra hucMSCs til kafeer. Våre funn tyder på at TGF-β i tumor exosomes kan interagere med TGF-β R1 på hucMSCs, noe som resulterer i aktivering av Smad bane i hucMSCs og den påfølgende differensiering av hucMSCs til kafeer.
Selv om det har blitt rapportert at kreft exosomes kan forbedre metastatisk aktivitet av kreftceller [34], har rollen som kreft exosomes i MSC ikke blitt avslørt ennå. Våre funn viser at kreftceller kan regulere mobiliteten av MSC, som tyder på at kreftceller kan rekruttere MSC fra benmarg eller annet vev til svulsten mikromiljøet ved exosome-mediert mekanisme.
Eksponering for kreft exosomes øker uttrykket av CAF markører i MSC, tyder på at kreft exosomes induserer bytte av fenotype fra MSC til kafeer. Selv om dette papiret var i forberedelse, Cho et al. rapportert at exosomes fra bryst- og eggstokk-kreft celler kan indusere fettvev avledet MSC å skaffe fysiologiske og funksjonelle egenskaper tumorbærende myofibroblasts [35], [36]. Vårt arbeid er i tråd med sine funn og videre viser at denne prosessen er Smad avhengig.
I denne studien presenterer vi bevis for at kreft exosomes tilby en effektiv plattform for overføring av spesifikke meldinger til MSC, fremme MSC-CAF overgang. Flere tidligere studier har vist at TGF-β blir uttrykt av kreftcelle-avledet exosomes og denne formen av TGF-β er biologisk aktiv i å drive Smad-avhengig signalisering [33], [37]. TGF-β er en viktig regulator av stilk cellefornyelse og differensiering [38]. Vi bekreftet nærvær av TGF-β i magecancerceller avledet exosomes og bekreftet TGF-β /TGF-β R1 interaksjon medieres den Smad2 /3-aktivering og differensiering i CAF hucMSCs.
Det er blitt vist at MSCer kunne fremme cancer metastase [4], [39]. Vi har også rapportert at human MSC avledet kondisjonert medium og exosomes øke vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) ekspresjon i tumorceller og fremme tumorvekst
in vivo product: [18], [19]. Hvorvidt exosomes fra MSC kan spille en rolle i kreft metastase har ikke blitt behandlet. Vi har observert at MSC exosomes fremme epithelial-til-mesenchyme overgang (EMT) i magekreftceller, men de underliggende mekanismene fortsatt trenger å bli undersøkt i fremtidige studier.
I konklusjonen, vi viser i denne studien at magekreftcelle avledet exosomes har kapasitet til å indusere differensieringen av MSC til kafeer og aktivering av TGF-β /Smad sti av tumor exosomes bidrar til overgangen fra MSC til kafeer. Våre funn gir en ny mekanisme som kreftceller induserer MSC å differensiere i stromale tumorceller og delta i dannelsen av svulsten mikromiljøet.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Magekreft celle avledet exosomes fremme hucMSCs migrasjon. HucMSCs ble behandlet med magekreftcelle (SGC7901) avledet exosomes (800 ug /ml). Scratch matrise ble utført for å analysere evnen migrering av cellene. (A-c) Ubehandlet hucMSCs; (D-f) SGC7901-exosomes behandlet hucMSCs. Scale bar = 50 mikrometer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0052465.s001 plakater (TIF)
