Abstract
Formål
Vi testet hypotesen om at uttrykket av microRNAs (miRNAs) i kreftvev kan forutsi effekten av bevacizumab lagt til kapecitabin og oksaliplatin (CAPEOX) hos pasienter med metastatisk kolorektalcancer (mCRC)
Experimental design
Pasienter med mCRC som behandles med første linje CAPEOX og bevacizumab (CAPEOXBEV):. screening (n = 212) og validering (n = 121) kohorter eller CAPEOX alene : kontrollgruppen (n = 127), ble identifisert retrospektivt og arkiv primær tumorprøver ble innsamlet. Ekspresjon av 754 mirnas ble analysert i screening-kullet ved hjelp av polymerase-kjedereaksjon (PCR) matriser og ekspresjonsnivåer var relatert til tid til sykdomsprogresjon (TTP) og total overlevelse (OS). Vesentlige mirnas fra screeningundersøkelse ble analysert i alle tre kohorter ved hjelp av tilpassede PCR arrays.
In situ
hybridisering (ISH) ble gjort for utvalgte mirnas.
Resultater
I screeningundersøkelse, 26 mirnas var signifikant korrelert med utfallet i multivariate analyser. Tjueto mirnas ble valgt for videre studier. Høyere MIR-664-3p uttrykk og lavere Mir-455-5p uttrykk var prediktiv av bedret resultatet i CAPEOXBEV kohorter og viste en signifikant interaksjon med bevacizumab effektivitet. Effektene var sterkest for OS. Begge mirnas viste høy uttrykk i stromale celler. Høyere uttrykk av MIR-196b-5p og MIR-592 spådd forbedret resultatet uavhengig av bevacizumab behandling, med tilsvarende effektestimater i alle tre kohorter.
Konklusjoner
Vi har identifisert potensielt prediktive mirnas for bevacizumab effektivitet og ytterligere mirnas som kan være relatert til kjemoterapi effektivitet eller prognose hos pasienter med mCRC. Våre funn trenger ytterligere validering i store kohorter, fortrinnsvis fra gjennomførte randomiserte studier
Citation. Boisen MK, Dehlendorff C, Linnemann D, Nielsen BS, Larsen JS, Østerlind K, et al. (2014) Tissue microRNAs som predikator for utfallet hos pasienter med metastatisk kolorektalcancer Behandlet med første linje Capecitabine og oksaliplatin med eller uten Bevacizumab. PLoS ONE 9 (10): e109430. doi: 10,1371 /journal.pone.0109430
Redaktør: Ratna B. Ray, Saint Louis University, USA
mottatt: 07.07.2014; Godkjent: 22 august 2014; Publisert: 15 oktober 2014
Copyright: © 2014 Boisen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at for godkjente grunner, noen tilgangsbegrensninger gjelder datagrunnlaget funnene. Dataene er tilgjengelige fra Institutional Data Access /etikk-komité ved Avdeling for kreftbehandling, Herlev universitetssykehus for forskere som oppfyller kriteriene for å få tilgang til konfidensielle data. Dataforespørsler bør sendes til professor Julia S. Johansen ved [email protected]
Finansiering:. Denne studien ble støttet av en ubegrenset stipend fra Roche Danmark (www.roche.dk), den Herlev Hospital Research Foundation (www.herlevhospital.dk), og en proof-of-concept stipend fra Danmarks Tekniske universitet (www.dtu.dk). Alle tilskudd ble gitt til MKB alene, eller både MKB og JSJ. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og forfatterne av dette manuskriptet har følgende konkurrerende interesser: BVJ: Roche, konsulent /rådgiverrolle; SEN: Roche, konsulent /rådgiverrolle; PP: Roche, konsulent /rådgiverrolle; JSJ: Roche, honorarer og forskningsmidler; MKB: Roche, forskningsmidler. JSJ og MKB er co-oppfinnere på en patentsøknad knyttet til de nevnte miRNAs. Patentsøknad info: Navn «microRNAs for prediksjon av behandlingseffekt og prognose for kreftpasienter»; Søknad nummer «PCT /DK2013 /050015». BSN er ansatt av et kommersielt selskap (Bioneer). Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Tykktarmskreft (CRC) er en ledende årsak til kreft-relaterte dødelighet på verdensbasis [1]. De fleste dødsfallene skjer som et resultat av utviklingen av metastatisk CRC (mCRC). Standard omsorg for pasienter med mCRC som ikke kan gjennomgå radikal reseksjon av metastaser er systemet kjemoterapi med eller uten en målrettet middel [2]. Bevacizumab er et monoklonalt antistoff som binder liganden «vaskulær endotelial vekstfaktor» (VEGF-A), og derved hemmer evnen til kreft til å produsere nye blodkar fra eksisterende fartøy, en prosess som kalles angiogenese. Bevacizumab har vist effekt i pasienter med mCRC når de anvendes i kombinasjon med standard kjemoterapi, men fordelen er beskjeden når det brukes unselectively og bevacizumab tilfører betydelig toksisitet og kostnad for behandlingen [3] – [7]. Derfor har identifisering av prediktive biomarkører for bevacizumab blitt et hovedmål med biomarkør forskning hos pasienter med mCRC. På grunn av sin omfattende adopsjon som en standard første- eller andrelinjebehandling [8], ville muligheten til å individual bevacizumab har en stor innvirkning på klinisk praksis. Tallrike studier har undersøkt potensielle biomarkører i form av RNA, DNA, eller protein [9], [10]. Ingen har gjort det i klinikken. Foreløpig ingen kommersielt tilgjengelig test kan identifisere pasienter som vil ha nytte av bevacizumab.
microRNAs (mirnas) er små, ~22 nukleotider lange, ikke-kodende RNA involvert i post-transcriptional regulering av genekspresjon. De har blitt intenst undersøkt som biomarkører i pasienter med kreft fordi deres ekspresjonsnivåer er dysregulerte i kreftceller, kan de påvirke kreft oppførsel, og de er forholdsvis motstandsdyktige overfor nedbrytning i vanlig brukt sampling medier [11] – [16]. Flere studier har identifisert feilregulering av miRNAs i CRC svulstvev og i blodprøver fra pasienter med CRC; og noen av de identifiserte mirnas var også forbundet med prognostiske faktorer som dybden av invasjon, scene, og lymfeknutemetastaser [17]. Videre viktige molekylære funksjoner i CRC som mikro-satellitt ustabilitet (MSI) og
BRAF
mutasjonsstatus har vist seg å være assosiert med ulike miRNA uttrykk mønstre [18]. Derfor er det en sterk begrunnelse for å undersøke potensialet nytten av miRNA uttrykket som en prediktiv eller prognostisk biomarkør hos pasienter med CRC. Til dags dato har ingen publisert studie utforsket prediktiv verdi av miRNA uttrykk for bevacizumab effektivitet på en helhetlig måte.
Vi forsøkte å identifisere mirnas som var forutsier utfallet hos pasienter med mCRC behandlet med første linje kapecitabin og oksaliplatin med og uten bevacizumab (CAPEOXBEV /CAPEOX) og å identifisere hvilke av disse miRNAs kan være prediktiv for effekten av bevacizumab-tillegg til kjemoterapi.
Metoder
Studiedesign
En screening studie ved hjelp av en rekke tilnærmingen ble utført på primær CRC vevsprøver fra pasienter behandlet med CAPEOXBEV (screening kohort) for å identifisere kandidat mirnas med uttrykk nivåer knyttet til utfallet. Deretter ble de ekspresjonsnivåene av de identifiserte kandidat mirnas målt ved anvendelse av en mer nøyaktig metode med duplikate bestemmelser i tre kullene: en undergruppe av screening kullet; en validerings kohort, som var en uavhengig gruppe av pasientene behandlet med CAPEOXBEV; og en kontroll kohort bestående av pasientene som ble behandlet med CAPEOX alene.
Pasienter, data utvinning og endepunkter
De BETmiRC (bevacizumab Tissue microRNAs ved kolorektalkreft) studie retrospektivt inkluderte pasienter med mCRC behandlet med første linje CAPEOXBEV i 10 danske sykehus 2006-2011, og pasienter som behandles med første linje CAPEOX ved Herlev Hospital eller i en randomisert studie 2003-2006 [19], før bevacizumab ble godkjent, som tidligere beskrevet [20] sikret slutten poeng tid til sykdomsprogresjon (TTP) og total overlevelse (OS) ble målt fra oppstart av behandling til sykdomsprogresjon eller død uavhengig av årsak, henholdsvis (detaljert definisjon i File S1). Vital status ble oppdatert 5. juli 2013.
Vevsprøver
formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) vevsblokker inneholder prøver fra primærsvulster ble hentet fra National Pathology registeret. Kontrollprøver fra pasienter resected for inflammatorisk tarmsykdom ble også inkludert. En erfaren mage-tarm patologen (DL) valgt som vevsblokker å hente og scoret blokkene for tumorcelle prosentandel. Tre 10-um seksjoner ble kuttet fra hver blokk uten mikro- eller makro-disseksjon og seksjonene ble plassert i sterile Eppendorf-rør. Alle vevsprøver ble samlet før noen systemisk behandling eller strålebehandling.
miRNA uttrykket analyse
RNA ble renset ved hjelp av miRNeasy FFPE Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) ved hjelp av produsentens instruksjoner. Rense ordren ble randomisert for validering og kontroll kohort prøver. Den ikke-menneskelige miRNA ath-MIR-159a ble lagt til hver prøve før cDNA syntese som en topp-kontroll.
TaqMan Menneskelig mikroRNA matrise A og B kort Set v3.0 (Applied Biosystems) ble brukt å kvantifisere uttrykk av 754 mennesker mirnas med enkeltbestemmelser i screeningundersøkelse. I den etterfølgende undersøkelsen av den reduserte screening-, validation-, og kontrollkullene, ble miRNA ekspresjonen målt ved anvendelse av TaqMan Custom LDA kort (Applied Biosystems) profilering 22 utvalgte mirnas i duplikat med 8 prøver på hvert kort. De 22 mirnas ble valgt ut fra screening studier og mikro-fluidic kortene ble pre-konfigurerte fra produsenten i henhold til spesifikasjonene. Prøvene ble analysert i en randomisert rekkefølge på Custom LDA kortene.
Instruksjonene og reagenser fra produsenten ble brukt i alle trinn (https://www.products.appliedbiosystems.com). Alle RNA purification- og miRNA uttrykk studiene ble utført av AROS Applied Biotechnology (Århus, Danmark). Selskapet ble blindet for all klinisk informasjon.
Mirna
in situ
hybridisering
In situ
hybridisering (ISH) ble utført ved hjelp av dobbel-FAM ( carboxyfluorescein) merket låst nukleinsyre (LNA [21]) prober (Exiqon, Vedbæk, Danmark) for MIR-185-5p, MIR-455-5p, MIR-592, MIR-664-3p, MIR-21-5p, og MIR-126-3p, som tidligere beskrevet [22]. Alle ISH studier ble utført ved Bioneer (Hørsholm, Danmark).
Statistisk analyse
Ingen utvalgsstørrelsen beregningen ble gjort før studere innvielse. Vi forsøkte å ta størst utvalgsstørrelsen mulig og likeverdige størrelser av de tre kohortene
miRNA uttrykk analyser -.. Screening studie
Raw syklus terskel (C
t) for hver miRNA ble kontrollert for uteliggere og data ble korrigert ved bruk av pigg-in verdier. I en univariat utvelgelsesmetode, ble uttrykket av hver miRNA relatert til TTP og OS bruker en Cox (CPH) modell [23], [24]. Kandidat mirnas ble inkludert i en multivariat CPH modell justert for alder, kjønn, histologi, antall metastaser, primærtumor stedet, og før adjuvant behandling, som ble forenklet ved hjelp av en baklengs eliminering prosedyre basert på Akaike informasjons Criterion [25]. Analysen ble deretter gjentatt for datasett som er normalisert ved hjelp av quantile- og bety normalisering. Til slutt ble 22 mirnas valgt for videre studier i hovedsak basert på deres prestasjoner i de multivariate analysene. Antallet mirnas å inkludere i den andre studien ble valgt pragmatisk som det tillatt for like målinger på den tilpassede plattformen
miRNA uttrykk analyser -.. Screening-, validation-, og kontroll kohorter
Gjennomsnittlig C
t av de dupliserte målingene ble beregnet og forvandlet til 40-C
t. Dersom en av de to målingene ble fastslått, ble den C
t av den andre målingen som brukes. I hver av de tre kohortene, var uttrykk for de 22 mirnas relatert til TTP og OS bruker CPH modeller med justering for alder, kjønn, primær svulst plassering før adjuvant behandling, og antall metastaser. Resultatene ble rapportert som hazard ratio (HR) pr inter-kvartil range økning i uttrykk nivå med 95% konfidensintervall (KI) sikret mulig interaksjon mellom miRNA uttrykket nivå og bevacizumab behandlingseffekt ble testet i tre kohorter kombinert ved hjelp av en sannsynlighetsforhold test .
Siden utfallet for pasienter behandlet med bevacizumab uenige sterkt avhengig av primærtumor stedet [20], utførte vi også samspillet analyser for proksimale og distale primære kreft separat.
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant og ingen formelle korrigeringer for multiple sammenligninger ble gjort. Den statistiske programvarepakker R [26] (www.r-project.org) og GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc) ble brukt for alle analyser.
Target prediksjon
i silico spådd
genet mål for utvalgte mirnas ble identifisert ved hjelp av open-access DIANA-mikrotiterplater-CDS verktøy (https://www.microrna.gr/microT-CDS) [27].
Etikk
studien ble godkjent av Regional Scientific etiske komité for Region hovedstaden (https://www.regionh.dk/vek, godkjenningsnummer: H-1-2010-081). Siden denne retrospektive studien ikke ville ha noen innflytelse på behandling og siden de fleste av deltakerne var døde, skriftlig samtykke ble ikke innhentet, og dette ble godkjent av etisk komité.
Rapportering av resultatene ble fremstilt i henhold til REMARK retningslinjer [28], [29].
Flere detaljer er beskrevet i File S1.
Resultater
miRNA uttrykket ble målt i 460 FFPE-prøver. Antall prøver i hver årsklasse var. Screening kohort = 212, redusert screening kohort = 155, validering kohort = 121, og kontrollgruppen = 127 (figur S1 i File S1)
Pasientene inkludert i redusert screening-og validerings miRNA kohorter avvek fra pasientene ikke inkludert. De var mer sannsynlig å ha: resected primærtumor, en enkelt metastatisk nettsted, funksjonsstatus 0, og tidligere adjuvant behandling. De opplevde også en lengre TTP og OS (tabell 1). Pasientene i kontrollgruppen var lik de pasientene som ikke er inkludert med unntak av dem er mer sannsynlig å ha hatt den primære svulsten resected.
Screening studie
Ni prøver ble identifisert som uteliggere basert på et lavt antall mirnas oppdaget, og disse ble ekskludert, slik at 203 prøver for utfallet beregninger. Tjueseks mirnas var assosiert med TTP eller OS i multivariat analyse ved hjelp av RAW-, kvantilregresjoner-normalisert, eller bety normaliserte uttrykk data (tabell S1 i File S1). Tjueto av disse ble valgt ut for videre studier: Mir-1, MIR-15a-5p, MIR-17-3p, MIR-22-3p, MIR-29b-3p, MIR-145-3p, MIR-155-5p , MIR-185-5p, MIR-193b-5p, MIR-196b-5p, MIR-204-5p, MIR-214-5p, MIR-338-3p, MIR-382-5p, MIR-449a, MIR-455 . -5p, MIR-497-5p, MIR-501-5p, MIR-545-3p, MIR-552-3p, MIR-592 og MIR-664-3p
Fokusert miRNA panel – mirnas forbundet med TTP
Elleve mirnas var signifikant assosiert med TTP enten i screening-eller valideringen årsklasse, men ikke i begge kohorter og ingen signifikante interaksjoner ble funnet mellom miRNA uttrykk og bevacizumab effekt (tabell 2).
Kaplan-Meier kurver for TTP henhold til kvartiler av MIR-664-3p- og MIR-455-5p uttrykk er vist i figur S2 og S3 i File S1
Fokusert miRNA panel -. mirnas assosiert med OS
Tolv mirnas var signifikant assosiert med OS i ett eller flere av screening-, validation- og kontrollere gruppene (Tabell 3). Høyere MIR-664-3p uttrykk var assosiert med lengre OS i screening og validering kohorter bruker rå uttrykket: HR 0,64 (KI 0,48 til 0,86) og 0,60 (CI 0,44 til 0,82); og normalisert uttrykk: HR 0,66 (KI 0,49 til 0,91) og 0,55 (CI 0,39 til 0,79). Ingen sammenheng mellom MIR-664-3p uttrykk og OS ble funnet i kontrollgruppen. Det ble observert en signifikant interaksjon mellom MIR-664-3p uttrykk og bevacizumab effekt ved hjelp av både RAW- og normalisert uttrykk (
P
= 0,02 og
P
= 0,02). Kaplan-Meier plott for OS henhold til kvartiler av MIR-664-3p uttrykk er vist i figur 1.
Kaplan-Meier plott er vist for pasienter behandlet med CAPEOXBEV bruker rå (A) eller bety-normalisert (B ) ekspresjon og pasienter behandlet med CAPEOX alene ved hjelp av rå (C) og bety-normalisert (D) ekspresjon. Hazard ratio (HR) er ujusterte og konfidensintervall (KI) er beregnet ved hjelp av bootstrapping. Uttrykket intervaller som vises i øvre høyre hjørne er 40-C
t, så høyere verdier tilsvarer høyere uttrykk. Svart linje = laveste kvartil; rød linje = andre kvartil; grønn linje = tredje kvartil; blå linje = høyeste kvartil
Høyere MIR-455-5p uttrykk var assosiert med kortere OS i den kombinerte bevacizumab-behandlede kohorten ved bruk av normalisert uttrykk. HR 1,24 (KI 1,06 til 1,45) , men ikke i kontrollgruppen. Det var en signifikant interaksjon med bevacizumab effekt (
P
= 0,02). Kaplan-Meier plott for OS henhold til kvartiler av MIR-455-5p uttrykk er vist i figur 2.
Kaplan-Meier plott er vist for pasienter behandlet med CAPEOXBEV bruker rå (A) eller bety-normalisert (B ) ekspresjon og pasienter behandlet med CAPEOX alene ved hjelp av rå (C) og bety-normalisert (D) ekspresjon. Hazard ratio (HR) er ujusterte og konfidensintervall (KI) er beregnet ved hjelp av bootstrapping. Uttrykket intervaller som vises i øvre høyre hjørne er 40-C
t, så høyere verdier tilsvarer høyere uttrykk. Svart linje = laveste kvartil; rød linje = andre kvartil; grønn linje = tredje kvartil; blå linje = høyeste kvartil
Høyere Mir-592 uttrykk var assosiert med lengre OS i screening-og validerings kohorter bruker rå uttrykk. HR 0,69 (KI 0,69 til 0,92) og 0,76 (CI 0.60- 0,95); og i valideringen kohorten ved hjelp normalisert uttrykk: HR 0,76 (KI 0,63 til 0,93), med en lignende trend i screening kohorten ved hjelp normalisert uttrykk: HR 0,77 (KI 0,59 til 1,00). Høyere MIR-592 uttrykk var også assosiert med lengre OS i kontrollgruppen ved bruk av normaliserte uttrykk. HR 0,71 (KI 0,53 til 0,96)
Høyere MIR-196b-5p uttrykk var assosiert med lengre OS bruker RAW- og normalisert uttrykk både i den kombinerte bevacizumab-behandlede kohort: HR 0,77 (KI 0,66 til 0,90) og 0,79 (CI 0,64 til 0,97); og i kontrollgruppen. HR 0,78 (KI 0,62 til 0,98) og 0,73 (CI 0,58 til 0,93)
Fokusert miRNA panel – primærtumor plassering og andre linjen utfallet
I analyser stratifisert for primærtumor beliggenhet, en signifikant interaksjon med bevacizumab effekt ble sett for MIR-664-3p uttrykk i sigmoid tykktarm og endetarm gruppe for både TTP ved hjelp av rå uttrykk og for OS bruker RAW- og normalisert uttrykk. Expression nivåer av alle mirnas ifølge primære svulsten plassering er vist i figur S4 i File S1.
Hos pasienter fortsetter bevacizumab i andre linje, ble høy MIR-664-3p uttrykk forbundet med lengre TTP (HR 0,30,
P
= 0,04) og høy MIR-455-5p uttrykk var assosiert med en trend mot kortere TTP (HR 2,72,
P
= 0,09), mens ingen slike foreninger ble sett hos pasienter som ikke gjorde ikke fortsette bevacizumab (figur S5 i File S1).
Mirna
in situ
hybridisering
en intens MIR-664-3p ISH signal, først og fremst med en cytoplasmatisk lokalisering, ble sett i subpopulasjoner av tumor-infiltrerende lymfocytter, fibroblaster og endotelceller som ligger ved invasiv grensen (figur 3). En svak MIR-664-3p ISH signal ble observert i tumor epitelceller, men en lignende farging ble observert med krafse sonden, noe som tyder på en uspesifikk binding av proben til disse cellene. MiR-455-5p ISH signalet ble funnet i noen lymfocytt-lignende stromale celler i halvparten av prøvene, mens kreft epitelceller var negative (figur S6 i File S1). Ingen ISH signal ble oppnådd med sondene mot MIR-185, MIR-449a eller MIR-592. Positive kontroll prober for MIR-21-5p og MIR-126-3p viste moderat til intens farging i fibroblaster og endotelceller, henholdsvis i alle tilfeller.
Paneler A og B viser eksempler på MIR-664-3p ISH med infiltrering av lymfocytter (A) og fibroblaster (B). Påfølgende seksjonene ble farget med LNA prober mot MIR-664-3p, MIR-126-3p og en scramble sekvens. MiR-664-3p ISH signal er sett i infiltrere lymfocytter (A, piler, B, rød pil) og i fibroblaster (B, svarte piler), mens ingen ISH signal oppnås med krafse sonde. En sterk ISH signal er vist på endotelceller med den positive kontroll-proben MIR-126-3p. «A» i panel B viser en arterie.
Target prediksjon
Tabell S2 i File S1 viser de 20 høyest rangert spådd genet mål for Mir-196b-5p, speil 455-5p, MIR-592, og MIR-664-3p, og referanser publiserte artikler om funksjon og uttrykk nivå av disse miRNAs i kreft.
Diskusjoner
Dette er den første omfattende studien av miRNAs som prediktive biomarkører for bevacizumab effektivitet i CRC. Av de 22 mirnas valgt fra screeningundersøkelse, MIR-664-3p og MIR-455-5p viste størst potensial som prediktive biomarkører for bevacizumab effektivitet.
Sammenhengen mellom MIR-664-3p og OS signifikant forskjellig mellom pasienter behandlet med bevacizumab og pasienter behandlet med kjemoterapi alene: Økende MIR-664-3p uttrykk i grunnskolen CRC vev var assosiert med lengre OS i begge kohorter av pasienter behandlet med bevacizumab kombinert med CAPEOX men ikke i kohorten behandlet med kjemoterapi alene. Økende MIR-664-3p uttrykk var også assosiert med lengre TTP hos pasienter behandlet med bevacizumab, men samspillet testen var bare signifikant i undergruppen av pasienter med sigmoid colon- og endetarms primære svulster. Vi har tidligere antatt at denne undergruppen av pasienter kan være mer sannsynlig å utlede nytte av behandling med bevacizumab enn pasienter med flere proksimale primærsvulster [20]. MiR-664-3p uttrykk var også høyere hos disse pasientene enn hos pasienter med flere nære primære tumorer (figur S4 i File S1). I den lille kohort av pasienter med tilgjengelige andre linjen resultatdata, ble høy MIR-664-3p uttrykk også assosiert med en lengre TTP bare hos pasienter fortsetter bevacizumab, som støtter en sammenheng mellom MIR-664-3p uttrykk og bevacizumab effektivitet.
Vi observerte høy ekspresjon av MIR-664-3p i stromale celler, inkludert endotelceller, noe som er i overensstemmelse med en rolle for MIR-664-3p i angiogenese. Svært lite data har blitt publisert om dette miRNA (tabell S2 i File S1). Interessant, blant de beste spådd målene for Mir-664-3p er neuroligin 1 (NLGN1), MDGA2, og gephyrin, som alle er involvert i samme synaptogenic prosessen i nervesystemet [30], [31]. Nylig, neuroligin og dens bindingspartner neurexin har vist seg å være vidt uttrykt i det vaskulære system og som er involvert i angiogenese [30]. Overekspresjon av neuroligin 1 i endotelceller dyrket i en tumorigen miljø økt angiogenese, og knockdown av neurexin redusert fibroblast-vekstfaktor 2-indusert angiogenese [32]. I en sebrafisk embryo modell av angiogenese, inhibering av VEGF-A eller neuroligin forårsaket lignende størrelsene av vaskulære skader, men hemming av både resulterte i en mer enn additiv anti-angiogen effekt [33]. Hypotetisk, kan virkningen av MIR-664-3p uttrykk på utfallet dermed forklares med sin nedregulering av neuroligin systemet og den resulterende synergi med VEGF-A hemming av bevacizumab.
Økende MIR-455-5p uttrykk var assosiert med kortere OS i den kombinerte bevacizumab behandlet kohort mens ingen slik sammenheng ble observert i kohorten behandlet med kjemoterapi alene. Vi identifiserte høy ekspresjon av dette miRNA i lymfocytt-liknende celler lokalisert i stroma rundt kreftcellene. MiR-455-5p har blitt rapportert å være dysregulerte i kreft; har imidlertid ingen validerte mål blitt identifisert (Tabell S2 i File S1).
Økt uttrykk av både MIR-196b-5p og MIR-592 var assosiert med lengre OS i alle tre kohortene, med tilsvarende effektestimater. Begge disse mirnas har vist seg å bli nedregulert i CRC med mangelfull mismatch reparasjon (dMMR) [34]. Høyere MIR-592 uttrykk har vist seg å være assosiert med forbedret OS hos pasienter som får berging anti-EGFR behandling og høyere MIR-196b-5p uttrykk har vært knyttet til respons til neo-adjuvant 5-FU og strålebehandling hos pasienter med lokalavansert endetarms kreft [35], [36]. MiR-592 uttrykk har blitt rapportert å være høyere i venstresidig forhold til høyresidige CRC [37], som også fant vi i vår studie. Vi kunne ikke flekker våre vevssnitt for MIR-592, men uttrykk for både MIR-592 og MIR-196b-5p har tidligere vist seg å være 2.5 til 3.7 ganger høyere i CRC epitel enn i CRC stroma [38]. Funksjonen til MIR-592 er ikke blitt beskrevet. MiR-196b-5p er dysregulerte i mange kreftformer, har vært knyttet til kreft prognose, og er rettet mot c-myc, ERG, MEIS1, FAS, ABL1, BCL-2 og flere Hox-genene (Tabell S2 i File S1).
Det er viktige begrensninger for å vurdere om våre resultater. Vi studerte retrospektivt identifisert kullene fra ulike tidsperioder, noe som øker risikoen for bias, siden andre enn behandlinger som brukes kan eksistere mellom kohortene forskjeller. Vi brukte gjennomsnittlig uttrykk for normalisering, men siden mirnas som brukes for å beregne middelverdien var knyttet til utfallet, er dette sub-optimal. Selv om tilknytning til utfallet for noen av de miRNAs ble identifisert i to eller tre uavhengige kohorter, prediktiv effekt relatert til bevacizumab forblir un-godkjent. Vi gjorde ikke korrigere for flere tester, men MIR-664-3p vil fortsatt være signifikant assosiert med OS i valideringen kohorten, selv etter korrigering for de 22 mirnas testet. Også effektestimater var lik i gruppene, noe som indikerer et ikke-tilfeldig forening. Blant styrkene i vår studie er den store utvalgsstørrelsen, den første omfattende screeningundersøkelse, bruk av tre uavhengige kohorter, og randomisering av purification- og miRNA uttrykket analyse orden.
I konklusjonen, er dette den første studien å undersøke potensialet for miRNA uttrykk i primærsvulster å forutsi nytte av bevacizumab hos pasienter med mCRC. Vi har identifisert MIR-664-3p og MIR-455-5p som mulig prediktive biomarkører for bevacizumab. MiR-592 og MIR-196b-5p var prediktiv av utfallet både med og uten bevacizumab og disse kan være prognostiske biomarkører eller biomarkører knyttet til kjemoterapi effektivitet. Disse funnene må validering i uavhengige kohorter – fortrinnsvis fra randomiserte studier og bruk av stabile miRNA normalizers -Før de kan implementeres i klinisk beslutningsprosesser. Klarlegging av mobiltelefon opprinnelse og biologiske funksjoner av disse mirnas er berettiget.
Hjelpemiddel Informasjon
Fil S1.
Denne filen inneholder tilleggsmetoder, supplerende Tabell S1 og S2, og supplerende figur S1-S6
doi:. 10,1371 /journal.pone.0109430.s001 product: (PDF)
Takk
Vi vil gjerne takke: Jørgen Hansen, MD fra Avdeling for kreftbehandling ved Aalborg Hospital, Danmark for hjelp vedrørende kjøp av pasientdata; Mel Heeran, PhD for utmerket hjelp i forbindelse med seksjonering av vevsprøver FFPE-; Jakob Z. Johansen, MD for inntasting av kliniske data i BETmiRC database; Mogens Kruhøffer, PhD, fra AROS Applied Biotechnology A /S, Danmark for å få hjelp med miRNA analyser, og den danske CancerBiobank (DCB) for biologisk materiale og for data om håndtering og lagring.
