Abstract
Nye biomarkører for kreftdiagnose og behandling utvalget er sterkt behov for å legge til rette for tidlig oppdagelse og bedre behandlingsresultater. Vi har tidligere funnet en ny fosforyleringssete på serin 506 (PS506) på topoisomerase-I (topo-I), og har vist at det er allment uttrykt i cellelinjer avledet fra flere kreft, inkludert lungekreft, men er lavt i cellelinjer avledet fra ikke-cancervev. Her har vi undersøkt hvordan PS506 uttrykk i vevsprøver lunge korrelerer med deres ondartet status. Vi finner at PS506 uttrykk er signifikant forhøyet i maligne svulster i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) sammenlignet med tilstøtende, ikke-kreft lungevev og godartede lungesvulster. PS506 uttrykk var opp til seks ganger høyere i maligne eksemplarer enn i paret ikke-ondartet vev. Bruke godt karakterisert NIH /NCI 60-cellelinje panel, korrelerer vi de forhøyede uttrykk nivåer av PS506 i lunge, eggstokkreft og tykktarmskreft cellelinjer med økt følsomhet for camptothecin, en plante alkaloid som er rettet mot topo-I. Dette er i tråd med våre tidligere studier i et mindre utvalg av cellelinjer og med våre funn at PS506 øker topo-I DNA-binding. To mye brukt cellegifter for eggstokkreft og tykktarmskreft, topotekan og irinotecan, henholdsvis, er utledet fra camptothecin. Irinotecan har også vist effekt i kliniske studier med NSCLC. Våre resultater tyder på at forhøyet PS506 uttrykk kan korrelere med kliniske kjemosensitivitet for disse midlene i eggstokkene, tykktarm, og NSCLC. PS506 kan derfor fungere som en biomarkør for diagnostisering eller terapi utvalg
Citation. Zhao M, Gjerset RA (2015) topoisomerase-PS506 som en dobbel funksjon Cancer Biomarker. PLoS ONE 10 (8): e0134929. doi: 10,1371 /journal.pone.0134929
Redaktør: Zhiqian Zhang, Peking University Cancer Hospital Institute, KINA
mottatt: 04.10.2014; Godkjent: 15 juli 2015; Publisert: 6. august 2015
Copyright: © 2015 Zhao, Gjerset. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. RG Biopharma gitt støtte i form av lønn for forfatterne (RAG, MZ), men hadde ikke noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. De spesifikke roller forfatterne er formulert i «forfatterens bidrag» -delen
Konkurrerende interesser. MZ og RAG er tilknyttet RG Biopharma, hvor denne forskningen ble gjennomført. Dette selskapet tilknytning endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. RG er oppfinner på amerikanske patent # 8431353 og USA foreløpig patentsøknad 62054242.
Innledning
Nye molekylære biomarkører for kreft, spesielt de som er relevante for mekanismen av kreft eller kreftbehandling, kunne forbedre kraften av tiden anvendte diagnostiske metoder, redusere risiko for over diagnose, behandling lette seleksjon, og betraktelig bedre kreft overlevelse. Vi har tidligere funnet en ny fosforyleringssete på topoisomerase I (topo I) ved serinrest 506 (PS506), som er sterkt uttrykt i cancercellelinjer utvunnet men er lav til upåviselig i cellelinjer avledet fra normalt vev, slik at det er en mulig kandidat som en malignitet-forbundet biomarkør for diagnostisering [1].
Topo jeg spiller en avgjørende rolle i DNA metabolisme, og er den unike cellular mål for irinotecan og topotekan, to mest brukte cellegifter avledet fra anlegget alkaloid camptothecin (CPT) [2, 3]. Ved å slappe av DNA supercoils som dannes under DNA replikasjon og transkripsjon, topo jeg lindrer vridnings stress på DNA og gir ytterligere progresjon av replikasjonsgaffelen og transkripsjon kompleks, henholdsvis [4-6]. Et basalnivået av fosforylering, primært på serin-rester i sin N-terminale domene forskjellig fra PS506 er nødvendig for topo I DNA-bindende aktivitet og [7]. Økt topo I fosforylering forekommer i mange cancercellelinjer utvunnet og korrelerer med ekspresjon av PS506 i kjernedomenet av proteinet [8, 9]. Vi fant at PS506 uttrykk korrelerer også med økte nivåer av serin-treonin proteinkinase, CK2, og at rekombinant topo I kan fosforyleres på serin 506 av renset CK2 [1]. CK2, som blir konstitutivt uttrykt i lave nivåer i normale celler [10], har en tendens til å øke i kreft, og høye nivåer er tegn på dårlig prognose [11-15]. Hos mus, forsterker forhøyet CK2 pro-onkogene signalveier og samarbeider med onkogener å fremme svulster [16-22], noe som tyder på at CK2 kan spille en avgjørende rolle i kreft ved å skape et miljø som bidrar til ytterligere onkogene endringer. Dermed kan avvikende uttrykk for PS506 være symptomatisk for den pro-onkogene miljø skapt av forhøyet CK2.
Den terapeutiske relevans topo jeg gjør også PS506 en potensiell biomarkør for behandling valg. CK2-mediert fosforylering av S506 basalt fosforylert rekombinant topo I genererer en topo I med øket DNA-bindende aktivitet og økt DNA avslapping aktivitet på supercoil plasmider [1, 8]. Det ble observert at cellelinjer som uttrykker forhøyede nivåer var PS506 ofte mer følsomme for CPT, i overensstemmelse med virkningsmekanismen av dette stoffet, som bruker den enzymatiske aktivitet av topo I for å danne dens dødelige virkning [1]. Fordi CPT og beslektede stoffer tillate topo I-mediert DNA nicking men hemme topo I-mediert DNA religering, de forårsaker DNA-tråden pause til å vedvare og til slutt å danne en dødelig DNA dobbel tråd pause. Denne mekanismen er antatt å stå for den terapeutiske effekten av irinotecan og topotekan [2, 23, 24]. Den forbedrede DNA-binding og DNA avslapping aktivitet vi observerer med PS506 form av topo jeg kan derfor bidra til kliniske reaksjoner på irinotecan og topotekan ved å fremme dannelsen av DNA dobbel-strand pauser.
I denne studien har vi utforsket hypotesen om at PS506 uttrykk er karakteristisk for malignitet, og at de høyeste nivåene av uttrykk korrelerer med cellulære responser til CPT-baserte legemidler. For å evaluere forholdet mellom PS506 til malignitet vi har undersøkt vevsprøver av ondartede lungesvulster, sammen non-maligne tilstøtende lungeepitelet, og godartede lungesvulster. For å vurdere nytten av PS506 som en indikator på responsen til CPT-baserte narkotika, har vi vist sitt uttrykk i cellelinjer fra NCI-60 cellelinje panel som CPT følsomhets profiler var tilgjengelig fra National Cancer Institute /utviklings Therapeutics Program ( NCI /DTP) data base. Resultatene tyder på en meget selektiv overekspresjon av PS506 i alle ondartede lunge prøver undersøkt, sammenlignet med tilstøtende ikke-ondartet vev og benigne vevsprøver. I cellelinjer avledet fra lunge, tykktarm, og eggstokkreft, finner vi at de høyeste nivåene av PS506 uttrykk korrelerer med økt CPT følsomhet.
Materialer og metoder
Antistoffer
den pAb506P kanin-IgG ble dannet til en 21-aminosyre phosphopeptide (TVGCCS * LRVEHINLHPELKKC, hvori fosfoserin 506 er angitt med *), som beskrevet tidligere [1]. Goat anti-topo jeg IgG, som anerkjenner topo I C-terminalen, og monoklonalt anti-aktin ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California). Mus monoklonalt anti-tubulin ble kjøpt fra Novus Biologicals (Littleton, CO). De sekundære antistoffer ble geite-anti-kanin-pepperrot-peroksidase (HRP), geite-anti-muse-HRP, og esel anti-geit-HRP (Santa Cruz Biotechnology). For post-immunoprecipitation Western, ble det primære antistoff påvises ved hjelp av Pierce Clean-Blot IP Detection Reagent (Thermo Scientific, Waltham, MA), som anerkjenner bare ett, intakt IgG og ikke de dissosierte lette eller tunge kjede subenheter.
Cell linje
NCI-H358 menneskelige bronchioalveolar ikke-småcellet karsinom celler (H358), katalognummer CRL-5907, ble kjøpt mai 2011 fra American Type Culture Collection og var mycoplasma-fri. Celler ble dyrket ved 37 ° C i 10% CO
2 i Dulbeccos modifiserte Eagles medium supplementert med 10% serum fra nyfødt kalv og tilsetningsmidler, som beskrevet tidligere [8]. For camptothecin behandling, ble celler inkubert i 24 timer i nærvær av 0,1 eller 1 uM camptothecin (Sigma, St. Louis, MO), etterfulgt av høsting og Western-analyse som beskrevet nedenfor.
Cellepelleter
Frosne celle pellets fra NCI 60-cellelinje panel ble hentet fra Seksjon for kreftbehandling og diagnostikk (DCTD) Tumor omplasserer av National Cancer Institute (NCI) og ble lagret ved -80 ° C inntil bruk. Cellelinjene som celle pellets ble mottatt er oppført i (S3 tabell).
Vevsprøver
Alle vevsprøver brukt i denne studien ble frosset, anonyme, offentlig tilgjengelige arkiv eksemplarer av ikke- småcellet lungekreft med paret ikke-ondartet kontroll vev, eller prøver fra godartede lungesvulster. Alle prøvene ble mottatt fra den vestlige Division of Cooperative menneskelig vev Network (CHTN), Vanderbilt University, Nashville, TN. Ingen identifiserende privat pasient eller donor informasjon ble levert med prøvene. Siden ingen data ble innhentet gjennom intervensjon eller samspill med den enkelte og siden ingen identifiserbar private opplysninger til oss, gjorde denne forskningen ikke utgjøre mennesker forskning som definert av CFR 46.102f og OHRP Veiledning om forskning som omfatter Coded private informasjon eller biologiske prøver , og ble innvilget fritak fra vurdering av Torrey Pines Institute for Molecular Studies IRB.
Western analyser
Cell pellets (tilsvarer ~ 10
7 celler /pellets) eller to nær- konfluent 10 cm plater av PBS-vaskede H358-celler (ekvivalent med ~ 2 x 10
7-celler) ble lysert ved tilsetning av 350 ul per pellet eller 700 ul pr plate av kald RIPA-buffer (10 mM Tris pH 8, 0,15 M NaCl, 0,1% SDS, 1% NP40, 1% deoksykolat) til hvilken fullstendig protease og fosfatase-inhibitorer (Roche, Nutley, NJ) ble tilsatt like før bruk, og behandlet som tidligere beskrevet [8]. Fryste vevsprøver (gjennomsnittsvekt ~ 0,3-0,5 g) ble homogenisert i 3 ml RIPA-buffer på is ved hjelp av en vevsmaler og deretter sentrifugert for å fjerne rusk. Celle og vev lysater ble alikvotert og frosset ved -80 ° C inntil bruk. En nylig tint lysat ble anvendt for hver gel løp.
Lysatene (70 ug protein, med mindre annet er angitt) ble oppløst ved SDS-PAGE ved anvendelse av kriteriet 10-20% Tris-HCl prefabrikerte geler (Bio-Rad Laboratories Hercules, CA). En ekvivalent mengde av en nylig tint porsjon av referanse lager av H358 lysat ble inkludert i hvert forsøk som en felles styre. Etter electrophoreses, ble proteinene overført til PVDF-membraner og immunfarget ved inkubasjon med primært antistoff (1: 500 til tubulin, alle andre ved 1: 100), etterfulgt av passende HRP-konjugert sekundært antistoff (1: 1000) og Pierce ECL-reagens ( Thermo Scientific), etterfulgt av eksponering til film. Filmene ble skannet med en Alpha Imager og båndene ble kvantifisert ved hjelp av den medfølgende programvaren. PS506 båndintensitetene ble normalisert til referanse H358 kontroll.
Immunoutfelling /Western blotting
immunoutfellinger ble utført i det vesentlige som beskrevet [25]. I korthet, ble cellelysater fra eksponentielt voksende H358-celler fremstilt i RIPA-buffer som beskrevet ovenfor. Cellulære proteiner (1-2 mg) ble immunopresipitert ved gynge over natten med 50 ul geite-anti-topo I (~ 10 ug). Immunokomplekser ble samlet opp ved tilsetning av 20 ul protein AG agarose, fulgt av sentrifugering. Immunkomplekser ble dissosiert ved i fravær av ditiotreitol eller β-merkaptoetanol lav pH for å unngå dissosiasjon av IgG. Elektroforese-prøvebuffer ble tilsatt, og prøvene ble underkastet SDS-PAGE som beskrevet for Western, uten forutgående koking for ytterligere å sikre at den forble intakt IgG. Den vestlige ble behandlet som beskrevet ovenfor, bortsett fra at Clean-Blot IP Detection Reagent (Thermo Scientific) ble brukt til å oppdage det primære antistoffet.
ELISA analyse
Serine 506-fosforylerte og ikke-fosforylerte formene av den 21-amino-syre topo i peptid beskrevet ovenfor (se seksjon Antistoffer) ble syntetisert ved Biopeptide Co., Inc. (San Diego, CA). Immulon H2B ELISA-plater (Thermo Scientific) ble belagt over natten ved 4 ° C med 100 ul peptider resuspendert ved 2 ug /ml i beleggbuffer (50 mM NaHCO
3, pH 9). Platene ble vasket med vaskebuffer (Tris-bufret saltvann [TBS] pH 7,5, 0,5% Tween), og blokkert med TBS inneholdende 1% bovint serumalbumin (BSA). Platene ble vasket en gang med vaskebuffer og deretter inkubert i 1 time med serielle fortynninger (in duplo) av pAb506P i TBS /1% BSA, vasket igjen og inkubert i 1 time med geite-anti-kanin-HRP. Etter et vasketrinn, ble platene inkubert med HRP-substrat 3,3 «, 5,5»-tetrametylbenzidin (1-trinn-LANGSOM TMB ELISA, Thermo Scientific) i henhold til produsentens instruksjoner. Absorbans ved 450 nm ble avlest.
alkalisk fosfatase behandling
300 ug av cellelysat fremstilt i RIPA-buffer i fravær av fosfatase-inhibitorer ble behandlet i 1 time ved 37 ° C med 300 enheter kalv tarm alkalisk fosfatase (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO) i buffer justert til 0,1 M NaCl, 0,01 M MgCl
2, 0,001M DTT som foreslått av produsenten. En parallell kontroll lysat fremstilt i nærvær av fosfatase-hemmere ble inkubert i buffer mangler alkalisk fosfatase.
Statistiske analyser
statistiske analysene ble utført ved hjelp av GraphPad® Prism programvare (GraphPad Software, Inc., La Jolla, California).
Resultater
Kjennetegn på pAb506P
kanin polyklonale IgG, pAb506P, hevet til en PS506 holdig peptid unik for topo jeg har vært tidligere vist seg å gjenkjenne 90 kd celle topo i i kreft-avledede cellelinjer, så vel som PS506-inneholdende formen av rekombinant topo behandlet med protein kinase CK2 [1]. Antiserumet er meget spesifikt for den fosforylerte form av det immuniserende peptid, som vist ved de sammenlignende titreringskurver i peptid-ELISA-analyser (figur 1A). Ytterligere mer fremtredende pAb506P-reaktive arter migrerer på ca 45 kDa på SDS-PAGE /Western er også til stede (fig 1B, spor 1, piler indikerer stillingene til 45 kDa arter og full lengde topo jeg i H358 NSCLC cellelysatene). En topo I arter av tilsvarende størrelse har blitt rapportert i Jurkat leukemiceller [26]. Det 45 kDa art fremkommer som et mindre bånd på blots probet med et geite anti-topo I (figur 1B, spor 2), og kan bli immunopresipitert fra H358-cellelysatene med geite-anti-topo I (figur 1C), som indikerer at den deler immunoreaktivitets med full-lengde topo jeg, men er sannsynlig å være en mindre arter. Den svakere reaktivitet av full lengde topo jeg med pAb506P kan tyde på at det ikke er fullt fosforylert på dette området. pAb506P reaktivitet reduseres følgende behandling av H358 cellelysater med alkalisk fosfatase, som bekrefter at det representerer en fosforylerte arter (Fig 1D). Både full lengde topo jeg og de 45 kDa PS506-positive artene er selektivt nedregulert etter behandling med camptothecin (CPT), under forhold hvor tubulin kontroll forblir uendret, noe som indikerer at full lengde topo jeg og de 45 kDa arter reguleres på samme måte i respons til CPT (fig 1E). Topo I er den unike målet for CPT, og har tidligere blitt vist å være spesielt nedregulert i CPT-behandlede celler [27]. Til sammen resultatene tyder på at 45 kDa arter er sannsynlig å være en fosforylert nedbrytningsprodukt av topo I. Fordi det er den primære arter påvist i cellelysatene, evaluert vi uttrykk i vevsprøver.
(A ) Sammenlignings titrering kurver av pAb506P på ELISA-plater belagt med et topo jeg peptid rundt serin 506 området, enten i sin fosforylert eller ikke-fosforylert form. (B) Western analyser av H358-cellelysatene (100 ug /felt) probet med pAb506P (spor 1) eller med geite-anti-topo I (kolonne 2). Pilene viser posisjonene til 45 kDa arter og full lengde topo I. (C) Topo jeg immunoprecipitation (geit anti-topo I C-terminalen) etterfulgt av pAb506P Western of H358 cellelysater. Lane representerer 200 ug utgangsmateriale. (D) Western-analyse av PS506 og aktin i H358-cellelysatene før (CNTR) og etter behandling med alkalisk fosfatase (AP). (E) Western-analyse av PS506 (ved hjelp av pAb506P), full lengde topo I (ved bruk av geite-anti-topo I) og tubulin i H358-celler før og etter en 24-timers behandling av celler med 0,1 eller 1 uM CPT.
PS506 uttrykk i ondartet, godartet, og normal lungevevet
pAb506P ble brukt til skjermen PS506 uttrykk i anonyme prøver av ikke-småcellet lungekreft (karsinom, adenomer) og ikke-ondartet lungevevet ( som parede prøver fra den samme pasient), så vel som godartet lungesvulster. Prøvene ble hentet fra den vestlige Division of Cooperative menneskelig vev Network (CHTN) og er oppført med sine beskrivelser i (S1 Tabell Kjennetegn på tumor /ikke-tumor par (som tilbys av CHTN);.. S2 Tabell Kjennetegn på godartede svulster (forutsatt av CHTN)). Vevshomogenater fremstilt fra den parede ikke-småcellet lungetumor og ikke-ondartet lungevevet, og benigne lungetumorprøver ble analysert ved SDS-PAGE /Western for tilstedeværelse av PS506, og nivåene ble kvantifisert ved digital analyse av band intensiteter. For å sikre standardisering på tvers av ulike gels, har vi utarbeidet en enkel lysat av H358-celler, som ble frosset i porsjoner. En nylig tint porsjon av dette lysat ble inkludert i hver gel drives som en referansestandard.
Figur 2A viser en representativ Western blot for PS506 i passet maligne /ikke-maligne prøveparene 8-13, sammen med H358 referansestandard. PS506 nivåer i forhold til H358 ble likeledes vurdert for alle 21 sammenfallende par pluss 8 godartede svulster og resultatene ble bekreftet i en andre uavhengig forsøk. Gjennomsnitt og standardavvik for de to forsøkene er oppført i tabell 1 (matchet par) og tabell 2 (godartede svulster) og plottet i figur 2B. I alle 21 ondartede /ikke-maligne prøve parene ble PS506 uttrykk forhøyet i de ondartede prøven. Seksten av de 21 (76%) ondartede prøver uttrykte omtrent 2-6 ganger mer PS506 enn de ikke-maligne sammenkoblede prøven, med gjennomsnittet liggende ~ 3 ganger høyere. Femten av de 21 (71%) ondartede prøver uttrykt PS506 ved nivåer over det totalt gjennomsnitt på 0,39 for alle prøver (rød stiplet linje i figur 2B). Viktigere, ingen av de 8 godartede prøvene og kun 2 av de 21 sammenkoblet ikke-maligne prøver (for totalt 2/29 [7%]) uttrykte PS506 over dette gjennomsnittet. Dermed vil en ondartet prøven var . 10 ganger mer sannsynlig enn ikke-maligne prøven å uttrykke PS506 større enn gjennomsnittet for alle prøvene
(A) Representant PS506 Western blot av prøver av NSCLC og deres sammenkoblede ikke-maligne prøver (prøve parene 8-13). H358 er referanse kontroll for kvantifisering av alle PS506 blots. Tabellene 1 og 2 liste prøvene analysert og kvantifisering av PS506 nivåer i forhold til H358. (B) Bar graf av PS506 nivåene som er vist i tabellene 1 og 2, gruppert som parede maligne /ikke-maligne prøver og godartede svulster. (C) Scatter tomt på PS506 nivåer fra tabell 1 og 2, gruppert som ondartet (M), ikke-ondartet (N), og godartede (B) svulster. De p-verdiene ble beregnet ved en uparet t-test
spredningsdiagram i figur 2C viser PS506 nivåer i tre sett av prøver:. 21 sammen ondartet (M) og ikke-maligne (N) vev, og de 8 godartet tumor vev (b). Snitt PS506 nivåer (indikert av de svarte linjene i hvert sett) er 0,60 (ondartet), 0,24 (ikke-ondartet parvise) og 0,24 (godartet). Forskjeller i gjennomsnittlig PS506 nivåer mellom prøvesettene ble vurdert av en uparet, tosidige t-test. Som indikert i figur 2C, er forskjellen mellom ondartet vev og ikke-ondartet vev sammenkoblet var svært signifikant (
p
0,0001), og forskjellen mellom ondartet vev og godartet tumor vev var signifikant (
p
= 0,0115). ble ikke observert noen signifikant forskjell mellom PS506 nivåer i gunstige og ikke-maligne vev (
p
= 0,86). Disse resultatene indikerer at PS506 uttrykket er sterkt assosiert med malignitet.
PS506 uttrykk og CPT følsomhet
I en tidligere studie som undersøker PS506 nivåer i en rekke kreftcellelinjer, fant vi at den høyeste PS506 nivåene var til stede i cellelinjer med størst følsomhet for den topo i-målrettede plante alkaloid, CPT, med forskjeller i omtrent 2-3 ganger mellom CPT-sensitive og resistente-cellelinjer [1]. For å utvide disse observasjonene vi evaluert i forhold PS506 nivåer mellom NCI 60-cellelinje panel, tilgjengelig som frossen celle pellets fra Divisjon for kreft behandling og diagnostisering Tumor omplasserer av NCI. Panelet inkluderer cellelinjer avledet fra en rekke forskjellige tumortyper, inkludert leukemi, ikke-småcellet lungekreft, tykktarmskreft, melanom, eggstokk-kreft, nyrekreft, prostatakreft, brystkreft, og sentralnervesystem-kreft. På grunn av at cellelinjene er blitt grundig karakterisert ved NCI for følsomhet for CPT og andre eksperimentelle og etablerte cellegifter, gir de en meget standardisert ressurs som brukes til å korrelere en potensiell biomarkør med kjemosensitivitet [28].
Cellelysater fra de frosne cellepelletene ble evaluert for ekspresjon PS506 ved SDS-PAGE /Western på samme måte som de vevsprøver. Bånd ble kvantifisert digitalt og PS506 nivåer i forhold til den H358 kontrollverdien ble bekreftet i en andre uavhengig forsøk og i gjennomsnitt. For de 42 cellelinjer som CPT følsomhets data var tilgjengelige, fant vi at PS506 nivåene ble fordelt over et bredt spekter, som ble observert for de svulst vevsprøver. Den gjennomsnittlige graden av PS506 i alle 42 cellelinjer var 0,37 i forhold til den felles styre H358; en verdi som er betydelig høyere enn den gjennomsnittlige verdien av 0,24 observert for ikke-ondartet vev sammenkoblet eller godartede tumorer (figur 2). Deretter undersøkte man relative PS506 verdiene av de 42 cellelinjer med deres følsomhet for CPT ved bruk av NCI /Developmental Therapeutics Program (DTP)% vekst verdiene er etablert med en enkelt høy dose (10 uM) CPT-analyse [29]. I denne analysen indikerer en negativ prosentvis vekst verdi tap av startcellemasse på grunn av celledød, mens en positiv verdi angir hvor mange prosent av ubehandlet cellevekst, slik det er beskrevet på nettstedet DTP [28].
Vi observerte en korrelasjon mellom PS506 ekspresjon og CPT følsomhet i en gruppering av 20 ikke-småcellet lunge, tykktarm, og eggstokk-kreft-cellelinjer, som representerer tre cancere for hvilke CPT-basert terapi er enten FDA-godkjent (colon, eggstokk-) eller blir evaluert i pågående kliniske studier (ikke-småcellet lungekreft) [30, 31]. Tabell 3 viser disse cellelinjer, gjennomsnittlig PS506 nivået fra de to forsøkene (i forhold til H358-celler), og CPT følsomhets data tilgjengelig på NCI /DTP nettside [28]. Figur 3 viser et punktplott av de relative PS506 verdier for de tre undergrupper definert av deres CPT følsomhet: 8 mest sensitive (40%), de åtte mest resistente (40%), og de resterende fire med middels følsomhet (20%) . Den relative PS506 nivået reduseres i henhold til CPT følsomhet fra 0,39 (mest sensitive) til 0,21 (middels følsomhet) til 0,18 (resistente). En uparet, to-halet t-test viste en signifikant forskjell (
p =
0,028) i det gjennomsnittlige PS506 nivået mellom de mest følsomme, og de mest resistente cellelinjer, i samsvar med våre tidligere studier med et mindre utvalg av cellelinjer [1]. Disse data antyder at for lunge, tykktarm, og eggstokk-kreft, er ekspresjon av PS506 en determinant av følsomhet for CPT-baserte stoffer. Viktigere, halvparten av cellelinjene betegnet CPT-sensitive, men ingen av dem med mellomliggende CPT sensitivitet eller resistens CPT-uttrykte PS506 ved et nivå over det gjennomsnittlige på 0,37 for alle 42 cellelinjer.
Punktdiagram av relativ PS506 nivåer i cellelinjer som representerer den 40% mest følsomme CPT, 40% mest CPT motstandsdyktig, og den 20% med middels sensitivitet blant settet av eggstokk-kreft, tykktarmskreft, og NSCLC-cellelinjer. Den røde stiplede linjen på 0,37 viser gjennomsnittlig PS506 nivå i cellelinjene som CPT følsomhets data var tilgjengelige. Den p-verdi ble beregnet ved en uparet t-test
Vi har også sammenlignet PS506 nivåer med CPT følsomhet for den større gruppen av 42 cellelinjer som representerer et bredere spekter av kreftformer (se.: S3 Tabell. CPT følsomhet og PS506 nivåer i cellelinjer fra NCI 60 cellelinjen panel). Også her vi har observert en positiv sammenheng mellom PS506 nivåer og CPT følsomhet, med de mest resistente cellelinjer som uttrykker lave PS506 nivåer (40% av linjer, betyr PS506 nivå = 0,34), og de mest sensitive cellelinjer som uttrykker høyere PS506 nivåer (40 % av linjer, betyr PS506 nivå = 0,41), i samsvar med en modell hvor PS506 bidrar til CPT følsomhet. I analysen av denne større gruppe, gjorde forskjellene i gjennomsnittsverdiene ikke statistisk signifikant, men (
p
= 0,43), muligens på grunn av bidraget av cellulære faktorer uavhengig av topo jeg som CPT opptak, intracellulær metabolisme CPT og fordeling, og den cellulære respons på DNA-skade, som alle kan påvirke utfallet av CPT-behandlinger [32]. Likevel, resultatene av denne screening støtter forestillingen om at PS506 nivåer kan brukes til behandling valg for visse kreftformer.
Diskusjoner
Denne studien viser at uttrykk for PS506 er malignitet spesifikke, og at de høyeste nivåene av PS506 uttrykk i kreftcellelinjer av lunge, tykktarm, og eggstokkreft opprinnelse korrelerer med økt følsomhet for CPT. PS506 nivåer ble forhøyet i alle 21 ondartede eksemplarer av ikke-småcellet lungekreft i forhold til paret ikke-ondartet vev og 8 godartede lunge vevsprøver. I de fleste prøveparene, økningen i PS506 ekspresjon i ondartet versus ikke-ondartet vev varierte fra to ganger til 6-fold. De to ikke-maligne grupper av prøver (21 non-maligne vev og 8 godartet svulst vev), var ikke signifikant forskjellig i PS506 uttrykk. Mens de absolutte nivåene av PS506 ekspresjon i maligne tumorprøver var variabel, viste 71% av ondartede svulster PS506 nivåer over gjennomsnittet for befolkningen (alle prøver slått sammen, det vil si, ondartet + ikke-ondartet), mens bare 7% av ikke-maligne prøver uttrykt PS506 over gjennomsnittet for befolkningen.
Når vi har evaluert NCI-60-cellelinjen panel, vi også funnet at det gjennomsnittlige PS506 ekspresjonsnivået på tvers av cellelinjene var høyere enn for de ikke-maligne vevsprøver (0,37 i cellelinjer versus 0,24 i ikke-maligne prøver). Vi analyserte sammenhengen mellom PS506 uttrykk med cellular følsomhet for topo I-målrettede stoff CPT, ved hjelp av CPT sensitivitets data tilgjengelig på NCI /DTP nettsiden. I lunge, tykktarm, og eggstokkreft cellelinjer, som representerer tre kreftformer som CPT-avledet cellegifter er godkjent eller under klinisk testing, fant vi at 40% mest CPT-sensitive cellelinjer uttrykt betydelig høyere nivåer av PS506 enn gjorde 40% mest resistente cellelinjer, i samsvar med våre tidligere observasjoner i et mindre utvalg av tilgjengelige cellelinjer [1]. Middels nivå av PS506 uttrykk ble observert i 20% av cellelinjer med mellom CPT følsomhet. Disse resultatene antyder at PS506 kan tjene, i kombinasjon med andre kliniske faktorer, for å lette beslutningsprosess for behandling av pasienter med CPT-avledede stoffer, irinotecan og topotekan. Riktig valg av stoffet er avgjørende for å lykkes med behandlingen. Dette gjelder særlig for andre linjeterapi, som et mislykket behandling kan resultere i en avtagende fysisk tilstand til pasienten og øker sannsynligheten for at ytterligere behandling vil være mislykket. Det er i dag ingen pålitelige prediktive tester for sensitivitet til CPT-deriverte legemidler. Anvendelsen av PS506 som et hjelpemiddel for terapi utvalg ville utgjøre et avgjørende skritt mot å oppnå mer individualisert behandlingsregimer.
Utviklingen av blodbaserte analyser for PS506 kan potensielt gi en diagnostisk test for tidlig deteksjon eller overvåking av lunge kreft eller andre kreftformer. Flere sirkulerende protein markører er for tiden i klinisk bruk for visse kreftformer, primært for oppfølging. Disse inkluderer CA125 for eggstokkreft, CA19-9 for kreft i bukspyttkjertelen, CEA for tykktarmskreft, og PSA for prostatakreft (anmeldt i [33]). CYFRA21-1, en cytokeratin markør for epitelceller i plasma eller blod, har vært assosiert med ikke-småcellet lungekreft og andre epiteliale kreftformer, men har svært variabel sensitivitet eller spesifisitet for malignitet. En fersk rapport beskriver en ELISA-analyse for tymidin kinase i blodprøver for lungekreft deteksjon, [34]. Gitt at topo I er én av de 10-25% mest tallrike av cellulære proteiner i celler og i plasma [35], er sannsynlig å være gjennomførbart og følsomt en lignende test for PS506. I tilfelle av lungekreft, kan en spytt-baserte analysen også være mulig, som kreftceller er til stede i sputum fra lungekreftpasienter. Flere andre kandidatmarkører er identifisert [36, 37]. Imidlertid har ingen biomarkør ennå blitt vist å ha den nødvendige følsomhet, spesifisitet og reproduserbarhet som skal valideres for rutinemessig klinisk bruk, og flere biomarkører er nødvendig.
Muligheten for at PS506 kan være årsaksmessig knyttet til kreft øker sterkt sin interesse som en biomarkør. Fordi topo jeg besitter DNA sammenpressing /religere aktivitet, er den tette regulering avgjørende for å unngå avvikende DNA sammenpressing som kan destabilisere genomet og fremme ondartet progresjon [38]. Ectopically overuttrykt topo I er recombinogenic i gjær og bakterier, og kan derfor fremme DNA-rearrangementer og andre former for genom ustabilitet i pattedyrceller, så vel [39, 40]. Denne muligheten er støttet av bevis for at topo jeg er viktig for kromosombrudd på vanlige sårbare områder (CFSs), hvor DNA rearrangements vanligvis oppstår i kreft [41, 42]. En godt karakterisert CFS, FRA3B, ofte omorganisert i lungekreft [43].
