Abstract
Mus modeller har blitt utviklet for å undersøke tykktarmskreft etiologi og evaluere nye anti-kreft terapi. Mens genmodifisert og kreftfremkallende-indusert musemodeller har gitt viktig informasjon med hensyn til mekanismene bak onkogene prosessen, tumor xenograft modeller forbli standard for evaluering av nye kjemoterapi og målrettet medikamentell behandling for klinisk bruk. Imidlertid er det fortsatt uklart i hvilken grad Eksplanterte kolorektale svulstvevet beholde iboende patologiske funksjoner over tid. I denne studien har vi generert et panel av 27 pasient avledet kolorektal kreft explants (PDCCEs) ved direkte transplantasjon av menneskelige kolorektal kreft vev i NOD-SCID mus. Ved hjelp av dette panelet, utførte vi en sammenligning av histologi, genekspresjon og mutasjonsstatus mellom PDCCEs og de opprinnelige menneskelige vev som de ble hentet. Våre funn viser at PDCCEs opprettholde viktige histologiske funksjoner, enkel genuttrykksmønster og
KRAS Twitter /
BRAF
mutasjonsstatus gjennom flere passasjer. Til sammen er disse funnene tyder på at PDCCEs opprettholde likheten til pasientens tumor fra hvilken de er avledet, og kan ha potensiale til å tjene som en pålitelig preklinisk modell som kan bli innlemmet i fremtidige strategier for å optimalisere individuell terapi for pasienter med kolorektal kreft.
Citation: Uronis JM, Osada T, McCall S, Yang XY, Mantyh C, Morse MA, et al. Histologisk og molekylær Evaluering av Pasient Avledet Colorectal Cancer explants (2012). PLoS ONE 7 (6): e38422. doi: 10,1371 /journal.pone.0038422
Redaktør: Alana L. Welm, Huntsman Cancer Institute, University of Utah, USA
mottatt: 8 mars 2012; Godkjent: 09.05.2012; Publisert: 04.06.2012
Copyright: © 2012 Uronis et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra mentor stipendiater Grant (119824-MRSG-10-195-01-TBG) fra American Cancer Society (www.cancer.org). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den tredje vanligste kreftformen og den nest største årsaken til kreft dødsfall i USA. I 2010 ble om lag 142 000 personer diagnostisert med CRC, og ca 40% av disse pasientene presenteres med avansert sykdom [1]. Behandling for avansert CRC med kjemoterapi er vanligvis beregnet for sykdomskontroll og lindring av bare symptomene, og som et resultat, unresectable CRC fortsatt en uhelbredelig sykdom. For å forbedre kliniske resultater og utvikle nye terapeutiske tilnærminger, er utviklingen av en pålitelig preklinisk modell for å studere CRC biologi og narkotika følsomhet nødvendig.
Mouse modeller av CRC er fortsatt en av de mest nyttige verktøy for å dechiffrere den biologiske mekanismene bak onkogene prosessen. Til dags dato er det etablert en rekke genetisk modifiserte, kreftfremkallende-indusert og xenograft musemodeller [2], [3], og det er generelt enige om at ingen modell er tilstrekkelig for å belyse alle sider av CRC etiologi.
genetisk modifiserte mus (GEM) modeller har vært uvurderlig i å etablere rollen av mange forskjellige genetiske mutasjoner og signaltransduksjonsveier som bidrar til onkogene prosessen og tillate undersøkelse i forbindelse med en aktiv immunsystem [2], [3]. Imidlertid er mange av disse GEM modellene, først og fremst de som involverer mutasjon av
APC
tumorsuppressorgen, utvikle tumorer i tynntarmen i stedet for tykktarmen. Dette gjør langsgående sykdomsprogresjon studier vanskelig i tillegg til mangler den genetiske kompleksiteten observert i humane kreftformer [2], [3].
En annen mye brukt musemodeller av CRC er avhengig av bruk av kreftfremkallende for å indusere tykktarmskreftutvikling . Kanskje den mest brukte kreftfremkallbaserte modellen er den Azoxymethane (AOM) modell. Her blir kolorektal tumor utvikling initiert av AOM, en potent, kolon-spesifikk kreftfremkallende gjennom dannelsen av DNA-addukter [4]. Kolorektal tumorer avledet ved hjelp av denne modellen rekapitulere viktige menneskelige patologiske trekk observert hos mennesker og tillate undersøkelse av de tidlige stadiene av CRC. Men startfasen og utvikling er en tidkrevende prosess, ofte tar opp til 6 måneder med svulst mangfold og pene avhengig tungt på musen belastningen [2], [5], [6].
Mens GEM og kreftfremkallende -baserte modeller har betydelig forbedret vår kunnskap om genetikk og etiologien av CRC, disse modellene ikke tillate nøyaktig testing av kreftbehandling som skal anvendes i et klinisk miljø [7]. Den mest anvendte
in vivo
modell for testing av anti-kreft-medikament-effektivitet og kombinasjoner er den xenograft modell. Historisk xenotransplantater er vist ved subkutan injeksjon av genetisk definerte humane cellelinjer utvunnet i svekket immunforsvar nakne mus [8]. Men til dags dato, har de fleste av disse cellelinje-baserte xenograft modeller unnlatt å generere stoffet følsomhet data som oversetter i klinisk relevant informasjon [7]. I tillegg har senere rapporter tyder på at tumor-stroma interaksjoner ikke til stede i cellelinjebaserte xenotransplantater kan utgjøre en integrert komponent i onkogene potensial og tumormedikamentrespons [9], [10]. Derfor, mer nylig, hel-vev eksplantater avledet fra humane kreftformer, inkludert bryst [11], lunge [12], prostata [13] og tykktarmskreft [14] – [16] er blitt etablert i et forsøk på å generere mer klinisk nøyaktig og pålitelige xenograft modeller. Men disse studiene undersøkte hovedsakelig tidlig passasje explants ( 5 generasjoner) fra hovedsakelig primærsvulster og derfor er det fortsatt behov for å ytterligere karakterisere disse modellene og evaluere hvor godt de beholder viktige kjennetegn ved den opprinnelige menneskelige svulst spesielt ved metastatisk sykdom
H E farget deler av to uavhengige godt differensierte adenokarsinomer (CRC039 og CRC075) viser at tumor arkitektur er fortsatt like etter 11 passasjer i NOD /SCID-mus. Bildene er på 20 x forstørrelse.
A. Representant PDCCE (CRC039) beholder kjerne CDX2 uttrykk etter 11 generasjoner i mus. Bildene er på 20 x forstørrelse. B. Tidlig passasje PDCCEs beholde signetring morfologi observert i original pasient kolorektal svulst. Bildene er på 40 x forstørrelse. C. xenotransplantater generert fra WiDr og HT29 CRC cellelinjer som mangler histologisk funksjoner i samsvar med pasientavledet eksplantater inkludert tilstedeværelse av stroma og dannelse av kjertlene. Bildene er på 20 x forstørrelse.
I denne studien har vi utført en mer omfattende molekylær og histologisk analyse av et panel av 27 matchet pasient avledet kolorektal kreft explants (PDCCEs) fra både primære og metastaser som en forlengelse av vårt tidligere arbeid [17] der vi sammenlignet genuttrykket profilen til 14 matchet PDCCEs og tilhørende humane tumorer. Vi viser nå at PDCCEs beholde globale genuttrykksmønster, onkogen mutasjon status og histologiske parametre som finnes i de opprinnelige kreft hos mennesker. Til sammen viser disse funnene tyder på at PDCCEs har potensial til å tjene som en pålitelig preklinisk modell som kan brukes til å utvikle og karakterisere nye terapeutiske mål for pasienter med CRC.
Materialer og Metoder
tumorprøver /etikk Uttalelse
i alt 27 humane prøver ble oppnådd for genomisk og histologisk analyse. Alle pasienter gitt skriftlig samtykke til å ha vev lagres og brukes til forskning. Prøvene som brukes til analyse i laboratoriet ble avidentifisert og ikke knyttet til noen personlig helseinformasjon (PHI). Alle deler av denne studien ble godkjent av Duke Institutional Review Board. Alle dyrestudier ble utført under en Duke University Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) godkjent protokoll.
Unsupervised cluster analyse av 27 pasient tumor-PDCCE matchet par viser at 22 par (81%) falt i samme klynge og 18 avstemt PDCCE (66%) gruppert direkte i par med den opprinnelige pasientens tumor (grå bokser). Eksempel på navn som inneholder en X betegne PDCCE (xenograft) prøver. Tallet umiddelbart etter X indikerer generasjon /passasje antall av den aktuelle prøven.
Generation of Patient-Avledet Colorectal Cancer explants (PDCCEs)
Kolorektal svulster (både primær- og metastatisk ) ved tidspunktet for kirurgi ble samlet under en Duke IRB godkjent protokoll (Pro00002435). Vevene ble vasket med fosfatbufret saltvann (PBS) og deretter hakket i stykker ca ~ 2 mm i størrelse og injisert inn i flankene av fire-ukers gamle NOD.CB17-PrkdcSCID-J-mus ble oppnådd fra Jackson Laboratories under en Duke IACUC godkjent protokoll. Mus ble observert og tumorer målt med Vernier calipers inntil volumet av tumoren ((V = L x 2 W x 0,52 (L = lengste diameter, W = korteste diameter)) nås ~1,000 mm
3. Tumorene ble deretter høstet, hakket og re-implantert som beskrevet over til stabile PDCCEs ble etablert. Ved hver generasjon, ble tumorer høstet og enten fiksert i 10% nøytral buffret formalin (NBF), hurtigfrosset i flytende nitrogen eller frosset i en optimal skjære temperatur (OCT) medium tørris for videre analyse
Histologisk preparat og eksamen
Parafin-embedded PDCCE vev ble seksjonert i 6 mikrometer intervaller og farget med hemotoxylin og eosin (H E).. Hver prøve . ble bedømt av en trenet patologen for følgende histologiske kriterier: histologisk type CDX-2 positivitet og relativ andel av tumor, nekrose, stroma, tumor kjertel dannelse og CDX-2 positive kjerner Alle vev ble undersøkt ved hjelp av 10 høy- drevet felt per seksjon. Tumor kjerner ble evaluert for CDX-to flekker ved hjelp av en standard kvantitativ skala fra 0, 1+, 2+ og 3+. Farging av tumor kjerner på 2+ og 3+ ble ansett positiv og alle tilfeller vurderes positivt utstilt minst 20% av tumor kjerner med farging.
Oncogene Mutasjon analyse
Genomisk DNA ble isolert fra snap frosne PDCCE vev ved hjelp av en Qiagen genomisk DNA kit. Prøvene ble fortynnet til 10 ng /mL og PCR ble utført ved hjelp av følgende primere for
KRAS
: forover 5 «GTGTGACATGTTCTAATATAGTCA 3»; reversere 5 «GAATGGTCCTGCACCAGTAA 3» og
BRAF
: forover 5 «TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA 3»; omvendt 5 «GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA 3». Amplikonene ble sekvensert ved konvensjonelle metoder ved hjelp av termin primere.
Microarray analyse
RNA ble isolert fra snap-frosne PDCCE vev ved hjelp av en Qiagen RNA /DNA Allprep kit, konvertert til cDNA og merket med en syklus IVT. IVT merket cDNA ble fremstilt i henhold til produsentens anvisninger, og målene hybridisert til Human U133A 2.0 Genechip og lese på Affymetrix radarantenne. Rådata ble omdannet til. CEL filer og RMA normalisert. CEL filer (GSE35144) er tilgjengelig på Gene Expression Omnibus (GEO) dataregister (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). For å se etter eksempler på uteliggere og batch-effekter, ble 3D Hovedkomponentene analyse av den globale genuttrykk utført. Batch effekter ble normalisert ved hjelp av kamp algoritmen (https://jlab.byu.edu/ComBat/) [18]. Unsupervised hierarkisk clustering av humane tumorer og matchende PDCCEs ble utført på 20% av gener med størst koeffisient av variasjon. Agglomerative klynger ble generert ved hjelp av Pearsons korrelasjonskoeffisient og fullstendig kobling ved hjelp av R-programmet (R Foundation for Statistiske Computing).
programvaren som brukes for analyse
R statistisk programvare pakken er tilgjengelig på www .r-project.org. Den Bioconductor R-pakken er tilgjengelig på www.bioconductor.org. Combat er tilgjengelig som en R-skript på https://jlab.byu.edu/ComBat/. GraphPad Prism er et produkt av Graphpad programvare (La Jolla, CA, USA) og er tilgjengelig på www.graphpad.com/prism/prism.htm.
Resultater
Histologisk Evaluering av PDCCEs
Et panel av 27 pasient avledet kolorektal kreft explants (PDCCEs) ved direkte transplantasjon av humane tykktarmskreft (CRC) vev i NOD-SCID-mus ble opprettet i denne studien. Tabell 1 viser opprinnelsen til pasienten tumor og et total av 5 primær PDCCEs og 22 metastatiske PDCCEs ble samlet. For å vurdere i hvilken grad
in vivo
modeller av pasient avledet kolorektal kreft eksplanter (PDCEEs) nøyaktig rekapitulere og kan derfor tjene som en modell av den menneskelige tilstand, undersøkte vi om PDCCEs beholde nøkkel biologiske egenskaper iboende i individet menneskelige kolorektal kreft (CRC) over tid. Først, for å evaluere i hvilken grad histologiske parametere beholdes etter xeno-transplantasjon, ble to uavhengige PDCCEs passert gjennom 10 generasjoner og evaluert histologisk. Begge PDCCEs undersøkte viste patologiske funksjoner bemerkelsesverdig konsistent med den opprinnelige pasienten svulsten gjennom 11 generasjoner (figur 1). Deretter en omfattende histologisk evaluering utført på en sub-panel av 15 matchet PDCCEs og originale banked vev viste at 15/15 PDCCEs beholdt patologiske funksjoner som ligner på de som ble observert i den matchende menneskelige svulst og ble karakterisert som histologisk identisk med deres matchet opprinnelige banked prøve (Tabell 2). Selv etter 11 generasjoner, PDCCEs beholdt evnen til å danne kjertler og inneholdt CDX-2 positive kjerner sammenlignes med de første generasjon PDCCEs (figur 2). Disse data viser at de histologiske trekk som er tilstede i tykktarmskreft, inkludert dannelsen av kjertler og nærværet av stromale komponenter beholdes selv i slutten av passasjen eksplantater, noe som tyder på at i motsetning til CRC-cellelinje-avledet xenografter, gir PDCCE modell oss med et forskningsverktøy som rekapitulerer den menneskelige tilstand generelt ikke observert i andre modeller.
PDCCEs beholde Basic Global Gene Expression Profiler Iboende human kolorektal kreft
Neste, for å ytterligere evaluere i hvilken grad PDCCEs representere sine primære menneskelige motstykker analyserte vi 27 matchet pasientsvulster og PDCCEs av microarray analyse. Pasient tumor og PDCCE genekspresjonsdata ble først normalisert ved hjelp kamp for å minimere batch effekter. Unsupervised hierarkisk klyngeanalyse ble deretter utført på den normaliserte datasett og avslørte tre atskilte klynger (figur 3). Av de 27 avstemt pasientens tumor og PDCCEs, 22 par (81%) falt innenfor det samme område, basert på dendrogram og 18 PDCCEs (66%) gruppert direkte med den opprinnelige tumorprøve. Til sammen disse dataene tyder på at grunnleggende globale gen-uttrykk mønstre er bevart mellom PDCCEs og deres opprinnelige menneskelige motstykker.
Oncogene Mutation Status er beholdt i PDCCEs
For pasienter med avansert kolorektal kreft, testing av mutasjonsstatus av onkogener som
KRAS
er nødvendig for å lede terapi. Spesielt pasienter med
KRAS
mutasjoner viser ingen nytte av behandling med EGFR-hemmere som cetuximab eller panitumumab, mens pasienter med tumorer er
KRAS
WT utlede nytte av anti-EGFR basert terapi [19] , [20]. For å avgjøre hvorvidt disse klinisk viktige genomiske parametrene blir opprettholdt i PDCCEs ble 27 matchet PDCCEs og originale pasientprøver analysert for
KRAS Hotell og
BRAF
mutasjonsstatus. Av de 27 matchede par evaluert, 13 presenteres med aktivering av
KRAS
mutasjoner (kodon 12 = 11; kodon 13 = 2) (tabell 3). Av disse 27 matchede par, 26/27 PDCCEs (96%) matchet sin opprinnelige menneskelige motstykke tyder på at menneske kolorektal kreft vev opprettholdes som mus PDCCEs er genetisk stabil og beholde onkogen mutasjon status kritisk til CRC patofysiologi. Alle prøvene testet negativt for
BRAF
mutasjoner. Til sammen disse data tyder på at PDCCEs opprettholde biologisk komplekse histologisk, genuttrykk og mutasjonsbaserte egenskaper observert i menneskelige CRC.
Diskusjoner
Til dags dato er det etablert en rekke mus xenograft modeller å undersøke CRC etiologi og behandling. I stor utstrekning, har disse modellene er generert ved hjelp sen passasje cellelinjer avledet fra humane CRC og mens betydelige behandlings-induserte tumorresponser er observert i disse modellene er de sjelden prediktive for tumorrespons hos mennesker [7]. Dette skyldes sannsynligvis i disse modellene, i det minste delvis, til den iboende mangel på stroma i tumor-avledede epiteliale cellelinjer. Monterings bevis indikerer at parakrin signalering og ekstracellulære matrisekomponenter som leveres av nabo stromale celler spiller en betydelig rolle i den onkogene potensialet av kolorektal karsinom, og at modulering av disse stromale interaksjoner direkte påvirke effekten av kjemoterapi på tumorrespons [9], [10].
Tidligere forsøk har blitt gjort for å generere mus xenograft modeller av CRC ved direkte transplantasjon av humane tykktarmskreft i svekket immunforsvar mus [14] – [16], [21]. Poupon og kolleger rapporterte at passasjen av menneskelige kolon kreft vev gjennom en xenograft scene forbedrer suksessrate på cellelinje avledning fra menneskelige CRC metastaser [15] betraktelig. Mer nylig, Hohenadl og medarbeidere rapporterte at histologiske karakteristika og onkogene ekspresjonsnivåer holdes på plass i begynnelsen av passasjen CRC-xenotransplantater [21], mens FICHTNER et al., Og Messersmith et al, brukte paneler av 15- og 10 humane CRC-eksplantater henholdsvis for å vurdere medikamentsensitivitet [14], [16]. I tillegg er disse studiene brukte pasient avledet explants hovedsakelig fra det primære området og som metastatiske svulster har en tendens til å være mer aggressive og er mer sannsynlig å skille, er det fortsatt uklart om PDCCEs generert fra metastaser vil opprettholde likhet med den opprinnelige svulsten. Selv om disse studiene har begynt å understreke verdien av eksplantering modeller i CRC-forskning, er nødvendig for en mer omfattende histologisk og molekylær analyse på et større panel av humane CRC eksplantater til å rettferdiggjøre deres anvendelse som en preklinisk modell for å utføre nøyaktig medikamenteffektanalyse og logisk biomarkør identifikasjon.
i denne studien, viser vi at PDCCEs generert fra menneskelige adenokarsinomer med varierende histologisk har hver beholder parametrene av svulsten som de ble hentet på histologisk, global RNA uttrykk og onkogene mutasjonsnivåer. Til tross for eksistensen av forskjeller i prosentandelen av tumor stroma til stede mellom de opprinnelige humane vev og de som xenopodet i mus, fokuserer vår studie på de ondartede epitelceller. Først blir histologisk arkitektur iboende til kolorektal adenokarsinom, først og fremst evnen til å danne dysplastiske kjertler, så vel som tilstedeværelse av CDX-2-positive kjerner holdes i PDCCEs gjennom flere passasjer ( 10). Deretter sammenlignet vi genekspresjonsprofiler mellom passet PDCCEs og dens tilsvarende pasientens tumor og observert at 18/27 (66%) av prøvene gruppert sammen direkte og 22/27 (81%) gruppert innenfor hovedgruppe som definert av dendrogram .
Vi spekulerer i at de 9 PDCCE prøvene som ikke klynge direkte med deres korresponderende opprinnelige svulsten kan ha vært på grunn av den iboende heterogene natur CRC. Det er sannsynlig at de opprinnelige CRC tumorprøver som tilsvarer disse 9 PDCCEs næret små delpopulasjoner bærer flere onkogene hendelser. Dette vil i sin tur gi en vekstfordel med disse populasjonene etter å ha blitt transplantert inn i mus, forårsaker PDCCE for å ha en forskjellig genetisk sammensetning enn det opprinnelige vev fra hvilket det ble hentet. Til støtte for dette begrepet, ser det ut til at de fleste variasjon mellom den primære tumor og dens PDCCE forekommer i begynnelsen av PDCCE passasjer, og at mindre variasjon skjer gjennom prosessen med aging. For eksempel PDCCE CRC105 gruppert med den opprinnelige pasientprøve ved PDCCE passasjer 1 og 11, mens PDCCE CRC149 ikke klynge med sin opprinnelige prøven på enten passasje 1 eller 5 tyder på at genetiske endringer skjer hovedsakelig i tidlige passasjer og blir vedlikeholdt gjennom senere passasjer. Det er også mulig, at det i disse prøvene 9, kan det ha vært en større stromal forurensning som resulterer i en forskjell i deres gruppering mønster. Disse resultatene tyder på at det faktisk er iboende forskjeller mellom det tilpassede pasientens tumor og PDCCE og ekstrapoleringer som trekkes fra disse modellene må gjøres så nøye. Men total våre funn tyder på at PDCCE modellen har potensiale til å bli brukt i undersøkelsen av nye terapeutiske midler som er rettet mot både ondartet epiteliale tumor arkitektur og /eller stromal komponent og som PDCCEs kan opprettholdes for 10 eller flere generasjoner og samtidig beholde nøkkel histologiske parametre.
til slutt, vi evaluert
KRAS Hotell og
BRAF
mutasjonsstatus PDCCEs og viste at status for alle unntatt én av de onkogene mutasjoner ble beholdt. Vi har observert ett tilfelle (CRC020) hvori en
KRAS
aktiverende mutasjoner var til stede i den PDCCE men ble ikke påvist i de opprinnelige pasientprøvene til tross for det faktum at disse prøver gruppert sammen ved ukontrollert klyngeanalyse. Det er mest sannsynlig at en liten, ikke målbart populasjon av
KRAS
mutante celler var til stede i pasientens tumor på tidspunktet for kirurgisk reseksjon, og at vekstfordel gitt av
KRAS
aktivering tillatt for påfølgende utvidelse av
KRAS
mutante celler under tidlige PDCCE passasjer.
Selv om noen enkelt musemodell vil aldri fullt rekapitulere faktiske funn hos pasienter, er nødvendig og praktisk for utvikling av terapeutisk bruk av prekliniske modeller agenter og biomarkører og et viktig første skritt i å bringe disse midlene til klinikken. Vi innser begrensningene i vår modell, og at eventuelle funn må gjennomgå strenge tester for å måle dens nøyaktighet, pålitelighet og reproduserbarhet og må også tilbakevirkende kraft validert i flere pasientprøver. Likevel føler vi at vår preklinisk musemodell har potensial til å bli brukt til å identifisere og teste nye kombinasjoner av terapeutiske midler og å også utvikle både forutsigbar og prognostiske biomarkører, som deretter kan systematisk brakt ut i klinisk setting.
takk
forfatterne ønsker å takke Duke microarray kjernen anlegg for innsamling av microarray data.
