Abstract
Overuttrykte av epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) er et kjennetegn på hode og nakke kreft og confers økt motstand og dårligere overlevelse. Til tross for målrettede midler mot EGFR, for eksempel cetuximab (C225), nesten halvparten av pasientene som ble behandlet mislykkes denne behandlingen, nødvendiggjør nye terapeutiske strategier. Poly (ADP-Ribose) polymerase (PARP-hemmere) (PARPi) har fått ny oppmerksomhet på grunn av sin unike selektivitet i å drepe svulster med defekt DNA-reparasjon. I denne studien, viser vi at C225 forbedrer cytotoksisitet med PARPi ABT-888 i UM-SCC1, UM-SCC6, og Fadu hode og nakke kreft celler. Mekanismen for økt sårbarhet for C225 og PARPi innebærer C225-mediert reduksjon av ikke-homologe end-sammenføyning (NHEJ) – og homolog rekombinasjon (HR) -mediert DNA dobbel tråd pause (DSB) reparasjon, den påfølgende utholdenhet av DNA-skade, og aktivering av den indre apoptotiske reaksjonsvei. Ved å generere et DSB reparasjon mangel, kan C225 gjengi hode og hals kreftceller utsatt for PARP hemming. Kombinasjonen av C225 og PARPi ABT-888 kan således være en innovativ behandling strategi for å potensielt forbedre resultatene i hode og nakkekreftpasienter. Videre kan denne strategien også være mulig for andre EGFR overekspresjon tumorer, inkludert lunge- og hjernekreft
relasjon:. Nowsheen S, Bonner JA, LoBuglio AF, Trummell H, Whitley AC, Dobelbower MC et al. (2011) Cetuximab forsterker Cytotoksisitet med Poly (ADP-Ribose) Polymerase Hemming i hode- og halskreft. PLoS ONE 6 (8): e24148. doi: 10,1371 /journal.pone.0024148
Redaktør: Kerstin Borgmann, Universitetssykehuset Hamburg-Eppendorf, Tyskland
mottatt: 7 mars 2011; Godkjent: 05.08.2011; Publisert: 30 august 2011
Copyright: © 2011 Nowsheen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av staten Alabama Investment Pool for Handling (IMPACT) Award fra University of Alabama i Birmingham School of Medicine, Senter for klinisk og translasjonell Science (CCTS) og Rådet for Center Directors (COCD) translasjonell forskning utført Pilot Grant program (tilskudd nummer 5UL1 RR025777-04) fra NIH Nasjonalt Senter for Forskningsressurser og utviklingsstøtte fra Comprehensive Cancer Center og Institutt for Radiation Oncology ved University of Alabama i Birmingham School of Medicine (til ESY). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) spiller en viktig rolle i kreftutvikling ved å modulere spredning, differensiering, og DNA-skade svar [1] – [5]. Spesielt overekspresjon og forsterkning av EGFR er tilstede i 80-100% av plateepitelkarsinom i hode og hals, og bebuder dårlig prognose, dårligere overlevelse, radioresistance, og behandlingssvikt [3], [6]. Dermed EGFR har blitt tungt målrettet som en kreft terapeutisk strategi, og dette har forbedret responsrate, lokoregionalt kontroll og total overlevelse i kombinasjon med strålebehandling i hode og hals kreftpasienter [2], [7]. Imidlertid vil nesten halvparten av hode- og nakkekreftpasienter som behandles med denne strategien fortsatt gi etter for denne sykdommen. Nye strategier er derfor nødvendig for å forbedre resultatene.
Agenter som er målrettet mot kreft som er mangelfull i homolog rekombinasjon (HR) -mediert DNA dobbel tråd pause (DSB) reparasjon, slik som poly (ADP-ribose) polymerase (PARP ) hemmere (PARPi), har fått ny oppmerksomhet på grunn av sin svært selektiv avliving av BRCA-forbundet, DNA reparasjon defekte svulster og samtidig opprettholde minimal toksisitet i normalt vev [8] – [10]. I tillegg PARPi er blitt rapportert å øke cytotoksisiteten i sporadiske tumorer når den kombineres med andre DNA-ødeleggende midler, så som sammen med platina og cyklofosfamid i brystkreft og med temozolomid i glioblastom [11]. Dermed har mye arbeid blitt gjennomført for å utvide nytten av PARPi utenfor riket av BRCA-assosiert svulster ved å kombinere med agenter som endrer DNA-skader /reparasjon veier.
Vi og andre har tidligere rapportert at rettet mot EGFR pathway induserer et DSB reparasjon mangel [4], [12] – [15]. Basert på disse observasjonene, hypotese vi at cetuximab (C225), en potent hemmer av EGFR, vil kunne øke svulst mottakelighet for PARPi. I denne studien, og i tråd med vår hypotese, viser vi at C225 forsterker cytotoksisitet med PARPi ABT-888 i UM-SCC1, UM-SCC6, og Fadu hode- og nakkekreftceller ved å styrke den indre apoptotiske sti. Ytterligere disseksjon av mekanismen for indusert celledød viser at C225 reduserer ikke-homolog ende sammenføyning (NHEJ) – og HR-mediert DNA DSB reparasjon, noe som resulterer i vedvarende DNA-skade etter PARPi. Ved å generere et DSB reparasjon mangel, kan C225 gjengi hode og hals kreftceller utsatt for PARP hemming. Dermed kan kombinasjonen av C225 og PARPi ABT-888 være en innovativ behandling strategi for å potensielt forbedre resultatene i hode og nakkekreftpasienter. Videre kan denne strategien også være mulig i andre EGFR-dysregulerte tumorer, slik som hjernen og lungene.
Resultater
Cetuximab forbedrer cytotoksisitet med PARPi
Vi har tidligere vist at C225, anti-EGFR-monoklonale antistoffer, hemmer effektivt reseptor aktivitet ved blokkering av ligand bindingssetet [16]. Effekten av C225 på cellenes levedyktighet og vekst er også blitt godt undersøkt [17]. Studier har vist at EGFR kan gi økt motstand mot DNA-skader ved å styrke celle DSB reparasjon kapasitet. Omvendt kan inhibering av EGFR hemme DSB reparasjon. Basert på disse observasjonene, hypotese vi at C225 kan forbedre cytotoksisitet med PARPi ABT-888 i UM-SCC1, UM-SCC6, og Fadu celler, som er godt karakterisert, EGFR overekspresjon, representant plateepitelkarsinom i hode og hals [17 ] – [20]
For å teste denne hypotesen, hode og nakke kreft celle levedyktighet følgende C225 og ABT-888 ble undersøkt ved hjelp av ATPlite analysen.. Dosene av C225 og ABT-888 er valgt er tidligere blitt rapportert å være innenfor fysiologiske området [2], [7], [9], [21]. Som vist på fig. 1A, differensial mottakelighet for C225 og ABT-888 ble observert i alle cellelinjene som ble undersøkt (50 til 75% reduksjon i celleviabilitet med kombinasjonsbehandling), hvilket antyder at C225 faktisk øker celledød med ABT-888. Overraskende, UM-SCC1 celler ble også utsatt for PARPi alene (ca. 75% reduksjon i celle levedyktighet med 10 mm ABT-888).
(A) Kombinasjons C225 og ABT-888 reduserer levedyktigheten til UM-SCC1 UM-SCC6, og Fadu hode og nakke kreft celler. Celler ble behandlet med enten bærer eller 2,5 ug /ml C225 i 16 timer og deretter utsatt for kjøretøy eller 10 uM ABT-888. Tjuefire timer etter ABT-888, ble cellelevedyktigheten analysert med ATPlite system (Perkin Eimer). Vist er de representative data for minst 3 uavhengige eksperimenter av cellelevedyktigheten etter forskjellige behandlinger som målt ved relative ATP-nivåer (gjennomsnitt +/- SEM, * p 0,01, ** p 0,001 sammenlignet med bærerkontroll). (B-D) Kombinasjon C225 og ABT-888 reduserer kolonidannende evne (B) UM-SCC1, (C) UM-SCC6, og (D) Fadu hode og nakke kreft celler. Celler ble behandlet med enten bærer eller 2,5 ug /ml C225 i 16 timer. Etter behandlingsperioden ble cellene sådd ut for kolonidannelse analyser og utsatt for forskjellige doser av ABT-888. Vist er det bety overlevelse fraksjonen (+/- SEM) fra minst 3 uavhengige kolonidannelse analyseforsøk etter behandling (** p 0,001).
For å bekrefte disse funnene, vi også utført kolonidannende forsøk i nærvær av C225 i kombinasjon med forskjellige doser (1-20 uM) av ABT-888. I samsvar med celleviabilitet data, tilsetning av C225 til ABT-888 signifikant reduksjon i kolonidannende evne UM-SCC1, UM-SCC6, og Fadu-celler på en doseavhengig måte (fig. 1B-D). Interessant, UM-SCC1 cellene var igjen spesielt utsatt for ABT-888 alene. Disse resultatene indikerer at hemming av EGFR med C225 kan gjengi cellene mer mottakelige for PARPi ABT-888.
Forbedret cytotoksisitet med cetuximab og ABT-888 innebærer aktivering av indre vei av apoptose
Å belyse mekanismen som C225 og ABT-888 induserer cellulær cytotoksisitet, vi først undersøkt aktivering av cellulær apoptose, ettersom PARPi-mediert cytotoksisitet har vist seg å innebære den apoptotiske reaksjonsvei [8]. Vi vurderte cellular annexin V positivitet, en tidlig indikator på apoptose induksjon. Som vist på fig. 2A og 2B, aktivering av apoptose var signifikant større i begge UM-SCC6 og Fadu celler med C225 og ABT-888 sammenlignet med hvert middel alene. Aktivering av apoptotiske reaksjonsveier fører til slutt til spalting av kaspase 3, som i sin tur initierer en kaskade av proteolyse av integrerte cellulære proteiner og resulterer i programmert celledød. For å bekrefte at C225 og ABT-888 indusere apoptose i hode og nakke kreft celler, vi vurdert nivåene av total og kløyvet caspase 3. Som vist i fig. 2C, økt spaltet caspase 3 med en samtidig reduksjon av total eller uspaltede kaspase 3 ble observert i Fadu celler etter 2,5 ug /mL C225 og 10 uM ABT-888. I samsvar med tidligere rapporter, C225 alene induserte apoptose i behandlede celler [17], [22]. Det ble observert en tilsvarende økning i caspase 3 cleavage følgende C225 og ABT-888 i UM-SCC6 (Fig. 2D).
(A-B)% av apoptotiske celler følgende kombinasjon cetuximab (C225) og ABT-888 behandling i (A) Fadu og (B) UM-SCC6 celler. Celler ble behandlet med enten bærer eller 5 pg /mL C225 i 16 timer og deretter utsatt for 10 uM ABT-888 i 24 timer. Etter behandling ble cellene deretter farget og behandlet for Annexin V som en markør for apoptose. Vist er det% av Annexin V positive celler (gjennomsnitt +/- SEM, * p 0,01, ** p 0,001 sammenlignet med kjøretøy kontroll). Av notatet, kombinasjon av C225 + PARPi var statistisk forskjellig fra begge substansene alene (* p 0,01) (C-D) C225 og ABT-888 økt apoptose i (C) Fadu og (D) UM-SCC6 celler som gjenspeiles av cleavage av caspase 3. (E-F) C225 og ABT-888 aktiveres den indre apoptotiske reaksjonsvei i (E) Fadu og (F) UM-SCC6 celler som vist ved spaltning av caspase 9. cellene ble utsatt for enten bærer eller 2,5 ug /ml C225 i 16 timer og deretter underkastet ABT-888. 6 og 24 timer etter behandlingsperioden, ble cellelysater høstet, og nivåene av total og spaltet caspase 3 (24 timer) og 9 (6 timer) ble påvist ved Western blot-analyse. En dramatisk samtidig reduksjon i total caspase ble også observert. Aktin ble anvendt som en kontroll lasting. Vist er en representant Western blot av minst 3 uavhengige eksperimenter.
Det er to viktige cellulære apoptotiske prosesser, som består av de indre og ytre trasé [23]. Den ytre vei aktiveres ved proapoptotiske ligand-mediert stimulering av cellulære død reseptorer og, i sin tur, spalting av caspase 8. I motsetning til dette er den indre vei utløst av spenningssignaler fra inne i cellen, noe som til slutt resulterer i spalting av caspase 9.
Vi antok at PARPi-indusert apoptose er på grunn av intracellulære spenningssignaler fra DNA-skade som fører til aktivering av den indre apoptotiske reaksjonsvei. I samsvar med denne hypotesen, C225 og ABT-888 utløses spalting av caspase 9 i Fadu (Fig. 2E) og UM-SCC6 (Fig. 2F). Disse data støtter aktivering av indre apoptotiske sti å følge C225 og ABT-888 behandling.
Cetuximab hemmer homolog rekombinasjon og ikke-homologe end-sammenføyning reparasjon
Den nevnte data støtter at C225 forbedrer cytotoksisitet med ABT-888 og aktiverer indre vei av apoptose. Fordi letalitet med PARPi har blitt rapportert å være avhengig av defekte DSB-reparasjonsbaner [8], [10], og fordi EGFR har tidligere vært vist å endre DNA-skade /respons-trasé, vi neste hypotese at den forbedrede cytotoksisitet med C225 og ABT -888 skyldtes C225 endring av DSB reparasjon [13].
Det er 2 store DSB reparere veier, HR- og NHEJ-mediert reparasjon [24]. HR er et high fidelity mekanisme for reparasjon og er den foretrukne vei når en homolog er til stede i G2 og S-fasen. Flere proteiner, inkludert BRCA1, BRCA2, og Rad51, er involvert i denne intrikate prosessen. I kontrast er NHEJ ansett som en feil utsatt system fordi det må være strukturelt variert for å imøtekomme mange forskjellige underlag. Det oppstår fortrinnsvis når en homolog er fraværende, utenom G2 og S-fasen. NHEJ er avhengig av DNA-avhengig protein kinase (DNA-PK) katalytisk subenhet, den Ku70 /80 heterodimer, og XRCC4-ligase IV kompleks.
For å teste om forbedret cytotoksisitet av C225 og PARPi innebærer C225-mediert hemming av DSB reparasjon, vurderte vi effekten av C225 på HR- og NHEJ-mediert DSB reparasjon indusert etter γ-stråling (IR), en potent aktivator av DNA DSB reparasjon. For å vurdere virkningene av C225 på HR-mediert reparasjon, analyserte vi kinetikken av IR-indusert Rad51 brennpunkter, godt etablerte markører for HR reparasjon, på ulike tidspunkter følgende 4 Gy IR. Som vist på fig. 3, økte IR prosentandelen av celler med Rad51 foci, med en topp ved 4-8 timer etter IR. I samsvar med vår hypotese, C225 dempes HR med mer enn 50% i bestrålt UM-SCC1 (Fig. 3A), UM-SCC6 (Fig. 3B), og Fadu (fig. 3C) hode og nakke kreft celler. Resultatene viste at C225 induserer en HR underskudd, og mobil mottakelighet for PARPi følgende C225 var i samsvar med PARP hemming rettet mot celler som er mangelfull i HR-mediert reparasjon.
C225 demper IR-indusert Rad51 brennpunkter, godt karakterisert markører for homolog rekombinasjon (HR) -mediert DNA DSB reparasjon i (A) UM-SCC1, (B) UM-SCC6, og (C) Fadu celler. Celler ble behandlet med bærer, 2,5 ug /mL C225, eller 5,0 ug /ml C225 i 16 timer og deretter underkastet håne eller 4 Gy bestråling (IR). På de angitte tidspunkter følgende IR, ble cellene behandlet for immunofluorescens farging for Rad51 foci. Vist er de representative data for 3 uavhengige eksperimenter% av celler (gjennomsnitt +/- SEM) med 10 foci (* p 0,05, ** p 0,01 i forhold til kjøretøyet ved hver respektive tidspunkt). Det innfelte i (A) er et representativt bilde av UM-SCC1 celler stiller Rad51 foci følgende IR.
PARP hemmet celler har også blitt rapportert å være utsatt for hemmere av DNA-PK, en kritisk spiller i NHEJ [25]. Dette tyder på at NHEJ kan være et alternativ DSB reparasjon veien foruten HR å gi resistens mot PARPi. I tillegg EGFR har blitt rapportert å interagere og translocate med DNA-Pk til kjernen for å aktivere NHEJ reparasjonsprosesser [13], [26], [27]. Det er derfor mulig at C225-mediert cellulær mottakelighet for PARPi er også grunn til C225 endring av NHEJ veien.
For å analysere virkningene av C225 på NHEJ, vurdert vi kinetikken av fosfor-Threonine 2609 (Thr2609) DNA-PK brennpunkter, godt etablerte markører for IR-fremkalt NHEJ-mediert reparasjon [28], [29], ved forskjellige tidspunkter etter 4 Gy IR. Som forventet, IR betydelig økt antall celler med fosfo-Thr2609-DNA-PK-foci ved både 30 minutter og 1 time etter IR i UM-SCC1 (fig. 4A), UM-SCC6 (Fig. 4B), og Fadu (fig. 4C). Interessant, tillegg av C225 betydelig svekket dette svaret med mer enn 30% i alle cellelinjene som ble undersøkt.
C225 demper stråling (IR) -indusert DNA-Pk Thr2609 brennpunkter, godt etablerte markører for ikke-homolog ende begynte (NHEJ) -mediert DNA DSB reparasjon i (A) UM-SCC1, (B) UM-SCC6, og (C) Fadu hode og nakke kreft celler. Celler ble behandlet med bærer, 2,5 ug /mL C225, eller 5,0 ug /ml C225 i 16 timer og deretter underkastet håne eller 4 Gy IR. På den angitte tid etter IR ble cellene behandlet for immunfluorescens farging for DNA-Pk Thr2609 foci. Vist er de representative data for 3 uavhengige eksperimenter% av celler (gjennomsnitt +/- SEM) med 10 foci (* p 0,05, ** p 0,01 sammenlignet med celler som ikke er utsatt for C225). (D) C225 reduserer fosfor-Thr2609 DNA-PK nivåer i UM-SCC6 hode og nakke kreft celler. Celler ble behandlet med bærer eller 2,5 ug /ml C225 i 16 timer og deretter underkastet håne eller 4 Gy IR. En time etter IR, ble cellene behandlet for Western blot-analyse for fosfo-Thr2609 DNA Pk nivåer. Total DNA Pk ble også analysert, og tubulin ble anvendt som kontroll lasting.
EGFR har også blitt vist å fosforylere og aktivere DNA-PK [13], [26], [27]. For å avgjøre om hemming av NHEJ av C225 skyldes redusert fosforylering av DNA-PK, vi neste undersøkt nivåer av fosfor-DNA-Pk Følgende C225. Som vist på fig. 4D, C225 redusert DNA-Pk fosforylering uten å endre total DNA-Pk i UM-SCC1, UM-SCC6, og Fadu celler, som er konsistent med C225-mediert hemming av NHEJ-mediert reparasjon.
Til sammen disse dataene indikerer at C225 induserer en DSB reparasjon mangel av de 2 store DSB reparasjon pathways, NHEJ og HR, og forbedret cytotoksisitet av C225 med PARPi skyldes hemming av både store DSB reparere veier.
EGFR hemming øker DNA skade
C225 induserer en DSB reparasjon mangel i hode og nakke kreft celler (fig. 3 og 4). Vi antok at C225-behandlede cellene skal få økte markører for DNA DSB sin. For å vurdere DNA DSB sin, undersøkte vi effekten av C225 på γ-H2AX brennpunkter, noe som er godt dokumentert markører for DNA DSB sin [30], i UM-SCC1, UM-SCC6, og Fadu cellelinjer. Som vist på fig. 5A, alle cellelinjer viste signifikant øket DNA-skade følgende C225 som demonstrert ved økt andel av celler med γ-H2AX foci i en doseavhengig måte. Dette ble bekreftet via Western blot analyse, som avslørte økt y-H2AX nivåer etter ulike doser av C225 i UM-SCC1, UM-SCC6, og Fadu celler (fig. 3B). Disse resultatene indikerer at inhibering av EGFR med C225 øker DNA DSB skader i behandlede celler, noe som er konsistent med C225-indusert hemming av DSB reparasjon.
(A) C225 øker antall celler med DSB som vist ved γ -H2AX foci, et vanlig markør for DSB sin. Vist er de representative data for 3 uavhengige eksperimenter% av celler (gjennomsnitt +/- SEM) med 10 foci (* p 0,05, ** p 0,01 sammenlignet med bærerkontroll). (B) C225 øker y-H2AX proteinnivåer i behandlede celler. UM-SCC1, UM-SCC6, og Fadu cellene behandlet med bærer, 2,5 ug /mL C225, eller 5,0 ug /ml C225 i 16 timer. Etter behandlingsperioden ble cellene behandlet for (A) immunofluorescens farging for γ-H2AX foci eller (B) Western blot-analyse for γ-H2AX nivåer. Vist er representant Western blot av 3 uavhengige eksperimenter.
Kombinasjons cetuximab og ABT-888 genererer vedvarende DNA-skader
PARPi hemmer basen excision reparasjon pathway ansvarlig for oppløsning av DNA enkelt trådbrudd (SSBs). SSBs som vedvarer i dele celler blir til slutt konvertert til DSB sin og repareres av HR-mediert reparasjon. Gitt at C225 reduserer DSB reparasjon kapasitet og at C225 forbedrer cytotoksisitet med ABT-888, vi hypotese at kombinasjonen C225 og ABT-888 vil resultere i ytterligere vedvarende DNA DSB skade. For å vurdere dette, vi utførte et tidsforløp analyse av γ-H2AX foci med kjøretøy, C225 alene, ABT-888 alene, eller kombinasjon C225 og ABT-888. Som vist på fig. 6, sammenlignet med kjøretøy kontroll, C225 alene som forventet indusert 2-3 brett% av celler med økt DNA-skader i UM-SCC1 (Fig. 6A), UM-SCC6 (Fig. 6B), og Fadu (Fig. 6C) hode- og nakkekreftceller. Interessant, kombinasjonen av C225 og ABT-888 resulterte i et betydelig større antall celler med vedvarende DNA-skade i alle cellelinjene som ble undersøkt (fig. 6). Videre er UM-SCC1 celler (fig. 6A), som viste utsøkt følsomhet for ABT-888 alene, hadde også vedvarende DNA skade med ABT-888 alene. I motsetning til dette, i UM-SCC6 (Fig. 6B) og Fadu (Fig. 6C) celler, ABT-888 alene resulterte ikke i signifikant økning i celler med DNA DSB tydelig skade. Disse resultater viser at cytotoksisitet fra C225 og PARPi kan være på grunn av den manglende evne av behandlede celler for å løse DNA DSB, den mest kritiske lesjon i celler.
(A-C) DNA-skade 2, 24 og 48 timer følgende kjøretøy, ble C225, PARPi, eller begge deler C225 + PARPi bedømt ved γ-H2AX foci i (A) UM-SCC1, (B) UM-SCC6, og (C) Fadu celler. Celler ble behandlet med bærer eller forskjellige doser av C225 i 16 timer og deretter utsatt for kjøretøy eller forskjellige doser av ABT-888. På de angitte tidspunkter følgende PARP-inhibering, ble cellene behandlet for immunofluorescens farging for γ-H2AX foci. Vist er de representative data for 3 uavhengige eksperimenter% av celler (gjennomsnitt +/- SEM) med 10 foci (* P 0,05, ** P 0,01, sammenlignet med bærerkontroll ved hver respektive tidspunkt).
Effekter av cetuximab og ABT-888 på DNA skade og reparasjon er ikke på grunn av cellesyklus omfordelings
DNA reparasjon veier, spesielt HR, kan være avhengig av cellesyklusen. I tillegg er EGFR involvert i celle spredningsveier, og inhibering av EGFR har vist seg å indusere cellesyklus omfordeling [4], [31], [32]. Det er mulig at inhibering av HR ved C225 kan være en indirekte effekt av økt cellulær akkumulering i G1 fasen av cellesyklusen. Vi undersøkte derfor cellesyklusfordelingen av celler behandlet med bærer eller C225 for å utelukke cellesyklus effekter som en potensiell confounder ved hvilken C225 endrer DNA DSB reparasjon. Som vist på fig. 7, er det et fravær av en hvilken som helst cellesyklus omfordeling etter behandling i UM-SCC1 (Fig. 7A) eller UM-SCC6 (fig. 7B) for å gjøre rede for C225-formidlet reduksjon av DSB reparasjon på de tidspunkter ved hvilke HR reparasjon var målt.
Cellesyklus syklus~~POS=HEADCOMP distribusjon av (A) UM-SCC1 eller (B) UM-SCC6 celler etter behandling med bil eller C225. (C) Cellesyklus distribusjon av UM-SCC1 celler etter bilen, C225, ABT-888, eller kombinasjon C225 og ABT-888. Celler ble behandlet med bærer eller forskjellige doser av C225 i 16 timer og deretter utsatt for kjøretøy eller 5 uM av ABT-888. Førtiåtte timer etter PARP-inhibering, ble cellene behandlet for cellesyklusanalyse ved strømningscytometri. Vist er den representative cellesyklusfordeling (gjennomsnitt +/- SEM) på minst 2 uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer.
ABT-888 er også blitt rapportert å forårsake begynnende alderdom når den kombineres med stråling i brystkreft celler [33]. I tillegg kan andre PARPi indusere G2 /M akkumulering av celler [34]. Således, for å vurdere cellesyklus endres når en annen potensiell mekanisme for økt cytotoksisitet, cellesyklusfordeling følgende kombinasjon C225 og ABT-888 ble utført i UM-SCC1 celler. Som vist på fig. 7C, ingen cellesyklus omfordeling ble observert. Resultatene viste at C225-indusert demping av DSB reparere veier og den påfølgende økt cytotoksisitet med ABT-888 var ikke på grunn av cellesykluseffekter.
Diskusjoner
I denne studien, vi viser at C225 , en hemmer av EGFR, forsterker mobilnettet mottakelighet for PARPi ABT-888 i hode og nakke kreft celler. Mekanismen for forsterket cytotoksisitet involvert C225-mediert dempning av de to store DNA DSB-reparasjonsbaner, NHEJ og HR, noe som fører til utholdenhet av DNA-skade etter PARPi og den påfølgende aktivering av den intrinsiske reaksjonsvei av apoptose. Dermed kan kombinasjonen av C225 og PARPi ABT-888 være en innovativ behandling strategi for å potensielt forbedre resultatene i hode og nakkekreftpasienter. Denne kombinasjonen av C225 og ABT-888 kan være spesielt spennende for regimer som inkluderer andre DNA-ødeleggende midler, for eksempel stråling.
EGFR har vært implisert i en rekke cellulære prosesser, inkludert celle proliferasjon og overlevelse, angiogenese, og DNA skade respons og reparasjon. Nærmere bestemt, med hensyn til DNA-skade reaksjon, EGFR har vist seg å translocate til kjernen og samhandle med DNA-PK for å aktivere NHEJ [13], [26], [27]. Aktivert EGFR kan også øke Rad51 foci og uttrykk nivåer for å regulere HR [35]. Disse handlingene av EGFR har blitt tilskrevet motstand av EGFR forsterket /muterte tumorer til DNA-ødeleggende midler og gi begrunnelse for målrettet hemming av EGFR.
Til støtte for en rolle av EGFR i DNA skade og reparasjon pathways, C225 , som hemmer EGFR, demper de to store DNA DSB reparasjon pathways, HR og NHEJ, ved å endre Rad51 og DNA-Pk foci nivåer, henholdsvis. C225 også hemmet DNA-Pk fosforylering. Som PARPi har vist seg å målrette HR-manglende celler, handlingene til C225 på HR-mediert reparasjon gi begrunnelse for hvorfor den nye kombinasjonen av C225 og PARPi forbedrer cytotoksisitet i hode- og nakkekreftceller [8], [9]. I tillegg har PARP-inhiberte celler er vist å bli sensibilisert for inhibitorer av NHEJ veien, noe som tyder på at NHEJ kan også være en backup vei av uløste SSBs [25]. Dette kan også forklare den dramatiske cytotoksisitet observert i C225 og PARPi behandlede celler. Videre, som C225 induserer både en NHEJ og HR reparasjon mangel, kombinasjonen av C225 med PARPi fører til en høy andel av behandlede celler med vedvarende DSB sin. Gitt disse observasjonene, må cellene utsettes for C225 og PARPi være utsøkt utsatt for andre DNA-ødeleggende midler, slik som stråling. Dette er et område med aktiv etterforskning i vårt laboratorium.
C225 og PARPi også forbedret apoptose, som er konsistent med tidligere rapporter om PARPi-mediert cytotoksisitet [8]. Vi fant at dette apoptose var et resultat av aktivering av den intrinsiske reaksjonsvei. Det er verdt å merke seg at omfanget av reguleringen av apoptose ikke når nivåene av cytotoksisitet målt ved kolonidannelse analyser. andre enn apoptose flere reaksjonsveier kan påvirke de kolonidannende evner av celler, så som hemning av celleproliferasjon, cellesyklus-stans, mitotisk katastrofe, og autophagy. Dette avviket kan også forklares med den oppfatningen at i motsetning til analyser av foci eller immunoblotting, som viser effekten ved en parameterdataene i tid, reflekterer kolonidannelsesbestemmelsen flere mekanismer for celledød i løpet av en periode på 3 uker. Som flere signalbaner som er involvert i regulering og bestemmelse av skjebnen til celledød eller overlevelse, tyder våre data på at inhibering av EGFR kan være en del av den kompliserte cellesignalisering /DNA-skade reparasjon nettverk, og kan bidra bare delvis til den samlede effekten celle mottakelighet for DNA-skader. Det er således sannsynlig at PARPi og EGFR-inhibering kan regulere flere cytotoksiske veier. For eksempel ABT-888 i kombinasjon med stråling har også blitt vist å indusere autophagic celledød i lungekreftceller [36]. Dermed andre mekanismer for celledød, inkludert autofagi, kan ikke utelukkes.
Siden PARP er et SSB DNA-reparasjon enzym, er behandling med PARPi ABT-888 forventes å hemme SSB reparasjon og dermed øke basalnivåer SSBs. Tilsetning av C225 resulterer i ytterligere DNA-skade. Den økte DNA-skader observert ved lengre tidspoeng kan skyldes vedvarende DSB sin eller et resultat av ytterligere DNA-kutt som følge av konvertering av SSBs til DSB sin under forsøk på DNA-reparasjon eller kollapset replikering gafler. Dette støttes av den økte% av celler med γ-H2AX foci ved senere tidspunkter. Alternativt aktivering av celledød prosesser som apoptose kan også indusere markører for DNA-skade.
Interessant, UM-SCC1 hode- og nakkekreftceller vise mottakelighet for PARPi alene. Disse cellene er ikke iboende DSB reparere mangelfull, som vurderes av IR-indusert Rad51 og DNA-Pk foci. Men PARPi alene induserer vedvarende γ-H2AX foci, tyder på tilstedeværelsen av vedvarende DSB sin. Det er spennende å postulere at andre molekylære faktorer som bestemmer PARPi mottakelighet uavhengig av iboende DNA reparasjon defekter må eksistere. En av flere muligheter er det nylig rapportert økt belegg av undertrykkende E2F4 /P130 komplekser av BRCA1 og RAD51 arrangører i nærvær av PARPi, og dermed øke celle mottakelighet for oksidativ skade ved å undertrykke de backup DSB reparere veier [37].
i de siste årene, sammenhengen mellom humant papilloma virus (HPV) og hode- og halskreft har blitt befestet [38], [39]. Interessant, HPV assosiert hode og nakke kreft viser en bedre prognose og ser ut til å svare bedre på chemoradiation [40]. Det er postulert at dette er på grunn av HPV-oncoproteiner og endring av DNA-skade /respons-trasé [41], [42]. Interessant nok har E7 uttrykk vist seg å forstyrre E2F4 og p130 undertrykkende aktivitet og hindret PARPi-mediert nedregulering av BRCA1 og Rad51 [37]. Imidlertid kan interaksjon mellom alle HPV-onkogener og den DNA-skade respons resultere i forskjellige mottagelighet for DNA-skade. Dermed vil det være interessant å vurdere i hvilken grad HPV-assosiert svulster til PARPi.
Vår studie viser at hemming av EGFR med C225 forbedrer cytotoksisitet med PARPi ABT-888 i hode og nakke kreft celler via C225- mediert forstyrrelse av HR- og NHEJ-mediert DSB reparere veier. Disse resultatene tilsier fremtidige studier å sammenligne effekt versus tradisjonell kjemoterapi. Enda viktigere, som å opprettholde livskvaliteten har blitt et område på vekt i onkologi, kan bruk av målrettede midler slik som C225 og ABT-888 ytterligere å forbedre terapeutisk forhold. Til slutt, kan denne strategien også være mulig i andre svulster med avvikende EGFR-signalering, for eksempel hjerne og lunge kreft.
Materialer og metoder
Cell kultur
Den menneskelige hode og nakke plateepitel carcinom cellelinjer UM-SCC1 og UM-SCC6 ble innhentet tillatelse fra Dr. Thomas E Carey (University of Michigan, Ann Arbor, MI). De ble holdt i DMEM (GIBCO, Invitrogen) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS, Atlanta Biologicals) og 1% penicillin /streptomycin (Invitrogen). Den menneskelige hode og hals plateepitel carcinom cellelinje Fadu (HTB-43) ble oppnådd fra ATCC (Manassas, VA), og ble opprettholdt i RPMI-1640 (GIBCO, Invitrogen) supplert med 10% FBS. PARP hemmer ABT-888 (Enzo Life Sciences) og cetuximab (C225, Bristol Myers Squibb) ble benyttet i vår studie.
celleviabilitet
Celleviabilitet ble målt ved hjelp av ATP-lite 1 trinn luminescens analysen (Perkin Elmer) etter produsentens anvisninger.
