Abstract
Bakgrunn
ET-743 (trabectedin, Yondelis®) og PM00104 (Zalypsis®) er marine avledet forbindelser som har antitumor aktivitet. ET-743 og PM00104 eksponering over vedvarende perioder med behandling vil føre til utvikling av resistens, men mekanismene som fører til motstand er ennå ikke forstått.
metodikk /hovedfunnene
Menneskelig chondrosarcoma cellelinjer resistent til ET-743 (CS-1 /ER) eller PM00104 (CS-1 /PR) ble etablert i denne studien. CS-1 /ER og CS-1 /PR oppviste kryssresistens mot cisplatin og metotreksat, men ikke for doksorubicin. Menneske Affymetrix Gene Chip matriser ble brukt for å undersøke forhold genekspresjon i disse cellelinjene. Vi har funnet at et stort antall gener som har forandret ekspresjon nivåer i CS-1 /ER og CS-1 /PR i forhold til den parentale cellelinje. 595 CS-1 /ER og 498 CS-1 /PR-gener ble identifisert som overekspresjon; 856 CS-1 /ER og 874 CS-1 /PR-transkripsjoner ble identifisert som underexpressing. Tre sink finger protein (ZNF) gener var på overuttrykte gener listen topp ti. Disse gener er ikke tidligere blitt forbundet med legemiddelresistens i tumorceller. Differensial uttrykk for ZNF93 og ZNF43 gener ble bekreftet i både CS-1 /ER og CS-1 /PR-resistente cellelinjer ved real-time RT-PCR. ZNF93 ble overuttrykt i to ET-743 resistente Ewing sarkom cellelinjer, så vel som i et cisplatin resistent kreft i eggstokkene cellelinje, men ikke ble overuttrykt i paclitaxel-resistente cellelinjer. ZNF93 knockdown av siRNA i CS-1 /ER og CS-1 /PR forårsaket økt følsomhet for ET-743, PM00104, og cisplatin. Videre ZNF93 transfektert CS-1 celler er relativt motstandsdyktig mot ET-743, PM00104 og cisplatin.
Konklusjon /Betydning
Denne studien tyder på at sink finger proteiner og ZNF93 i særdeleshet, er involvert resistens mot eT-743 og PM00104
Citation. Duan Z, Choy E, Harmon D, Yang C, Ryu K, Schwab J et al. (2009) ZNF93 øker motstanden mot ET-743 (Trabectedin, Yondelis®) og PM00104 (Zalypsis®) i Human Cancer Cell Lines. PLoS ONE 4 (9): e6967. doi: 10,1371 /journal.pone.0006967
Redaktør: Nils Cordes, Dresden teknologiske universitet, Tyskland
mottatt: 02.04.2009; Godkjent: 10 august 2009; Publisert: 09.09.2009
Copyright: © 2009 Duan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette prosjektet ble støttet delvis av et stipend fra PharmaMar. Dr. Duan støttes delvis gjennom et stipend fra Ovarian Cancer Research Foundation (OCRF), og et stipend fra National Cancer Institute, NIH (Nanoteknologi Platform Partnership), R01-CA119617. Dr. Choy er støttet av Jennifer Hunter Yates Foundation. Støtte er også gitt av Gattegno og Wechsler funds.The finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Vi erkjenner også at de 2 ut flere kjemoterapi narkotika brukes i denne studien, ET-743 og PM00104, ble produsert og levert av selskapet, PharmaMar som også delvis finansiert arbeidet
Konkurrerende interesser. Jeg bekrefter at PharmaMar USA, har Inc ingen innflytelse på resultatene og konklusjonene fra denne studien. Jeg erklærer også at resultatene og konklusjonene ikke ble påvirket av en bevilgning fra PharmaMar USA, Inc. Selv om denne studien ble støttet delvis av en bevilgning fra PharmaMar ikke dette endre vår tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer med andre forskere. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Vi erkjenner også at de 2 ut flere kjemoterapi narkotika brukes i denne studien, ET-743 og PM00104, ble produsert og levert av selskapet, PharmaMar som også delvis finansiert arbeidet.
Innledning
ET-743 (Yondelis®; Trabectedin) er marine alkaloid derivat isolert fra det karibiske hav sprute
Ecteinascidia turbinate product: [1], [2]. ET-743 har et bredt spekter av aktivitet i tumorcellelinjer ved pM og lave nM konsentrasjoner, og det har også klinisk aktivitet mot eggstokk-kreft, brystkreft, og sarkomer [2], [3]. ET-743 er godkjent av EMEA /EU for pasienter avanserte sarkomer som enten har kommet etter behandling med antracykliner eller ikke er klinisk egnet til å motta konvensjonelle midler [4]. ET-743 er sammensatt av tre tetrahydroisokinolin underenheter inneholdende en sentral carbinolamine enhet gjør det mulig å kovalent binde til DNA. ET-743 binder seg til mindre spor av DNA-helix med sekvens-spesifikk binding preferanse for GC-rik tripletter og deretter danner kovalente addukter med N2-stillingen av guanin. Som et resultat, er den mindre utsatt sporet og vendt mot hovedsporet. Når en slik binding finner sted, DNA-trådene bli tverrbundet og kan ikke bli kopiert, noe som resulterer i celledød [5], [6]. Retningen av DNA vende er et nytt trekk blant DNA minor groove-interaktive midler, og dermed gjør ET-743 unike.
PM00104 (Zalypsis®), avledet fra bløtdyr, er en ny kjemisk enhet relatert til Jorumycin, en marine naturlig forbindelse som tilhører familien av
Renieramycins
, erholdt fra svamper [7], [8]. PM00104 har
in vitro Hotell og
in vivo
anti-tumor aktivitet mot en rekke solide og hematologiske tumorer. Som med ET-743, PM00104 også binder seg til DNA og er cytotoksisk; men i motsetning til ET-743, PM00104 ikke aktivere «DNA skader sjekkpunkt» respons. Dermed cytotoksiske effektene av PM00104, men avhengig av DNA bindende, er ikke utløst av DNA skade respons mekanismer [8].
Som med andre kjemoterapeutiske legemidler, ET-743 og PM00104 eksponering over vedvarende perioder med behandling vil resultere i utvikling av medikamentresistens, men mekanismene er ikke godt forstått. Forskjellige studier har rapportert motstridende beskrivelser av forholdet mellom ABCB1 ekspresjon og ET-743 motstand i humane kreftcellelinjer [9], [10]. I den humane ovarie cellelinje IGROV-1, som er valgt for ET-743 motstand, er ABCB1 overuttrykt [11]. Følsomhet kan gjenopprettes ved tilsetning av Pgp1 inhibitor PSC-833, noe som antyder at ET-743 kan være en Pgp1 substrat. En annen studie er imidlertid observert at to Pgp overuttrykkende humane epidermoid cancer-cellelinjer (KB-8-5 KB-og C-2) var ikke motstandsdyktig overfor ET-743 [9]. Spesielt, kan sub-dødelige konsentrasjoner av ET-743 reversere resistens mot doksorubicin og vincristin i disse cellelinjene. Det er ingen rapporter som beskriver mekanismen av PM00104 motstand i kreftceller.
Chondrosarcomas er en heterogen gruppe svulster mesenchymale opprinnelse som utvikler seg i bein eller brusk og vise chondrocytic egenskaper [12]. Disse svulstene reagerer dårlig på konvensjonelle behandlinger som kjemoterapi og strålebehandling, og prognosen er relatert til tumor klasse og differensiering status. Sensitiviteten av sarkom celler til ET-743 og PM00104 har ført oss og andre til å vurdere disse forbindelsene som interessante kandidater for fremtidig behandling av chondrosarcoma [13], [14], [15]. Men som med andre kjemoterapeutiske midler, tilbøyelighet til tumorceller for å utvikle resistens mot ET-743 eller PM00104 utgjør en vesentlig utfordring for bruk av dette medikament over en lengre tidsperiode. Målet med denne studien er å undersøke mekanismene for ET-743 eller PM00104 motstand i chondrosarcoma
Materiale og metode
Kjemoterapi narkotika
ET-743 (Yondelis®.; trabectedin) og PM00104 (Zalypsis®) ble levert av PharmaMar (Spania). Paclitaxel (Taxol®), doxorubicin (Adriamycin RDF®, EC-nr 2468183), metotreksat (Trexall) og cisplatin (cisplatinaindusert; CDDP) ble innhentet gjennom ubrukte rest klinisk materiale fra apoteket ved Massachusetts General Hospital. Aksjen løsning av legemidler ble utarbeidet i henhold til legemiddel spesifikasjoner og lagret ved -20 ° C.
Chondrosarcoma cellelinje CS-1
Den menneskelige chonodrosarcoma cellelinje, spredte siden 1999 og betegnet CS -1, ble etablert fra en kirurgisk reseksjon menneskelig høy klasse chonodrosarcoma som tidligere ikke var utsatt for cellegift eller strålebehandling, og dyrket i monolaget. I korthet ble vev ble aseptisk oppnås umiddelbart etter reseksjon, plassert i RPMI-1640 vevskultur-medium supplert med 10% føtalt bovint serum og vev dyrket ved 37 ° C inkubator som inneholdt 5% CO2 [13], [14]. Det er rapportert detaljert analyse av CS-1 tidligere [13], [14], [15], [16], [17]. Total RNA ble ekstrahert etter CS-1 ble passert fire ganger.
Etablering av ET-743 eller PM00104 resistente cellelinje
CS-1 /ER og CS-1 /PR-celler resistente mot ET -743 eller PM00104 ble etablert fra den CS-1 modercellelinjen ved eksponering for eT-743 eller PM00104 med trinnvis økning konsentrasjon av eT-743 eller PM00104 i ett år ved bruk av tilsvarende måte som tidligere rapportert [18], [19 ], [20]. I korte trekk, ble kultivert CS-1-celler eksponert for 0,00001 uM enten ET-743 eller PM00104 i 7 dager og deretter vasket og dyrket i medium som inneholdt 0,00003 uM i 7 dager. Hvis CS-1-celler demonstrerte Cytotoksisiteten etter eksponering for en gitt konsentrasjon av ET-743 eller PM00104, ble de vasket og dyrket i medikamentfritt medium i 7 dager. For eksempel, la vi merke til 90% av CS-1-cellene ble drept når cellene ble eksponert for 0,001 uM av ET-743 eller 0,003 uM av PM00104 i 7 dager. Når de levedyktige cellene var gjenopprettet, ble de podet i medium inneholdende det nylig eksponerte konsentrasjon av medikament igjen i 3 dager. Etter gjentatt flere ganger, og når cellene vokste opp til 70% konfluens i dyrkningsmedium inneholdende medisiner, vil konsentrasjonen av legemidler økt til det neste nivå. Etter ett år, ble det ET-743 resistent cellelinje CS-1 /ER og PM00104 resistent cellelinje CS-1 /PR etablert som bestemt ved MTT-analyse. Disse cellene representerer grupper av narkotika resistente celler i stedet for en valgt klonet befolkning. CS-1 /ER kan vokse i konsentrasjoner på 0,005 uM ET-743 og CS-1 /PR kan vokse opp i konsentrasjon på 0,01 uM PM00104.
Annen legemiddelresistent cellelinje anvendt i denne studien
menneske~~POS=TRUNC eggstokk-kreft cellelinjene SKOV-3 og A2780 og en human brystcancer-cellelinjen MCF-7 ble innkjøpt fra American Type Tissue Collection (Rockville, MD). De paclitaxel-resistente SKOV-3
TR, MCF-7
TR og cisplatin-resistente A2780cp cellelinjer ble etablert som tidligere rapportert [19], [20]. Dr. Katia. Scotlandi (Institute ortopedi Rizzoli, Italia) forut Ewing sarkom ET-743 resistente cellelinje TC-ET [21].
Tissue kultur
Alle cellelinjene ble dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) tilsatt 10% føtalt bovint serum, 100-enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen). Celler ble inkubert ved 37 ° C i 5% CO
2-95% luftatmosfære, og passert når nær konfluente monolag ble oppnådd ved anvendelse av trypsin-EDTA-oppløsning. Medikamentresistente cellelinjer ble dyrket med jevne mellomrom i de respektive medikament for å bekrefte deres medikamentresistensegenskaper. Cellene var gratis på mycoplasma forurensning som testet av MycoAlert (R) Mycoplasma Detection Kit fra Cambrex (Rockland, Maine).
Cvtotoksisitetsmålinq
Drug cytotoksisitet ble undersøkt in vitro ved hjelp av MTT-analysen som tidligere beskrevet [22]. I korthet, 2 x 10
3-celler per brønn ble sådd ut i 96-brønns plater i dyrkningsmedium (RPMI 1640 supplert med 10% føtalt bovint serum og penicillin /streptomycin) inneholdende økende konsentrasjoner av medikament. Etter 7 dagers dyrking, 10 ul MTT (5 mg /ml i PBS, oppnådd fra Sigma) ble tilsatt til hver brønn og platene ble inkubert i 4 timer. Det resulterende formazanprodukt ble oppløst med syre-isopropanol og absorbansen ved en bølgelengde på 490 nm (A
490) ble avlest på en Microplate SPECTRAmax® spektrofotometer (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Absorbans-verdiene ble normalisert ved å tildele verdien av styreledningen i det medium uten medikament til 1,0 og verdien av den ikke cellestyringen til 0. Eksperimenter ble utført in triplo.
RNA-ekstraksjon
Total RNA ble samlet inn fra CS-1 (foreldrecellelinje med passert 4 ganger), CS-1 /eR og CS-1 /PR (resistente datter cellelinjer med dyrket i ett år) bruker TRIzol® Reagens (GIBCO, Grand Island , NY) i henhold til produsentens instruksjoner. Å gjøre rede for og eliminere biologisk støy, ble RNA isolert fra tre forskjellige kolber av hver cellelinje. Disse biologiske replikater ble slått sammen. RNA kvalitet ble bestemt
via
etidiumbromidfarging følgende agarose /formaldehyd gelelektroforese.
Gene transkripsjonen profilering
Total RNA ble behandlet og hybridisert til Affymetrix Gene Chip U133 Plus 2,0 arrays (Santa Clara, California) av Gene Array Technology Center ved Harvard Medical School (https://genome.med.harvard.edu). Affymetrix Gene Chip U133 Plus 2.0 i den første og mest omfattende hele menneskets genom uttrykk array. Denne rekken full dekning av hele menneske Genome med over 47 000 utskrifter. Hver sonde består av 20 separate 23-mer oligonukleotider. Ekspresjonsnivået av hvert mRNA ble kvantifisert ved å måle dens hybridisering til disse 23-merer i forhold til dens hybridisering til en en-base-mistilpasning oligonukleotid.
Dataanalyse
GeneSifter ble brukt til å analysere microarray data (https://www.genesifter.net/web/). GeneSifter gir kraftige analytiske algoritmer (RMA, PAM, ANOVA, Clara, Benjamini-Hochberg, etc.) gjennom et intuitivt webgrensesnitt. GeneSifter kan identifisere differensielt uttrykte gener og klyngeanalyse for å identifisere mønstre av genekspresjon og segregerende gener basert på disse mønstrene. Fold endring i uttrykket mellom følsomme og resistente cellelinjer ble evaluert med Mann-Whitney test. En tidobbelt eller større endring i intensitet i kombinasjon med en Mann-Whitney tilhørende P-verdi på mindre enn 0,05 ble brukt som kriterium for inkludering i filtrerte datasettet. Intensitet informasjonen ble eksportert til Microsoft Excel ved behov.
TaqMan revers transkripsjon-PCR for kvantifisering av forskjellig uttrykt gen
Real-time RT-PCR ble utført for å validere differensielt uttrykte gener. For genekspresjon deteksjon, ble cDNA revers transkripsjon utføres fra total RNA prøver å bruke spesifikke oligo dT primere fra Taq Man RNA analyser og reagenser fra TaqMan RNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Den resulterende cDNA ble forsterket ved PCR ved bruk av Taq-Man sink finger protein 93 (ZNF93), ZNF43 og Thada genet analyse primere med Taq Man Universal PCR Master Mix og analysert med en StepOnePlus Real time PCR System i henhold til produsentens instruksjoner (Applied Biosystems) . GAPDH og aktin ble benyttet som en kontroll. De relative nivåer av genekspresjon ble beregnet ut fra de aktuelle signalene ved normalisering med signalet for GAPDH eller actin uttrykk. PCR-reaksjonsblandinger inneholdt Taq-Man human ZNF93, eller ZNF43 og Thada og Universal Master Mix PCR i et totalt volum på 20 AL. Sykling variabler var som følger: 95 ° C i 10 minutter etterfulgt av 40 sykluser ved 95 ° C (15 s) og gløding /forlengelse ved 60 ° C (1 min). Alle reaksjoner ble utført i tre eksemplarer
ZNF93 siRNA analysen
For ZNF93 (GenBank tilgangsnummer: NM_031218). Interferens, sanse ZNF93 oligo (5′-CCUCUACCCUUAGUUCACAtt-3 «) og antisense ZNF93 oligo ( 5»-UGUGAACUAAGGGUAGAGGag-3 «) ble kjøpt fra Applied Biosystems og ble anvendt i henhold til produsentens instruksjoner. For validering av ZNF93 RNAi spesifisitet ble siGenome SMARTpool menneske ZNF93 sirnas kjøpt fra Dharmacon (Chicago, IL) med følgende fire mål sekvenser av ZNF93 genet. Målsekvens 1: 5»-GGACUUAACCAGUGUAGUA-3 «; målsekvensen 2: 5»-AACCAAUCCUCGACACUUA-3 «, målsekvens 3: 5′-GCCCUACGUUUGUGAAGAA-3′ og målsekvensen 4: 5»-CCUUAUAGAUGUAGAGAAU-3 «. For transfeksjon, ble cellene enten utplatet på 96-brønns plater for MTT-analyser eller belagt på kjøkkentøy for RNA-ekstraksjon. Transfections ble utført med SIPORT ™
NeoFX
™ siRNA transfeksjon reagenser (Ambion. Inc, Austin, Texas) som anvist av produsenten. The Silencer ™ EGFP siRNA (Ambion) og siRNA Control reagens (Dharmacon) ble brukt som positive og negative kontroller i alle forsøk. For ZNF93 inhibering, den endelige konsentrasjonen av siRNA var enten 25 nM eller 100 nM. Mediet ble erstattet med RPMI1640 supplementert med 10% FBS 24 timer etter transfeksjon. Total RNA ble isolert etter 72 timer med ZNF93 siRNA transfeksjon for Real-time RT-PCR bekreftelse.
Pires
ZNF93 ekspresjonsvektor konstruksjon og transfeksjon
En 1907 basepar cDNA fragment som inneholder fullstendig ORF av human ZNF93 ble amplifisert ved RT-PCR fra RNA til CS-1 /PR-cellelinjen som sterkt overuttrykker ZNF93. RT-PCR ble utført ved bruk av sense- og antisense-primere til human ZNF93: forstand primer 5′-ATAAGAATGCGGCCCGGAAGCCTAGAAATGGGACCATTG-3 «for å innføre et Not I-sete som understreket, og antisense-primer: 5′-GGTGGATCCTCACACTTCTAGGGTTTCT-3» (GenBank # NM_031218) til innføre et BamHI området som understreket. De innførte restriksjonsenzymseter ble beregnet på følgende transfeksjonsteknikker studier. Clonetech tallet (Palo Atlo, CA) pattedyr ekspresjonsvektor pIRESneo ble brukt for funksjonell uttrykk studien. Den resulterende ZNF93 RT-PCR-produktet ble klonet inn pCR®2.1 vektoren ved hjelp Invitrogen sin opprinnelige TA Cloning Kit. Etter sekvensbekreftelse ble ZNF93 kuttet fra vektoren pCR®2.1, renset, subklonet inn i MCS av ekspresjonsvektoren pIRESneo, og deretter sekvensert for å bekrefte den korrekte ORF. Ekspresjon av ZNF93 cDNA var under kontroll av den pCMV. Transfeksjoner ble utført ved å bruke lipofektamin pluss reagenser (Invitrogen) som følger: ca 5 x 10
5 CS-1-cellene ble sådd ut i 90 millimeter vevskulturskåler og dyrket over natten. Før transfeksjon, ble vekstmediet erstattet med serumfritt RPMI 1640 og dyrket i tre timer. Lipofectamine reagens som inneholder 5 mikrogram av Pires
tom, Pires
ZNF93 ble kombinert med Plus reagens og brukes på cellene. Etter dyrking i fire timer, ble mediet erstattet med RPMI 1640 inneholdende 10% føtalt bovint serum. G418-sulfat (Invitrogen) utvalg (300 ug /ml) ble startet ved 24 timer etter transfeksjon. Det merkede Mediet ble skiftet hver 2 dager. Effekter av overekspresjon ZNF93 på ET-743 og PM00104 ble bestemt ved MTT cytotoksisitet analysen.
Resultater
CS-1 /ER, CS-1 /PR-cellelinjer er resistente mot flere cytostatika
CS-1 /ER og CS-1 /PR ble valgt ut fra den parentale cellelinje, CS-1, ved eksponering for trinnvise økninger i eT-743 eller PM00104 konsentrasjoner i en periode på ett år. Den medikamentresistens fenotype ble funnet å være stabil etter 14 måneder med kontinuerlig kultur i stoffer eller i minst 6 måneder under medikamentfrie betingelser. ble ikke observert noen signifikant forskjell mellom CS-1 og CS-1 /ER eller CS-1 /PR-celler
in vitro
cellevekst (tilsvarende dobling tid) og mikroskopisk morfologi. MTT cytotoksisitet analyse viser at CS-1 /ER, CS-1 /PR er 10- 20 ganger mer resistent overfor ET-743 og PM00104 sammenlignet med den følsomme modercellelinjen. IC
50-verdien av ET-743 i CS-1 celler var 0. 0008 mikrometer i forhold til 0. 01 mikrometer i CS-1 /ER celler (12,5 ganger resistens). IC
50-verdi på PM00104 i CS-1 celler var 0. 002 mikrometer i forhold til 0. 04 mikrometer i CS-1 /PR-celler (20 ganger motstand). I tillegg, CS-1 /ER og CS-1 /PR oppviser motstand mot cisplatin og metotreksat, men ikke til doksorubicin (fig. 1).
CS-1 /ER, CS-1 /PR og CS- 1 celler ble utsatt for varierende konsentrasjoner av narkotika i 6 dager. Vekstinhibering ble bestemt ved inkubasjon med den tetrazolium fargestoff MTT og absorbansen ved måling ved 490 nm. Dataene viser tre replikater ved hver konsentrasjon.
Et stort antall gener som er assosiert med ET-743 og PM00104 motstand
Humant Affymetrix Gene Chip U133 Plus 2.0-matriser ble anvendt for å undersøke relativ RNA uttrykk nivåer mellom CS-1, CS-1 /ER, og CS-1 /PR. Uttrykket profiler av disse tre chondrosarcoma cellelinjer ble evaluert av Genesifter. I tillegg har vi levert våre microarray data til Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) og disse array-data har blitt tildelt en GEO sjonsnummer som GSE16748. Vi har funnet et stort antall gener hadde signifikant forskjellige nivåer av ekspresjon i CS-1 /ER og CS-1 /PR i forhold til CS-1. Å fokusere på gener med bare betydelige endringer i uttrykk nivåer, identifiserte vi gener med en ti ganger eller større endring i uttrykket nivåer. Ved hjelp av disse kriteriene, 595 (CS-1 /ER), 498 (CS-1 /PR) gener utstilt mer enn ti ganger overekspresjon i ET-743 og PM00104 resistente linjer i forhold til deres uttrykk i de sensitive foreldrelinjene (fig. 2A). I tillegg, 856 (CS-1 /ER), 874 (CS-1 /PR) transkriptene var mer enn ti ganger nedsatt på de resistente cellelinjer sammenlignet med kontroller (fig. 2B). Endringer i uttrykket nivåer varierte fra 10- til 536- fold. Genene identifiserte var stort sett ikke-overlapping mellom cellelinjer og kodet for proteiner med en lang rekke biokjemiske funksjoner. Genene identifiserte koder for proteiner som binder DNA har katalytiske aktiviteter, molekylære transducer aktiviteter, regulere transkripsjon, transportproteiner og molekyler, regulere enzymer og det er mange andre gener som har begrenset karakterisering. De 20 mest høyt overuttrykt og underexpressed gener i alle de resistente cellelinjer er oppsummert i tabell 1. Det var syv gener overuttrykt i både CS-1 /ER og CS-1 /PR og en gen som underexpressed i begge cellelinjer. I disse to resistente cellelinjer, er det flere overlappende genet i topp 20 over uttrykte gener listen i forhold til de under uttrykte gener liste. Vi har også lagt merke til at graden av forandring i gen-ekspresjon var mer dramatisk i settet på under uttrykte gener (tabell 1).
Genes enn uttrykt /under uttrykt i mer enn en cellelinje er angitt i de overlappende regionene sirklene.
Gener forskjellig uttrykt i begge resistente cellelinjer
fig. 2 Venn-diagram viser at 185 gener ble overuttrykt, 174 gener ble underexpressed i både CS-1 /ER, og CS-1 /PR-resistente cellelinjer i forhold til CS-1 (Fig. 2A og 2B fig.). De øverste 20 mest overexpresssed gener i begge resistente cellelinjer er oppsummert i tabell 2. Som 3 topp 20 overecpressing gener i både CS-1 /ER, og CS-1 /PR-resistente cellelinjer er sink finger protein gener (ZNF93, ZNF43 og ZNF568), bestemte vi oss for ytterligere å validere disse genene ved real-time RT-PCR.
TaqMan real-time RT-PCR analyse av forskjellig uttrykt gener
for å validere array-data, utførte vi real-Time RT-PCR av tre gener som ble forskjellig uttrykt i de to resistente cellelinjer. ZNF93, ZNF43, og Thada RNA uttrykk ble målt med TaqMan RNA-analyse kit. Differential uttrykk for ZNF93 og ZNF43 ble bekreftet i både CS-1 /ER og CS-1 /PR-resistente cellelinjer (Fig. 3A, Fig. 3B og Fig. 3C). Thada overekspresjon ble ikke bekreftet i resistente cellelinje CS-1 /ER
En plakater (Fig 3D.). Amplification tomt for β-aktin-genet.
B
: Amplification tomt for ZNF93 genet.
C
: Relative uttrykk nivåer av ZNF93 mRNA.
D
: Oppsummering av relative uttrykk nivåer av ZNF93, ZNF43 og Thada mRNA
Uttrykk av ZNF93 i andre multidrug resistente cellelinjer
ZNF93 genet overexpressed i begge. CS-1 /eR og CS-1 /PR-cellelinjer og funksjonen av ZNF93 er uklar, selv om proteinet har blitt implisert i den cellulære transkripsjonsregulering. Som ZNF93 genet har ikke tidligere vært knyttet til legemiddelresistens og ble valgt for videre studier. Vi evaluerte videre uttrykk for ZNF93 i andre multilegemiddelresistente cellelinjer ved real-time RT-PCR. Resultatene viste at ZNF93 er overuttrykt i to ET-743 resistente Ewings sarkom cellelinje, TC-ET, så vel som i et cisplatin resistent kreft i eggstokkene cellelinje, A2780cp, sammenlignet med deres ET-743 eller cisplatin følsomme foreldrecellelinjer men ZNF93 ble ikke overuttrykt i paclitaxel resistente cellelinjer Skov-3
TR og MCF-7
TR (fig. 4).
All real-time RT-PCR data er normalisert til p aktin.
Effekter av hemming av ZNF93 uttrykk av siRNA på narkotika sensitiviteter
for å finne ut om ZNF93 spiller en rolle i eT-743 og PM00104 følsomhet, vi hemmet sitt uttrykk i CS -1 /PR-celler ved hjelp av siRNA knockdown. De relative følsomheter stoffet ble evaluert ved sammenligning av IC
50 verdier bestemt ved MTT i siRNA-behandlede, ikke-spesifikke siRNA-behandlede og ikke-behandlede kontroll multilegemiddelresistente cellelinjer. Først cytotoksisitet overfor ET-743 og PM00104 ble målt 4 dager etter transfeksjon av resistente celler med ZNF93 siRNA oligoer fra Applied Biosystems. Vi observerte at ZNF93 nedregulering har delvis gjenopprette sensitivitet overfor PM00104 (fig. 5A) i CS-1 /PR-cellelinjen. Sanntid RT-PCR avslørte ZNF93 ekspresjon var signifikant redusert etter at cellene ble behandlet med siRNA (Fig. 5B). Lignende resultater ble funnet i legemiddelresistent cellelinje CS-1 /ER (Data ikke vist). I tillegg, for validering av ZNF93 RNAi spesifisitet, ble siGenome SMARTpool menneske ZNF93 sirnas kjøpt fra Dharmacon med de fire målsekvenser av ZNF93 gen og testet i cisplantin resistent cellelinje A2780cp. Uttrykket ZNF93 i siRNA transfekterte A2780cp celler ble betydelig redusert som vurderes av Real-Time RT-PCR (Fig. 5D). MTT-analysen viste IC
50 verdier av siRNA behandlede A2780cp celler var lavere sammenlignet med de ubehandlede resistente linjene (fig. 5C), hvilket antyder at ZNF93 siRNA inhiberer ZNF93 ekspresjon og delvis gjenoppretter følsomheten av resistent cellelinje for å cisplatin .
A
: CS-1 /PR ble transfektert med ZNF93 siRNA (Applied Biosystems) så vel som ikke-spesifikke siRNA.
C
: A2780cp ble transfektert med ZNF93 siRNA
† (Dharmacon) så vel som ikke-spesifikke siRNA. Den relative følsomhet av hver behandling for å PM00104 eller cisplatin ble bestemt ved MTT-analyse 72 timer etter transfeksjon.
B og D
: Bekreftelse av ZNF93 knockdown ved real-time RT-PCR. Total RNA ble isolert 72 timer etter transfeksjon og ZNF93 uttrykk ble analysert ved real-time RT-PCR.
Effekter av overekspresjon av ZNF93 på ET-743, PM00104 og cisplatin sensitiviteter
Våre analyser av endogen ZNF93 uttrykk viste at ZNF93 ofte oppregulert i ET-743, PM00104 og cisplatin flere legemiddelresistente kreftcellelinjer, ZNF93 nedregulering av siRNA kan delvis gjenopprette følsomheten til ET-743, PM00104 og cispatin. Disse resultater antyder at den ZNF93 proteinet kan være kritisk involvert i utviklingen av resistens mot disse stoffene. For å kunne fastslå hvorvidt ZNF93 deltar direkte i etableringen av resistente fenotype, vi transfektert ET-743 og PM00104 sensitiv cellelinje CS-1 med en ZNF93 ekspresjonsvektor og som genereres stabil cellelinje som overuttrykker ZNF93 (figur 6D). Vi spurte om eksogene overekspresjon av ZNF93 var tilstrekkelig til å gi økt ET-743 og PM00104 motstand. Resultatene fra MTT-analysen i de transfekterte cellelinjer er vist i fig. 6. ZNF93 transfekterte CS-1-cellene er forholdsvis motstandsdyktige mot ET-743, PM00104 og cisplatin, mens ingen signifikant endring i motstand ble observert i CS-1-celler transfektert med tom vektor (figur 6A til C). Forhøyet ZNF93 uttrykk i de transfekterte cellene ble bekreftet av real-time RT-PCR (Fig. 6D).
En
,
B Hotell og
C
: Relativ cytotoksisitet av eT-743, PM00104 og cisplatin i CS-1 avledet cellelinjer (CS-1 /Pires
ZNF93) stabilt transfektert med en Pires
ZNF93 ekspresjonsvektor og i foreldre (CS-1) og tom vektor (CS-1 /Pires) kontrollene ble vurdert ved hjelp av MTT analysen. Alle prøvene ble analysert in triplo.
D
. Bekreftelse av ZNF93 overekspresjon i Pires
ZNF93 transfekterte CS-1 celler ved real-time RT-PCR som beskrevet i materialer og metoder
Diskusjoner
Resultater fra flere kliniske studier antyder at ET-743 har antitumor-aktivitet mot en rekke krefttyper, inkludert bløtvevssarkomer, brystkreft, eggstokk-kreft og [2], [3]. Pasienter med fremskreden eggstokkreft og brystkreft samt bein eller sarkomer bløtvev vanligvis gjennomgå flere linjer med anti-kreft regimer før slutt gi etter for sykdommen sin. Resistens mot flere legemidler antas å spille en viktig rolle i den uunngåelige svikt i tumorer til å reagere på hver etterfølgende linje kjemoterapi. Derfor forstå mønstre og mekanismer for kryssresistens og finne måter å overvinne det er et viktig mål. Flere studier har studert mekanismen for ET-743 legemiddelresistens med ulike tilnærminger. Imidlertid har motstridende resultater er publisert fra forskjellige grupper som forsøker å korrelere motstand mot forskjellige uttrykk nivåer av RNA og proteiner i resistente celler [9], [10], [13], [14], [21]. Videre oppløsning av forskjellene mellom disse resultatene kan være best lettes ved genom-wide transkripsjonen rekke analyse.
I denne studien, rapporterer vi vellykket etablering av to kondrosarkom cellelinjer som er resistente mot ET-743 eller PM00104. Vi spurte hvordan genuttrykket nivåer knyttet til forskjeller i legemiddelresistens i disse to cellelinjer. Vi brukte Affymetrix Gene Chip U133 Plus 2 for å undersøke genom-wide uttrykk for RNA transkripsjoner. Sammenlignet med flere studier med mindre skala genet array, denne tabellen helt dekker hele det menneskelige genom med over 47 000 utskrifter. Vi validert genet matrise resultater for genene med de mest vesentlige endringer med real-time RT-PCR. Som forventet, er det et stort antall transkripsjons endringer knyttet
in vitro
ervervet resistens overfor ET-743 og PM00104. Faktisk, ca 5% til 10% (med cut off-verdi av to ganger) av transkripter blir overuttrykt eller underuttrykt i de resistente cellelinjer CS-1 /ER og CS-1 /PR i forhold til den følsomme opphavelige celle linjen.
i listen over topp 20 over uttrykker gener for både CS-1 /ER og CS-1 /PR, de samme tre sink finger proteingener, ZNF93, ZNF43 og ZNF568 (tabell 2) var alle identifisert. Disse gener er ikke tidligere blitt assosiert med medikamentresistens. Real-time PCR bekreftet ZNF93 og ZNF43 er konsekvent over uttrykt i disse resistente cellelinjer (Fig. 3). En foreløpig vurdering av ZNF93 bekrefter at dets ekspresjon er assosiert med multimedikamentresistent fenotype i flere cellelinjer.
