Abstract
Galectin-4 (Gal-4) er et medlem av galectin familien av sukkerbindende proteiner som viser en signifikant høyere uttrykk i cystisk svulster i den menneskelige bukspyttkjertelen og i bukspyttkjertelen adenokarsinomer i forhold til normal bukspyttkjertelen. Imidlertid er den antatte funksjon av Gal-4 i tumor progresjon av kreft i bukspyttkjertelen fortsatt ufullstendig forstått. I denne studien rollen som Gal-4 i kreft progresjon ble undersøkt ved hjelp av et sett med definerte bukspyttkjertelkreft cellelinjer, Pa-Tu-8988S (Patu-S) og Pa-Tu-8988T (Patu-T), som modell . Disse to cellelinjer er avledet fra den samme levermetastaser fra en human primær pankreatisk adenokarsinom, men skiller seg i deres vekstegenskaper og metastatisk kapasitet. Vi viste at Gal-4 uttrykket er høy i Patu-S, som viser dårlige trekkegenskaper, mens mye lavere Gal-4 nivåer er observert i svært metastatisk cellelinje Patu-T. I Patu-S, er Gal-4 finnes i cytoplasma, men det er også skilles ut og akkumuleres i membranen på områder av kontakt med nabocellene. Videre viser vi at Gal-4 hemmer metastasedannelse ved å forsinke migrasjon av kreft i bukspyttkjertelen celler
in vitro
bruker en ripe analyse, og
in vivo
bruker sebrafisk (
Danio rerio
) som en eksperimentell modell. Våre data antyder at Gal-4 kan virke på celleoverflaten hos PATU-S som et adhesjonsmolekyl for å hindre utslipp av tumorcellene, men har i tillegg et cytosoliske funksjon ved å hemme migrering via en foreløpig ukjent mekanisme.
Citation: Belo AI, van der Sar AM, Tefsen B, van Die i (2013) Galectin-4 Reduserer Migrasjon og metastase Dannelse av kreft i bukspyttkjertelen celler. PLoS ONE 8 (6): e65957. doi: 10,1371 /journal.pone.0065957
Redaktør: Roger Chammas, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, Brasil
mottatt: 14 februar 2013; Godkjent: 29 april 2013; Publisert: 18 juni 2013
Copyright: © 2013 Belo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av Fundação para en Ciencia e Tecnologia (FCT), Lisboa, Portugal, gjennom forskningsmidler SFRH /BD /44820/2008 tildelt AIB. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er en av de viktigste årsakene til dødsfall av kreft i den vestlige verden. Klinisk effektive strategier for tidlig påvisning av sykdommen er fortsatt ikke tilgjengelig. Forekomsten av kreft i bukspyttkjertelen og dødelighet hos pasienter med denne typen kreft har knapt gått ned i løpet av de siste 50 årene [1], [2], [3], [4]. Derfor ytterligere forståelse i mekanismene for utbruddet, progresjon og metastasering av kreft i bukspyttkjertelen er berettiget.
Galectins er proteiner som kan abnormt uttrykt i kreft og har vært involvert i kreft progresjon [5], [6]. De består av en familie av galaktosid-bindende oppløselige lektiner som er blitt klassifisert i tre subgrupper basert på deres struktur og antall karbohydrat-gjenkjenning domener: prototype (galectins-1, -2, -5, -7, -10, -11 , -13 og -14), chimera type (galectin-3), og tandem repeat Type (galectins-4, -6, -8, -9 og -12) [anmeldt i [7]]. De fungerer i en rekke forskjellige biologiske prosesser både intra- og ekstracellulært. Galectin-glykoprotein gittere spille viktige roller i regulering av cellefunksjon, som celle-celle-adhesjon, celle-ekstracellulær matriks (ECM) interaksjoner, cellevekst [8], organisering av membrandomener i lipid flåten formasjon [9], [10] [11], leukocytter migrasjon [anmeldt etter [12]] og regulering av intracellulær signalering [13], [14], [15].
uttrykk for galectins moduleres under utviklingen av individuelle celler og kan forandres under forskjellige fysiologiske eller patologiske tilstander. Galectins ofte overexpressed i kreftceller og kreftassosierte stromale celler, spesielt i de celletyper som normalt ikke uttrykker den spesifikke galectin [16]. I kreft progresjon, blir galectins involvert i differensiering, adhesjon, migrasjon, angiogenese, ondartet transformasjon, apoptose og kreft medikamentresistens [gjennomgått i [5], [17], [18], [19], [20], [21] [22]]. Videre er det flere rapporter som har knyttet disse proteinene til invasjon og metastase i flere typer kreft [16], [23], [24], [25], [26], [27], [28].
i denne studien har vi fokusert på rollen galectin-4 (Gal-4) i metastasering av kreft i bukspyttkjertelen celler. Metastasedannelse er en flertrinnsprosess hvor primærtumorceller å invadere nærliggende vev, migrerer gjennom det vaskulære karet som endelig ekstravasere inn i perivaskulær vev og proliferere til sekundære tumorer. Gal-4 er et 323-aminosyre (36 kDa) protein som er hovedsakelig uttrykt i luminal epitel av mage-tarmkanalen, fra tungen til tykktarmen. Gal-fire uttrykk er ikke påvist hos friske bukspyttkjertelen, men er betydelig forbedret i cystisk svulster i den menneskelige bukspyttkjertelen og bukspyttkjertelen adenokarsinomer i forhold til normal vevsprøver, mens dens uttrykk er lav i bukspyttkjertelen nevroendokrine svulster [26], [27], [29 ], [30], [31]. Funksjonen til Gal-4 i tumorprogresjon og metastase i kreft i bukspyttkjertelen, men er fortsatt uklart. I denne studien ble den antatte rolle Gal-4 in cancer progresjon ble undersøkt, ved hjelp av et sett med definerte pankreatiske cellelinjer. Resultatene viser at Gal-4 er høyere uttrykt i de mer differensierte pankreatiske tumorceller sammenlignet med bukspyttkjertelen celler demonstrerer metastatiske evner. Videre Gal-fire påvirker metastasedannelse ved å forsinke migrasjon og metastasering av kreft i bukspyttkjertelen celler
in vitro
i en ripe analyse og
in vivo
i sebrafisk embryoer som en eksperimentell modell.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Roy
– /-; Nacre
– /- casper
Danio rerio plakater (sebrafisk) ble håndtert i samsvar med de lokale dyrevern forskrifter og vedlikeholdes i henhold til standard protokoller (zfin.org). Oppdrett av voksen fisk ble godkjent av den lokale dyrevernkomité (Committee, desember Animal Experimental lisensiering) av VU University Medical Center. Alle protokoller følges til internasjonale retningslinjer fastsatt av EU dyrevern direktiv 86/609 /EØF, som lar sebrafisk embryo som skal brukes opp til det øyeblikket av frittlevende (ca 5-7 dager etter befruktning). Fordi embryoer brukt i denne studien oppfylte disse kriterier er ikke desember lisens for denne undersøkelsen.
Antistoffer, reagenser og buffere
Geit-anti-humant Galectin-4 (BD Biosciences, Belgia) ble anvendes for påvisning av Gal-4 og mus anti-tubulin (Cedarlane, Canada) ble anvendt som en endogen kontroll. Sekundære antistoffer (Abs) som ble brukt var Odyssey IRDye 680 Donkey Anti-Goat (0,5 mg); IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG (LI-COR biovitenskap, USA); kanin anti-geit Alexa Fluor 488; kanin anti-geit Alexa Fluor 647 (Molecular Probes, Invitrogen, USA). TO-PRO®-3 Iodide med vidt rød fluorescens fra Levende Technologies (Invitrogen, USA) ble brukt som døde celler indikator
Rekombinant hGal-fire protein ble kjøpt fra BD Biosciences.; Licor blokkeringsbuffer ble kjøpt fra LI-COR biovitenskap, USA; lactose ble oppnådd fra Sigma (USA) og røde fluorescerende cellefarging CM-Dil fra Vybrant, Invitrogen (USA). Kontroll siRNA (rykke A) og for GAL4 siRNA (10 mm) ble kjøpt fra Santa Cruz Biotecknology (USA). Silencer pre-designet siRNA mot Gal-4 (20 mm) og Ambion®
Silencer®
negativ kontroll 1 siRNA (20 mm) ble kjøpt fra Ambion (USA). Lipofectamine RNAiMax og Opti-MEM transfeksjon reagenser ble oppnådd fra Invitrogen (USA).
Cells og kultur betingelser
Kreft i bukspyttkjertelen cellelinjer Pa-Tu-8988S (Patu-S) og Pa-Tu -8988T (Patu-T) ble kjøpt fra DSMZ (Tyskland). Andre bukspyttkjertelen cellelinjer var en slags gave fra professor dr Richardson (Leiden University, Nederland) [32]. Cellelinjene AsPC1, BxPC3, MiaPaca og Panc01 ble dyrket i RPMI (Gibco, Invitrogen), med 10% FCS (Lanza, Belgia) og 1:100 Pen /Strep (Gibco, Invitrogen) ved 37 ° C + 5% CO
2. Cellelinjene CAPAN-I og CAPAN-II ble dyrket med 15% FCS. Patu-S, Patu-T og PaTu8902 ble dyrket i DMEM høy glukose (GIBCO, Invitrogen), med 10% FCS og 1:100 Pen /Strep ved 37 ° C + 5% CO
2.
cDNA syntese og kvantitativ real-time PCR
Total RNA ble isolert fra alle cellelinjer ved hjelp TRIzol Reagens (Invitrogen) etter produsentens retningslinjer. mRNA ble deretter transkribert til cDNA ved hjelp av revers transkripsjon System kit (Promega, USA) som tidligere beskrevet [33]. cDNA fra normal menneskelig pankreasgang epitelial-lignende hTERT-HPNE cellelinje [34] var en slags gave fra Dr. E. Giovannetti (Dept. of Medical Oncology, VUmc Cancer Center Amsterdam, Nederland). Sanntids (RT) PCR-reaksjoner ble utført med SYBR grønn metoden i en ABI 7900HT sekvens deteksjonssystem (Applied Biosystems, USA) som tidligere beskrevet [35]. Alle oligonukleotider ble utformet ved hjelp av Primer Express 2.0 (Applied Biosystems, USA) dataprogrammer, og syntetisert ved hjelp av Invitrogen Liv Technology (USA). Reaksjonene ble utført som følger: 2 minutter ved 50 ° C, etterfulgt av 10 minutter ved 95 ° C og 40 sykluser med 15 sek ved 95 ° C og 1 min ved 60 ° C. Data er uttrykt som relativ mRNA overflod hentet fra CT verdier fra målet mot den endogene referansen genet
GAPDH
.
Bygging av Patu-T-celler som uttrykker Gal-4
å konstruere Patu-T-celler som uttrykker rekombinant Gal-4, den menneskelige Galectin-4 (hGal-4) genet ble klonet ved å sette cDNA av hGal-4 genet i vektoren pRRL-cPPT-CMV-X2-PRE-syndere IRES-EGFP (en slags gave fra Dr. A. Horrevoets, VU Medical Center, Amsterdam, Nederland). Hele hGal-4-åpen leseramme (ORF) ble oppnådd ved RT-PCR amplifisering, innføre Nsil /EcoRI restriksjonsseter for innsetting og en Cosac sekvens før den ORF (Ang: catatgcatcaccATGGCCTATGTCCCCGC; Rev: gaattcgatTTAGATCTGGACATAGGACAAGG). Den hGal-4-innskuddet ble klonet ved anvendelse av EcoRI-setet til vektoren, og således plassere hGal-4-gen i henhold til en konstitutiv aktiv CMV-promoter. Den resulterende lenti-viral-konstruksjonen ble dyrket i
Escherichia coli
BL21 (DE3) og renset ved spin-kolonne plasmid isolasjon kit (Qiagen, Tyskland). Lenti-viral produksjon og infeksjon av Patu-T-celler med det virale konstruksjonen, noe som resulterer i cellelinjen Patu-T /Gal-4, ble utført som tidligere beskrevet [36]. En kontrollcellelinje (Patu-T /mock) ble konstruert ved innføring av den tomme vektoren.
Gal-4 Knock Down (KD) i Patu-S Cells
RNA-mediert interferens var benyttes til å redusere Gal-fire uttrykk i Patu-S-celler. For optimal transfeksjon effektivitet i Patu-S-celler, ble både Gal-fire mål siRNA (40 nM endelig konsentrasjon) fra Santa Cruz Biotechnology og lyddemper Pre-designet siRNA (10 nM endelig konsentrasjon) samtidig brukes til å hemme Gal-fire uttrykk (PaTu- S /Gal-4-KD). En negativ kontroll (rykke A sammen med negativ kontroll siRNA 1 #) ble inkludert i forsøkene (Patu-S /mock-KD). Transfections ble utført i henhold til Invitrogen retningslinjer for omvendt transfeksjon i en 24-brønner plate ved hjelp av en mikroliter Lipofectamine RNAiMax og 100 ul Opti-MEM medium. For å redusere Gal-4-ekspresjon i Patu-S-celler, ble siRNA innført to ganger med 4 dagers intervall, og cellene ble transplantert inn i sebrafisk embryo 24 timer etter den andre transfeksjon. Gal-4-mRNA-nivåer ble målt på flere tidspunkter i løpet av dette forsøk under anvendelse av kvantitativ RT-PCR.
Western Blotting-
Celler ble lysert ved 0 ° C i TEA lyseringsbuffer (Triton X- 100, NaCl, MgCl, CaCl
2, TEA pH8.2) inneholdende proteaseinhibitorer. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved A280 målinger og BCA bestemmelse ved hjelp av Protein Assay Kit fra Pierce (USA). Proteinene av cellelysater (75 ug) og kulturmedium (25 ul) ble separert ved SDS-PAGE på en 12,5% polyakrylamidgel i et diskontinuerlig buffersystem og proteinene overført til nitrocellulosemembraner (Whatman Protran, Sigma). Etter over natten blokkering i 01:01 licor blokkeringsbuffer i PBST /1% BSA (PBS med 0,05% Tween 20, 1% BSA), blottene ble inkubert i 60 min ved RT med geite-anti-hGal-4 (0,1 ug /ml ). Mus anti-tubulin (1:2000 fortynning) ble anvendt som laste- kontroll (cellelysater) og celleavfall deteksjon (dyrkningsmedium). Sekundær ABs IRDye 680 anti-geit og IRDye 800CW anti-kanin-IgG ble anvendt ved fortynninger 1:15000 (0,07 ug /ml), i PBST /1% BSA i 1 time ved romtemperatur (RT) i mørket. Western-blotting-analyse ble utført ved hjelp av LI-COR Odyssey systemer skanner og programvare.
Cell Proliferation Assay
Celler ble sådd i en 96-brønner plate til ca 1 × 10
4 og 1 x 10
5 celler per brønn og inkubert over natten for celle adhesjon til platen. [
3H] tymidin (1 jiCi /brønn; Amersham Biosciences, USA) ble tilsatt og cellene inkubert i ytterligere 24 timer ved 37 ° C + 5% CO
2. Cellene ble høstet og [
3H] tymidin inkorporering ble vurdert ved hjelp av en flytende scintillation Micro
2 Plate Counter 2450 (Perkin Elmer, USA).
immunfluorescens Mikros
Patu-S , Patu-T /mock og Patu-T /Gal-4-celler dyrket på dekkglass i 24 timer ble vasket 3 ganger med PBS, fiksert i 30 minutter i 4% paraformaldehyd og permeabilisert i 0,1% Triton X-100 /PBS i 5 min. Uspesifikk binding ble blokkert ved bråkjøling 10 minutter med PBS /glysin (0,15 M), etterfulgt av 30 minutter med PBS /0,2% gelatin /BSA 0,5% (PBSG). Cellene ble inkubert med polyklonalt geite-anti-hGal-4 i PBSG (fortynning 0,2 ug /ml) i 1 time og deretter vasket med PBS. Deteksjon ble utført etter 1 time inkubering ved RT med 5 ug /ml av den sekundære Abs (anti-geit Alexa Fluor 488 eller anti-geit Alexa Fluor 647). Kjerner ble farget med HOECHST (1 ug /ml i PBS) under inkuberingstrinnet med sekundær Ab. Aktin ble påvist ved phalloidin farging (1:5000 i PBS, 15 min). Etter en siste vasketrinn i PBS og innebygging ved hjelp Mowiol (Kurarays POVAL, Tyskland) flere celler av hver tilstand ble visualisert ved hjelp av en Leica M6000 B mikroskop med objektiv HCX PL APO 40,0 × 0,85 TØRR. Bildene ble tatt med en DFC350FXR2-095903305 kamera og analysert ved hjelp av LASAF programvare (Leica Microsystems, Tyskland).
flowcytometrisystemer
For påvisning av endogent Gal-4, celler ble først løst i 4% paraformaldehyd i 30 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av celle permeabiliseringen i PBA /0,5% saponin i 15 minutter ved 4 ° C. For å detektere bindingen av rekombinant human-Gal-4 (rec hGal-4) til celleoverflaten, ble prosedyrene utført i henhold til Patnaik,
et al product: [37]. Kort sagt, ble cellene høstet, sentrifugert og resuspendert i kald Hanks Balanced Salt Solution (HBSS, Sigma, USA) med 500 mM laktose. Cellene ble deretter samlet opp og inkubert i kald HBSS med 2% BSA i 1 time ved 4 ° C med forsiktig omrøring. Etter dette ble cellene vasket en gang med HBSS /BSA med 2 mM β-merkaptoetanol (Gibco, Invitrogen), og deretter inkubert i en time ved 4 ° C i HBSS /BSA /1 mM β-merkaptoetanol i fravær eller nærvær av rec hGal-4 (5 ug /ml) for å detektere endogene overflate-bundet Gal-4 eller overflate- bundet rec hGal-4, henholdsvis. For å vurdere hvorvidt Gal-4 binding er avhengig av karbohydrat, ble bindingsanalyser utført i nærvær av 500 mM laktose. For både overflate og cytosol-analyse, ble cellene farget med anti-Gal-4-Ab (2 ug /ml) i PBS med 0,5% BSA og 0,02% azid (PBA) inneholdende 10% FCS (Sigma, USA), i 30 minutter ved 4 ° C. For sekundære flekker, Alexa488 eller Alexa647 merket Abs ble anvendt (5 ug /ml og inkubasjon i 30 min ved 4 ° C). Død celle indikator TO-PRO®-3 jodid (1 nM) ble tilsatt bare tidligere å flyte cytrometry målinger. Flowcytometri ble utført ved hjelp av en FACScan eller en FACSCalibur flowcytometer og Summit programvare. Døde celler definert som høy TO-PRO®-tre flekker ble ekskludert fra analysen.
In vitro
Migration analysen ( «scratch» -assay)
scratch-analysen ble utført som tidligere beskrevet av Liang et al. [38]. Cellene ble dyrket til konfluens i en 24-brønner plate. Den cellemonolaget ble skrapet i en rett linje med en 200 ul pipette (Sarstedt, Tyskland). Fotografier av grunnen ble tatt under en invertert Leica DMI mikroskop ved 0 h, 12 timer, 24 timer og 48 timer for Patu-T /Gal-4 og Patu-T /mock celler. Fotografier på hvert tidspunkt ble tatt med Leica DFC420 kamera. Spaltebredden ved 0 h ble satt til 100%. Gap bredde analyse ble utført med PhotoshopCS4 ved hjelp av analyse hersker verktøyet. Målinger ble tatt på flere definerte områder ( 5) langs bunnen av. Hver scratch fikk et gjennomsnitt av alle målingene. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter
In vivo
metastaser analysen
Roy
– /-;. Nacre
– /- Casper Danio rerio plakater (sebrafisk) ble håndtert i samsvar med lokale dyr omsorg forskrifter og standardprotokoller i Nederland. Fisken ble holdt ved 28 ° C i akvarier med dag /natt lette sykluser (10 timer mørke, og 14 h lys perioder). Utviklings embryoene ble holdt i egg vann (60 mikrogram /ml instant ocean se salter) ved 28 ° C før transplantasjon og ved 35 ° C etter transplantasjonen.
Kreft celletransplantasjon ble utført i henhold til Marques
et al product: [39]. I utgangspunktet celler ble dyrket til konfluens, trypsinert (GIBCO, Invitrogen) og sentrifugert 5 min, ved 1500 rpm. Cellene ble deretter farget i PBS innehold CM-Dil ved en sluttkonsentrasjon på 4 ng /mL, i 4 minutter ved 37 ° C og 15 minutter ved 4 ° C. Deretter ble cellene høstet og cellepelletene resuspendert i 100% FCS i 5 min gjenvinning og vasket to ganger med PBS. Til slutt, ble cellene resuspendert i PBS for transplantasjon inn i sebrafisk embryoer 2 dager etter befruktning (dpf). Embryoene ble dechorionated og bedøvet med Tricaine (MS-222, Sigma-Aldrich, USA). Ved hjelp av en manuell injektor (Eppendorf, Tyskland; Injectman Ni2), ble cellesuspensjonen innført i en sprøyte kapillar (15 um internt ford og 18 um utvendig diameter). Deretter ble omtrent 100 røde fluorescerende celler injisert i plommesekken av dechorionated embryoer. Etter injeksjon ble embryoer fikk komme seg etter transplantasjon i 1 time ved RT. Etter denne perioden (2 timer etter transplantasjon (HPT)), ble embryoer kontrollert for nærværet av fluorescerende celler. Embryoer som inneholder fluorescerende celler utenfor transplantasjon området på to HPT ble ansett for å være utett og ekskludert fra videre analyse. Antallet levende embryoer på dette stadiet var satt som 100% for hver tilstand uavhengig av hverandre. Alle andre embryoer ble inkubert ved 35 ° C for de 3 neste dagene.
Imaging, Utvalg og posisjonering av transplanterte Sebrafisk embryoer
På 1, 2 og 3 dager etter transplantasjonen (DPT), den embryoer ble bedøvet med Tricaine og plassert lateralt på 3% metylcellulose. Embryoene ble screenet under en stereo DSR fluorescens Leica MZ16FA mikroskop. Fluorescerende kreftceller utenfor området for implantering ble tellet i hver embryo. Embryoer som er presentert mer enn 5 kreftceller utenfor plommen ble ansett som positivt for metastasering, og ble satt til side adskilt fra resten av de transplanterte embryoer. Andel av metastaser ble angitt som antall embryoer som inneholder mer enn 5 celler utenfor plomme per dag i forhold til dag null. Total metastaseprosent er angitt som det totale antall embryoer med metastaser etter 3 dager i forhold til dag null.
statistikker
Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. Statistisk analyse anvendt til den kvantitative RT-PCR-data var enveis ANOVA ved bruk av Dunnetts t-test. For alle andre data, statistisk analyse som ble brukt var en enveis ANOVA er Tukey t-tester.
In vivo
metastase analysene ble statistisk analysert ved hjelp av sammenkoblede sample t-tester. Data ble betraktet som signifikant hvis
p
≤0.05.
Resultater
mRNA uttrykk av Gal-4 i Pancreas adenokarsinom cellelinjer
For å undersøke differensial uttrykk for gal-4, ble mRNA nivåer bestemt i ni forskjellige menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer som bruker real Time (RT) PCR (figur 1). Som en kontroll for ekspresjon i normalt pankreasgang vev, ble Gal-4-mRNA-nivåer bestemt i en immortalisert cellelinje avledet fra normal human epitelial pankreasgang (hTERT-HPNE). Resultatene viste at Gal-4-mRNA-nivåer i normal bukspyttkjertelkanalen cellelinje var ikke detekterbare. Gal-4 mRNA nivåer viste en relativ lav overflod i åtte av de ni kreftcellelinjer, ved hjelp av
GAPDH
som en husholdning referanse genet. En cellelinje, Pa-Tu-8988S (Patu-S), viste imidlertid en mer enn 10 ganger forhøyet uttrykk i forhold til de andre cellelinjer.
Gal-4 mRNA uttrykk for normal menneskelig pankreasgang epithelial- liknende cellelinje (hTERT-HPNE) og 9 forskjellige human bukspyttkjertelcancercellelinjer ble analysert ved hjelp av kvantitativ real-time PCR og avbildet som den relative mengde av Gal-4-transkripter (± SEM) i forhold til ekspresjon av det endogene referanse-genet
GAPDH
. (*** P≤0.001 versus alle andre cellelinjer, ved hjelp av en vei ANOVA med post Dunnett tosidige t-tester).
Interessant, Patu-S stammer fra samme levermetastaser av et menneske primær pankreatisk adenokarsinom som en av de lave Gal-4-uttrykkende cellelinjer, Pa-Tu-8988T (PATU-T) [40]. Disse to cellelinjene er beskrevet å inneholde motsatte trekkende og metastaserende kapasiteter. Patu-S og Patu-T vise en svært lav og en høy metastatisk kapasitet, henholdsvis, både
in vitro Hotell og
in vivo
bruker sebrafisk som modellsystem [39]. Videre har det vist seg tidligere at de fleste av cellelinjene som er vist i figur 1 har en øket
in vitro
spredningsevne, sammenlignet med Patu-S [32], [41]. Disse data førte oss til å vurdere muligheten for at uttrykket av Gal-4 kan begrense trekkfugl og /eller metastatisk kapasitet av disse kreft i bukspyttkjertelen celler. På grunn av deres felles opphav, lav vandrende Patu-S cellelinje og metastatisk Patu-T cellelinje representerer et meget attraktivt modellsystem for å studere den antatte rollen Gal-4 i metastasering.
Lokalisering av Gal- 4 i Patu-S og Patu-T-celler
uttrykket og lokalisering av Gal-fire protein i Patu-S og Patu-T-celler ble bestemt ved hjelp av flowcytometri, Immunocytochemistry (ICC) og western blotting (WB) (figur 2-4). For å bestemme endogene Gal-4 av patu-S og PATU-T-celler, ble cellene fiksert og permeabilisert, etterfulgt av strømningscytometri ved bruk av anti-Gal-4-antistoff (ABS), og fluorescerende sekundært Abs. Resultatene viser en klar forskjell i Gal-fire Ab binding mellom Patu-S og Patu-T. Patu-S-celler viser en sterk farging av anti-Gal-4 Abs, mens Gal-fire flekker i Patu-T-celler er neppe påvises (figur 2A). For å vurdere nærværet av glykan ligander på den ytre celleoverflate som kan gjenkjennes av Gal-4-celler ble først omhyggelig vasket med 500 mM laktose for å fjerne endogen overflate bundet galectins. Deretter eksogene rec. hGal-4-protein (5 ug /ml) ble tilsatt til cellene og Gal-4-binding ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri ved bruk av anti-Gal-4 Abs. Resultatene viser at det fremdeles et betydelig nivå av Gal-4-farging ble observert på overflaten av Patu-S-celler, men ikke Patu-T-celler, etter vasking med laktose (figur 2B), hvilket indikerer nærværet av sterkt bundet endogen Gal-4 på overflaten av Patu-S-celler. Etter tilsetning av rec hGal-4 til cellene, sterkt økte celleoverflate Gal-4 flekker, noe som viser at Patu-S-celler kan binde høye nivåer av Gal-4 til deres overflate. I motsetning til dette, mye lavere nivåer av rec hGal-4 bundet til celleoverflaten av PATU-T-celler. For å undersøke om rec hGal-4 binder seg til cellene i et karbohydratavhengig måte, ble Patu-T og Patu-S-celler inkubert med rec hGal-4 i nærvær av laktose. I nærvær av 500 mM laktose bindingen av hGal-4 til begge cellelinjene ble hemmet, noe som indikerer at Gal-4-binding til celleoverflaten er glykan-avhengig. Samlet viser disse resultatene at høye Gal-4-nivåer er til stede i Patu-S-celler, mens Gal-4 er neppe påvisbar i Patu-T-celler. I tillegg kan Patu-S-celler binder mye høyere nivåer av Gal-4 til sin ytre overflate enn patu-T-celler, noe som indikerer at de uttrykker mer Gal-4-bindende karbohydrat-ligander.
Påvisning av endogen Gal- 4, og Gal-4 ligander, i Patu-S og Patu-T-celler ved flowcytometri. Et histogram av en representativt eksperiment er vist for hver tilstand av minst to uavhengige eksperimenter. A) Prikkplott av Gal-fire farging av permeabilized Patu-S og Patu-T-celler. Gal-4 ble oppdaget ved 4 ° C med anti-hGal-4 Abs i faste permeabilized celler. Sekundær Abs flekker uten anti-hGal-4 Abs ble brukt som bakgrunn autofluorescence kontroll. B) Tilstedeværelse av endogent bundet Gal-4 på overflaten av Patu-S og PATU-T etter vasking av cellene med 500 mM laktose før Gal-4-farging. Tilstedeværelsen av Gal-4 ble opprettet ved FACS-analyse ved bruk av anti-hGal-4 Abs ved 4 ° C. Endogen Gal-4 bundet til overflaten er vist med en sort linje. C) Tilstedeværelsen av Gal-fire bindingsseter på Patu-S og Patu-T-celler ble bestemt etter vask cellene med 500 mM laktose før Gal-fire flekker. Bindingen av eksternt tilsatt rekombinant (rec) hGal-4 (5 ug /ml, svart linje) ble undersøkt. Binding av rec-4 hGal til overflaten kan bli inhibert ved tilsetning av laktose (mørkt felt). Bakgrunnsfarging med sekundær Abs er avbildet som lysegrå felt i B og C.
Fotografier av representative ICC analyse av cellulær lokalisering av Gal-4 i Patu-S-celler. Gal-4 ble påvist under anvendelse av Alexa-merket anti-Gal-4 Abs (grønn), aktin ble farget ved bruk av Phalloidin (rød) og kjerne-farging oppnådd ved bruk av HOESCHS (blå); den tredje panelet viser sammenslåing av de ulike stainings. Bar = 25 mikrometer.
A) Proteiner fra hel-celle ekstrakter (75 ug total protein) og dyrkingsmedium (4 dager kultur, 25 ul) av Patu-S (PS), Patu-T (PT), Patu-T /Gal-4 (PT /Gal-4) og Patu-T /mock (PT /M) ble separert ved SDS-PAGE. Etter overføring av proteinene til en nitrocellulosemembran, ble blottene farvet ved anvendelse av geite-anti-hGal-4 for påvisning av Gal-4, og mus anti-tubulin som kontroll for tilstedeværelse av intracellulært protein. B) Fotografier av representative ICC analyse av cellulær lokalisering av Gal-4 i Patu-T /Gal-4 og Patu-T /mock celler. Gal-4 ble påvist under anvendelse av Alexa-merket anti-Gal-4 Abs (grønn), aktin ble farget ved bruk av Phalloidin (rød) og kjerne-farging oppnådd ved bruk av HOESCHS (blå); den tredje panelet viser sammenslåing av de ulike stainings. Bar = 25 mikrometer.
Den cellulære lokalisering av Gal-4 ble videre undersøkt ved hjelp av ICC. Resultatene viser høy fluorescens-intensitet gjennom hele cytoplasmaet til Patu-S-celler (figur 3), noe som indikerer at de fleste Gal-4 er lokalisert i cytosolen. Høy fluorescens ble observert ved den cytoplasmiske membran i enkeltceller og mellom celler, særlig ved kontaktseter mellom naboceller (celle-celle-kontakter), mens det knapt noen fluorescens ble påvist i kjernen. Gal-4 er ikke homogent fordelt i cytoplasma, som viser noen områder med høyere fluorescens nivåer enn andre selv om det er ingen klare indikasjoner på spesifikke organeller som er involvert i akkumulering av Gal-4. Patu-T-celler, kunne ingen Gal-4 oppdages ved hjelp av denne metoden, etablering av flowcytometri data som indikerer at Gal-4 nivåer i Patu-T-celler er svært lave.
Overuttrykte Gal-4 i Patu -T Cells
for å vurdere en antatt involvering av Gal-4 i migrasjon, Gal-4 ble overexpressed i Patu-T-celler ved innføring av en viral vektor som inneholder hGal-4 genet drevet av en CMV promoter (Patu -T /Gal-4). Som en kontroll ble den virale vektoren uten innsats transdusert til PATU-T (PATU-T /mock). Protein uttrykk og lokalisering av Gal-4 i ubehandlede Patu-T og Patu-S-celler, Patu-T /Gal-4 og Patu-T /mock ble analysert ved western blot (WB), ICC og flowcytometri.
for å bestemme nivået av Gal-4-ekspresjon i cellelinjer, celler og medium ble høstet etter 4 dagers dyrking. Proteiner som er tilstede i celleekstrakter og mellom ble separert ved SDS-PAGE og overført til en nitrocellulosemembran. Etter beising de blotter ved hjelp av geit anti-Gal-4 Abs, band på 36 kDa som tilsvarer den tilsynelatende masse av Gal-4 ble observert i Patu-T /Gal-fire celleekstrakt og medium, i like mengder som er observert i Patu-S celleekstrakt og medium, henholdsvis (figur 4A). Som ventet fikk Patu-T /mock ikke vise påviselige bånd på 36 kDa. Disse resultatene indikerer at Gal-4 uttrykkes i Patu-T /Gal-4 på samme nivå i forhold til PATU-S-celler. Videre er tilsvarende mengder Gal-4 utskilt av Patu-S og Patu-T /Gal-4-celler.
Ved hjelp av ICC, vi demonstrert at den intracellulære fordeling av Gal-4 i PaTuT /Gal-4 cellene er lik fordeling i Patu-S-celler, mens ingen Gal-4 ble påvist i PaTuT /mock-celler (figur 4B). Fordelingen av Gal-4 i disse celler i cytosol er lik fordelingen i Patu-S-celler. Gal-4 er til stede gjennom hele cellen, med unntak av kjernen, tilsvarende som observert for Patu-S. Imidlertid, mens Gal-4 foreligger i plasmamembranen til Patu-S-celler, knapt noen Gal-4 blir detektert ved membranen av permeabilisert Patu-T /Gal-4-celler. I konklusjonen, disse resultatene indikerer at Patu-T /Gal-4 uttrykker og utsondrer Gal-4 i tilsvarende mengder som Patu-S-celler.
I tillegg har vi fastslått om endogen, og /eller lagt rekombinant Gal- 4 ble bundet til celleoverflaten hos Patu-T /Gal-4 ved strømningscytometri ved å bruke anti-Gal-4 Abs. Binding av anti-Gal-4 Abs til celleoverflaten ikke skiller mellom Patu-T /Gal-4 og Patu-T /Mock (data ikke vist). Derfor til kapasiteten på Patu-T /Gal-4 celler binder Gal-4 ekstracellulært er uendret sammenlignet med ubehandlet Patu-T cellelinje.
Overuttrykte Gal-fire reduserer Migration kapasitet Patu-T celler
for å undersøke hvorvidt Gal-4 påvirkninger vandringsmønstrene hos Patu-T-celler, ble en ripe analyse utført ved hjelp av Patu-T og Patu-T /Gal-4-celler (Figur 5A-B).
En ripe (sårheling) analysen ble utført med Patu-T, Patu-T /Gal-4 og Patu-T /mock celler. PATU-T /mock og Patu-T /Gal-4-celler ble utsådd på en 24 brønners plate og riper på overflaten med en 200-mL pipettespissen. Relative verdier ble satt til 100% av gap-bredden ved bunnen av.
