Abstract
Aberrant kinase aktivering som følge av mutasjonen, forsterkning, eller trans kan drive vekst og overlevelse i en undergruppe av kreft hos mennesker.
FGFR2
forsterkes i bryst og magekreft, og vi rapporterer her den første karakteriseringen av
FGFR2
genamplifisering i kolorektal kreft i NCI-H716 tykktarmskreft cellelinje.
FGFR2
er sterkt uttrykt og aktivert i NCI-H716-celler, og FGFr selektiv lite molekyl hemmere eller FGFR2 shRNA sterkt hemmet celleviabilitet
in vitro
, noe som indikerer «avhengighet» av NCI-H716 celler til FGFR2. NCI-H716 vekst i en xenograft modell ble også hemmet av en FGFR lite molekyl-inhibitor. FGFR2 var nødvendig for aktivering av flere nedstrøms signalproteiner inkludert AKT, ERK, S6RP og NFkB. Inhibering av nedstrøms kinaser så som AKT eller ERK alene hadde moderat effekt på proliferasjonen, mens det kombinerte hemming av AKT og ERK signalering resulterte i et tap av levedyktighet lik FGFR2 inhibering. Vi identifiserte forhøyet
FGFR2
uttrykk i en liten undergruppe av primære kolorektal kreft, men
FGFR2
forsterkning ble ikke observert. Selv
FGFR2
forsterkning er ikke vanlig i primær kreft i tykktarmen eller lymfeknute og levermetastaser, andre undergrupper av tykktarmskreft som ascites, hvorfra NCI-H716-cellelinjen ble avledet, har ennå ikke testet. Disse resultatene tyder på at nye FGFR inhibitor terapi kan ha effekt på en undergruppe av tykktarmskreft drevet av
FGFR2
forsterkning
Citation. Mathur A, Ware C, Davis L, Gazdar A, Pan BS , Lutterbach B (2014)
FGFR2
forsterkes i NCI-H716 tykktarmskreft cellelinje og er nødvendig for vekst og overlevelse. PLoS ONE 9 (6): e98515. doi: 10,1371 /journal.pone.0098515
Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 14 februar 2014; Godkjent: 02.05.2014; Publisert: 26 juni 2014
Copyright: © 2014 Mathur et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Merck Research Labs. Den Funder gitt støtte i form av lønn for forfattere (AM, CW, LD, BP, BL), men ikke har noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
Konkurrerende interesser: Forfattere unntatt AG er ansatt i Merck Research Labs. AM, CW, LD, BP, og BL har konkurrerende interesser som ansatte i Merck, men erklærer at denne tilknytningen ikke endrer sin tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. Det er ingen restriksjoner på deling av data og /eller materialer.
Innledning
Avansert, er sent stadium kolorektal kreft forbundet med betydelig dødelighet og er fortsatt et udekket medisinsk behov. Tidlig diagnose resulterer i en svært gunstig prognose, slik at trinn 1 og trinn 2 sykdom har en 80-90% fem års overlevelse. I motsetning til dette stadium 3, og stadium 4 metastatisk sykdom er forbundet med fem års overlevelse på 60% og 8%, henholdsvis [1]. Genetiske avvik som oppstår i tidlig stadium sykdommen inkluderer
APC
mutasjoner, mens
KRAS, BRAF, p53
, og
PIK3CA
mutasjoner er funnet i senere stadier av svulst utvikling [2] – [4]. Imidlertid har disse genmutasjoner ikke påvirket behandling av tykktarmskreft fordi de er enten tap av funksjon mutasjoner (
APC, p53
) eller ikke er mottakelig for MEK eller PI3K hemmere (
BRAF, KRAS, PIK3CA
). Selv tyrosin kinase forsterkning, trans eller mutasjoner er ikke vanlig i tykktarmskreft,
EGFR
forsterkning kan bli funnet i en undergruppe av kolorektal kreft, [5], [6]. EGFR hemmende antistoffer som Cetuximab kan føre til reaksjoner og overlevelsesgevinst i
KRAS
hvete kreft, men rollen som
EGFR
forsterkning er ikke klart [7].
ErbB2
forsterkning er også blitt rapportert [6], [8], og kan være assosiert med responsen på trastuzumab [9].
FGFR2
amplifikasjon er beskrevet i 5% av magekreft [10] og 1-4% av brystkreft [11], [12], men har ikke blitt rapportert i tykktarmskreft. Bryst og magekreft cellelinjer husing
FGFR2
forsterkning er svært følsomme for
FGFR2
hemmere i prekliniske modeller [13] – [15], og forsterkning i både bryst- og magekreft er sterkt assosiert med dårlig differensierte, sent stadium svulster [11], [16]. I magekreft
FGFR2
forsterkning kan forekomme i en metastatisk svulst, men ikke i den tilhørende primærtumor, også i overensstemmelse med en rolle i metastatisk og sent stadium kreft [16], [17].
her definerer vi en ny
FGFR2
amplifikasjon i NCI-H716 kolorektal kreft cellelinje som er avledet fra ascites av et dårlig differensiert kolon adenokarsinom.
FGFR2
Geneamplifikasjon resultater i FGFR2 overekspresjon og konstitutiv aktivering. Viktigere, NCI-H716 cellevekst og overlevelse
in vitro Hotell og i en murine xenograft modell var avhengig av FGFR2. Immunhistokjemi avslørt
FGFR2
overekspresjon i en undergruppe av primær kreft i tykktarmen, men vi gjorde ikke observere forsterkning. Men disse arrays ikke inneholde ascites-avledet prøvene er representative for opprinnelsen til NCI-H716-celler. Selv
FGFR2
forsterkning og overekspresjon er sjeldne i tykktarmskreft, vår
in vitro Hotell og
in vivo
modeller tyder på at vekst FGFr hemmere kan ha effekt på en undergruppe av tykk- og endetarmskreft nærer denne forsterkning.
Materialer og metoder
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP og reagenser
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP var fra American Type Culture Collection (ATCC) og ble opprettholdt i RPMI pluss 10% kalvefoster serum og 100 ug /ml pennecilin /streptavidin (Sigma). PD173074 var fra Sigma (St Louis, MO). MK2461 var fra Merck [18].
FISH analyse
DNA FISH ble utført på NCI-H716 celler behandlet med colcemid (0,02 mikrogram /ml for 3 timer) og på microarray vev kjerner som beskrevet tidligere [19], [20] med bakteriell kunstig kromosom kloner RP11-62L18 for
FGFR2
sonder. Denne fisken sonde inneholder genomisk sekvens av Chr10: 123,224,100-123,398,498, som omfatter helheten av FGFR2 genet på Chr10: 123,237,844-123,353,481. Prober ble merket direkte med Spectrum Orange dUTP og Spectrum Grønn dUTP (Abbott Molecular Inc., Des Plaines, IL).
Immunohistochemistry
H80 antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California) var anvendt ved en fortynning på 1:50 i NCI-H716-xenograft og Asterand gastrisk kreft seksjoner og ved en 1:20 fortynning på oppstillings kjerner fra US Biomaks Inc. (Rockville, MD): CO802 (78 primære tumorer, 2 normal), CO702 ( 69 prøver-30 primære svulster, 25 lymfeknuter, 8 levermetastaser, 9 normal), CO992 (33 primære svulster og 33 lymfeknutemetastaser), BCO5115 (69 totalt, 60 primære svulster, 7 levermetastaser), I disse matriser, 20 pasientene var under 35 år. Farging ble utført på en Ventana Discovery XT bruker Rabbit Ultra-HRP. Deteksjon var med ChromoMap kit (Ventana Molecular Discovery Systems, Tucson, Arizona)
shRNA produksjon og infeksjon
shRNA sekvenser var:.
F1: GCCAACCTCTCGAACAGTATTCAAGAGATACTGTTCGAGAGGTTGGC, etter
F2: GGACTTGGTGTCATGCACCTTCAAGAGAGGTGCATGACACCAAGTCC
F3: GGACTGTAGACAGTGAAACTTCAAGAGAGTTTCACTGTCTACAGTCC
F4: GAGATTGAGGTTCTCTATATTCAAGAGATATAGAGAACCTCAATCTC
Luciferase: CACCGGTGTTGTAACAATATCGACGAATCGATATTGTTACAACACC
AAA. Egge: CACCGTCTCCACGCGCAGTACATTTCGAAAAATGTACTGCGCGTG
GAGACAAAA oligonukleotider ble glødet og 5’BbsI og 3 «Spel brukes til å klone inn en proprietær ENTR plasmid fulgt av konvertering til Plenti6 /Block-iT-MÅL (Invitrogen, Grand Island NY) ved hjelp av Gateway ( Invitrogen, Grand Island NY). Virus produksjon og titer besluttsomhet var som anvist av Invitrogen. For vekstanalyse ble cellene sådd ut ved 4000 celler /brønn i 96 brønners plater, mens for Western-analyse celler ble sådd på 40000 celler i 12 brønners plater. Virale supernatanter ble tilsatt i 20 timer i nærvær av 8 ug /ml polybren, ved hvilket punkt virale supernatantene ble fjernet og erstattet med vekstmedium inneholdende 10% føtalt bovint serum. Lysates var forberedt på western analyse 48 timer senere.
Compound behandling og vekstanalyser
PD173074 (Sigma, St. Louis MO) og MK2461 ble fortynnet i DMSO for å skape en titrering serie som tidligere beskrevet [ ,,,0],14]. Glivec, Lapatinib, PHS665753, og PD168393 var fra ChemieTek (Indianapolis IN) Anti IGF1R antistoff AF305 var fra R /D-systemer. Celler ble behandlet i triplikate brønner, og etter 3 dager celletall ble kvantifisert ved hjelp av Vialight reagens (Vialight assay kit, Cambrex, Rockland ME). Luminescence ble kvantifisert med en Topcount NXT HTS (Perkin Elmer, Waltham, MA) og IC50 bestemmelser gjort ved hjelp av logis 4 parameter kurvetilpasning. For kvantifisering av fosfotyrosin i FGFR2 og blotter ble skannet og kvantifisert ved hjelp av Imagequant programvare. Verdier som tilsvarer bandet intensitet ble plottet mot medikamentkonsentrasjon for å etablere en IC50 på medikament inhibering. ScanMAX profilering av 442 kinaser var på Ambit biovitenskap (San Diego, California).
Western blotting, immunoutfellingsstudier, antistoffer, og vekstfaktorer
Lysates ble utarbeidet i 30 mmol /L Tris-HCL, pH 7,5, 50 mmol /l NaCI, 5 mmol /l EDTA, 50 mmol /l NaF, 30 mmol /l Nappis, 1% Triton, 0,5% IGEPAL, 10% glyserol, 1 mmol /l vanadat, 1 mmol /l bpPhen (Calbiochem), og protease-inhibitor (Roche) og western-blotting og immunutfelling ble som beskrevet [21], [22]. Antistoffer mot FGFR2 inkludert N-terminale MAB6841 (R . D Systems (Minneapolis MN)
Flowcytometri
En Becton Dickinson FACS Calibur ble brukt for flowcytometri på NCI-H716-celler. Celler ble fiksert over natten i 1 ml iskald 70% etanol og deretter vasket i PBS og farget med PI /RNase (BD Pharmingen, San Diego) i 3 timer. ModFit programvare ble benyttet for å bestemme relative fordelingen i G1, S, G2 /M, og manuell gating å bestemme subG1 innhold.
Xenotransplantat
Animal studier ble gjennomført i henhold til IACUC (Institutional Animal Care og bruk Committee) retningslinjer og eksperimenter ble godkjent av Merck Research labs etiske komité. Systematisk overvåking og registrering av velferd mus ble ifølge ANKOMMER retningslinjer for utseende, størrelse, pels tilstand, holdning, ganglag, aktivitetsnivå, samspill med miljøet og kliniske tegn. Eutanasi ble coducted ved utsett av dyr til CO
2 til ble observert fullstendig opphør av pust i minimum 2 minutter (totalt ca 5 til 10 minutter). Dyrene ble inspisert visuelt for fravær av bevegelse og åndedrett. Døden ble også sikres ved fjerning av tumor vev eller flere organer.
5 × 10
6 NCI-H716-celler ble implantert subkutant i BALB /c nakne mus. Etter å ha nådd 200 mm
3, tumorer ble behandlet med bærer, 300 mg /kg eller 800 mg /kg, en gang daglig i 24 dager. 10 mus ble i hver gruppe, og tumorstørrelse ble bestemt ved kalibermåling. Ingen dyr opplevde større enn 5% vekttap i løpet av behandlingene. FGFR2, AKT, og ERK hemming
in vivo
ble målt ved dosering dyr og samle svulster på 4 og 24 timer etter behandling. Svulster ble plassert i flytende nitrogen og behandlet ved avbrudd i 600 ul lyseringsbuffer i et vev lyzer (Qiagen). Lysates ble kvantifisert og behandlet for SDS-PAGE og western blotting som beskrevet for cellelysatene.
Resultater
FGFR2
forsterkes, og aktivert i NCI-H716 celler
Fordi
FGFR2
forsterkning kan kjøre mage og bryst kreft celle vekst, søkte vi etter flere cellelinjer som havn lignende
FGFR2
kopiere gevinst. DNA-mikromatriser bekreftet kjent
FGFR2
forsterkning i KATOIII og SNU16 mage kreft cellelinjer [23], [24] og identifisert en roman svært samlings forsterkning i NCI-H716 tykktarmskreft cellelinje (figur S1A i File S1. den Oncomine database [25] også avdekket høy
FGFR2
messager RNA uttrykk i NCI-H716-celler. Fluorescent in situ hybridisering (FISH) viste påfallende
FGFR2
kopiere gevinst og genduplikasjon i homogent flekker regioner (figur 1A). den grønne cent probe ikke avsløre kopi gevinst, i samsvar med den svært fokus amplicon på
FGFR2
locus (figur S1A i File S1). A FISH probe for
Met
viste ingen kopi gevinst i NCI-H716 på kromosom 7 locus, og
FGFR2
sonde viste ikke forsterkning i DLD1 tykktarmskreftceller mangler
FGFR2
kopiere gevinst (data ikke vist). Vi deretter sammenlignet
FGFR2
uttrykk og aktivering i NCI-H716-celler i forhold til et panel av ni tykktarmskreft cellelinjer uten
FGFR2
forsterkning, og vi fant slående FGFR2 overekspresjon og fosforylering bare i NCI-H716 -celler (figur 1B). FGF2 ikke lenger aktivere FGFR2 i NCI-H716-celler, avslørende at reseptoren er maksimalt fosforylert (data ikke vist). Nivået av FGFR2 aktivering i NCI-H716-celler var lik nivået i
FGFR2
forsterket SNU16 magekreft cellelinje (Figur S2 i File S1). Vi konkluderer med at i vårt panel av tykktarmskreft cellelinjer som
FGFR2
er sterkt overuttrykt og aktiveres kun i NCI-H716-celler.
A. NCI-H716-celler ble behandlet med colcemid (0,02 ug /ml i 3 timer), fiksert med metanol /eddiksyre, og slippes på et objektglass i samsvar med materialer og metoder. Bakteriell kunstig kromosom klone RP11-62L18 var merket med Spectrum Orange dUTP og en cent sonde ble merket med Spectrum Grønn dUTP (Abbott Molecular Inc., Des Plaines, IL) og hybridisert til faste celler. Rødt indikerer
FGFR2 Hotell og grønn indikerer cent. B. FGFR2 er overuttrykt og inneholder høye nivåer av tyrosinfosforylering i NCI-H716 cellelinje. A, Cellelysater (fremstilt i henhold til Materialer og Metoder) fra ubehandlet eller FGF2 behandlede (30 ng /ml, 5 minutter) ble cellene lysert og proteinkonsentrasjonen ble bestemt med BCA-kit (Pierce Thermo Fisher Rockford Ill). Lik lysat mengder (50 ug) ble utsatt for SDS-PAGE og western blotting med FGFR2 antistoffer gjort mot N-terminalen (H80. MAB6841), C terminus (C20) og aktivering sløyfe fosforylering Y653 /654 (3471, p-FGFR2) og Actin.
FGFR2 er nødvendig for vekst av NCI-H716 celler
FGFR2
forsterkning og aktivering i NCI-H716 celler foreslåtte denne kinase kan være nødvendig for celle vekst. Vi behandlet NCI-H716-celler med to FGFr lite molekyl hemmere for å teste en rolle for FGFR2 i NCI-H716 cellevekst. I et stort panel av kinses, fant vi PD173074 å være en meget selektiv inhibitor av FGFR-1, -2, -3 [14], og vi bekreftet ytterligere bemerkelsesverdig selektivitet her med et separat stort panel av kinaser (fig S3 i File S1). Vi behandlet også celler med MK2461, en Met kinase lite molekyl hemmer som også hemmer FGFR2 fosforylering og vekst av
FGFR2
forsterket mage og brystkreftcellelinjer [13]. PD173074 og MK2461 potent hemmet FGFR2 fosforylering i NCI-H716-celler (figur 2A) med en IC50 på 18 nM (PD173074) og 165 nM (MK2461, figur S4A i File S1). Begge forbindelser som potent inhiberer NCI-H716 vekst med IC50-verdier på 25 nM for PD173074 og 130 nM for MK2461 (figur 2B). Viktigere, IC50 for veksthemming og FGFR2 fosforylering hemming var lik, og begge verdiene var også lik verdiene tidligere innhentet for SNU16 og KATOIII cellelinjer [13], [14]. Etter å ha observert potent hemming av NCI-H716 cellevekst, vi neste testet begge forbindelser for hemning i et panel av tykktarmskreft cellelinjer. Begge FGFr inhibitorer vist en slående selektivitet for hemming av NCI-H716-celler, med mer enn 80 ganger (MK2461) eller 400 ganger (PD173074) lavere IC50 forhold til ikke-
FGFR2
forsterket kolon cellelinjer ( Figur 2C). Den FGFR-inhibitoren AZD4547 også selektivt hemmet vekst i NCI-H716-celler (data ikke vist). Til slutt, NCI-H716 vekst ble ikke hemmet av behandling med kinase inhibitor forbindelser mangler FGFR hemming, inkludert Tarceva, Lapatinib, Glivec, PHA665752 (en Met hemmer) PD168393 (en irreversibel EGFR-hemmer) og en IGF1R hemmende antistoff (Figur S4B i File S1 ).
A. PD173074 og MK2461 hemme FGFR2 fosforylering. Celler ble behandlet i en time med en titrering av PD173074 som beskrevet i Materialer og metoder. Lysater ble fremstilt og 50 ug protein ble underkastet SDS-PAGE og western blotting med fosfo Y653 /654 FGFR og MAB6841 total FGFR2 antistoff. B. PD173074 og MK2461 hemme NCI-H716 cellevekst. Cellelinjer ble platet ut ved 4000 celler /brønn og inkubert over natten. NCI-H716-celler ble behandlet med en titrering av PD173074 som beskrevet i Materialer og Metoder. Cellevekst ble målt med Vialight reagent, og veksten ble presentert i forhold til ubehandlede celler. C. PD173074 og MK2461 selektivt hemme veksten av NCI-H716-celler. Kolon cancer cellelinjer oppført ble sådd ut ved 4000 celler /brønn og 24 timer senere ble behandlet med en titrering av forbindelser. 4 dager senere ble cellevekst målt med vialight og IC50s ble beregnet ut fra grafen pute prisme. D.
FGFR2
shRNA avtar FGFR2 protein i NCI-H716-celler.
FGFR2
shRNA ble utarbeidet og NCI-H716-celler ble infisert som beskrevet i metodene. Venstre ble FGFR2 uttrykk analysert med fosfor Y653 /654 og total protein med MAB6841. E. Vekst ble analysert 5 dager etter infeksjon med Vialight reagens.
Vi har bekreftet ytterligere en avgjørende rolle for FGFR2 i NCI-H716 cellevekst ved hjelp av
FGFR2
shRNA. Vi først identifisert to hårnåler (F2 og F4, figur 2D) med effektiv
FGFR2
knockdown. Disse shRNA hårnåler forårsaket potent veksthemming i NCI-H716-celler (figur 2E). I motsetning kontroll shRNA og shRNA som ikke redusere FGFR2 protein nivåer (V og F1) ikke hemme veksten av NCI-H716-celler (figur 2D, E).
Flere signalanlegg proteiner inkludert AKT, ERK og NFkB aktiveres av FGFR2
Vi har tidligere rapportert at
FGFR2
aktivert AKT og ERK signalveier i FGFR2 forsterket magekreft cellelinjer [14]. Vi definerte derfor FGFR2 signalnettverk i NCI-H716-celler ved å analysere fosforylering av flere adapter proteiner og signalveier etter FGFR2 hemming. Etter to timers behandling med en titrering av MK2461 og PD173074 observerte vi tap av fosforylering i kinase-adapter proteiner GAB1 /2, FRS1 /2, og SHC. Vi har også observert tap av ERK og AKT fosforylering (figur 3A). Interessant, mål nedstrøms AKT og ERK som PRAS40 og S235 /236 i S6RP (og S9 i GSKIII, data ikke vist) forble fosforylert på to timers endepunktet. Vi neste anlayzed hemming av AKT og ERK mål på senere tidspunkter etter behandling med 100 nM PD173074. Vi har også undersøkt flere andre veier for å avgjøre om forsinkede kinetikk av hemming ble også forekommende. I motsetning til den 2 timers endepunktet, ble både S6RP og PRAS40 fosforylering sterkt inhibert 12 timer etter tilsetning forbindelsen (figur 3B). Vi har også funnet en lignende forsinket hemming av serin-933 fosforylering i NFkB P105, noe som tyder på at NFkB signalering er en del av NCI-H716 vekst (Figur 3B). NFkB P50 og P105 proteinnivåer ble redusert bare på 72 timer. Mens hemming 12 timer etter behandling kan resultere fra en utvidet halveringstid av signaliseringsproteiner, inhibering ved senere tidspunkter, for eksempel 72 timer kan være sekundære til vekstinhibering (og celledød som beskrevet nedenfor i figur 4). CRKII Y221, AMPK t172, og PDK1 S241 ble hemmet bare på 48-72 timer etter behandling, igjen tyder på at tap av disse nettstedene kan være sekundært til veksthemming. CRKII, gjorde AMPK, og PDK proteinnivåer reduseres ikke under utdanning (data ikke vist). Til slutt, andre steder som GSKIII S9 (en AKT fosforylering stedet), PKC S660, RSK S227 (en PDK1 fosforylering stedet) forble fosforylert selv etter 72 timer (Figur 3B). Dette resultatet viser at PDK1 fortsatt aktiv og i stand til å fosforylere målområder tross celleveksthemming. Selv om S227 PDK1 fosforylering nettsted på RSK ikke ble hemmet, den ERK-fosforylering nettstedet serin-359 /363was hemmet innen 2 timer PD173074 behandling (figur S5 i File S1). GSKSIII serin-9 også forble fosforyleres ved senere tidspunkter, og det kan være mulig at andre kinaser bortsett fra AKT opprettholde fosforylering på dette området. Til slutt, fordi MEK hemming påvirket NCI-H716 vekst, vi videre definert MEK signale nettverket med 100 nM av allosterisk MEK hemmer PD0325901 [26]. Serine-933 i P105 NFkB og serin-265 i FRA1 er beskrevet som ERK fosforyleringsseter og vi konstatert tap av disse områdene. Serine-235/236 i S6RP er også en MEK mål i NCI-H716-celler (Figur 3C). Vi konkluderer med at FGFR2 inhibering resulterte i et bifasisk mønster av pathway inhibering, med ERK- og AKT inhiberes ved tidlige tidspunkter, mens PRAS40, S6RP, og transkripsjonsfaktorer slik som NFkB P105 viste en forsinket inhibering. Andre signalerings proteiner som PDK1 og PKC-isoformer forble fosforyleres selv ved senere tidspunkter. Imidlertid er det fortsatt mulig at til tross for fosforylering proteiner slik som PKC-isoformer kan være inaktive på grunn av andre faktorer som for eksempel celle mislocalization. Samlet advarer disse resultatene at analyse av en signalnettverk bare på tidlige tidspunkter etter hemmer behandling ikke kan fullt ut definere omfanget av signal effektorer.
A. Lysater som brukes i fig. 2A ble analysert ved western blotting for fosforylerte eller totale proteiner etter en 2-timers behandling med den angitte forbindelse titrering. «P» indikerer phosphoprotein, og fosforyleringsseter er oppført i metoder. B. Tid løpet av hemming for flere signalproteiner. NCI-H716-celler ble behandlet med 100 nM PD173074 i de angitte tidsrom og signalveier ble analysert ved SDS-PAGE og Western blotting. 100 nM PD173074 ble valgt fordi dette beløpet skyldes fulle hemming av ekstra fordel på 2 timers tidspunkt. «P» indikerer phosphoprotein, og fosforyleringsseter er oppført i metoder. Terminologi på høyre side av figur grupper proteiner i henhold til den tid ved hvilken inhibering eller protein tap oppstår. C. NCI-H716-celler ble behandlet med 100 nM PD0325901 for den angitte tid. Lysates var forberedt på SDS PAGE og western blotting med de angitte antistoffer. D. NCI-H716-celler belagt på 4000 celler /brønn ble behandlet 24 timer senere med en uM L-547 (Akti), 100 nM PD0325901 (Meki), 5 nM Rapamycin (rapamycin), 100 nM PD173074, eller 1,5 uM MK2461, eller den angitte kombinasjoner. Etter 5 dager forbindelse og media ble fjernet og erstattet med frisk media og forbindelsen. Etter ytterligere 5 dager (10 dagers total analyse) relative cellevekst ble bestemt ved bruk Vialight reagens.
A. Lysates fra 3B avslører økt PARP cleavage. Fosfo S6RP er inkludert som referanse og GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. B. Cellesyklus profil av behandlede celler. 1 × 10exp6 NCI-H716-celler ble behandlet med 100 nM PD173074, MEK inhibitor (100 nM) eller MEK + AKT inhibitor (L-547, en UM) eller DMSO (ubehandlet) ble isolert på angitte tidspunkter og behandlet for propidium jodid farging og FACS-analyse, som beskrevet i Materialer og metoder. B. indikerer en tabell representasjon av cellesyklus profiler som bestemmes ved manuell gating for G1, S, G2 /M og subG1 områder. C er cellesyklus profiler.
Kombinert hemming av AKT og ERK er nødvendig for å full hemme NCI-H716 vekst
I NCI-H716 celler ERK, AKT og S6RP fosforylering krever FGFR2 og vi neste brukte selektive allosteriske inhibitorer av MEK, AKT, og mTOR for å definere rollen til disse baner i NCI-H716 vekst. Selv om MEK-inhibitor PD0325901 redusert NCI-H716 vekst med en IC50 på 60 +/- 14 nM, et tidsforløp viste at NCI-H716-celler forble i progressiv vekst (figur 3D, turkis linje). Vi fant ut at en um AKT inhibitor L-547 eller 5 nM rapamycin alene eller i kombinasjon hadde bare mindre effekter på vekst til tross for sterk hemming av AKT og S6RP fosforylering (figur S6 i File S1). I motsetning til dette, en kombinasjon av AKT-inhibitor og MEK-inhibitor blokkerte vekst og forårsaket en reduksjon i celletall lik FGFR hemning (figur 3D). Derfor både AKT og ERK er kritiske effektorer av FGFR2 i NCI-H716-celler. I motsetning til dette en blanding av MEK inhibering og rapamycin var ikke bedre enn MEK-hemning alene. Dette er i overensstemmelse med våre biokjemiske resultater (figur 3C) som S6RP er nedstrøms av MEK i denne cellelinje, slik at ERK inhibering allerede fører til hemming av S6RP. I tillegg er mangelen på en fenotype med rapamycin antyder at flere effektorer av ERK skal bli inhibert i kombinasjon for å etterligne veksthemming observert med MEK-inhibitor.
Apoptose er en mekanisme for veksthemming
utgangs~~POS=TRUNC ble redusert i celler behandlet med PD173074 og med AKT og MEK-inhibitor kombinasjon, noe som tyder disse inhibitorene forårsaket celledød. Spaltes PARP, en markør for apoptose, var sterkt indusert etter PD173074 behandlingen (figur 4A) og med MK2461 (ikke vist). Flowcytometri og cellesyklus innhold viste veksthemming etter 24 timers behandling med FGFR inhibitorer eller MEK /AKT-inhibitor kombinasjoner som vist i tap av S-fasen populasjonen (figur 4B, C) ved 48 timer og senere tidspunkter på vekststans ble fulgt ved fremtredende induksjon av en subG1 befolkning. Faktisk 4 dager etter behandling representerte subG1 fraksjon halvdel av cellepopulasjonen. I motsetning til dette, nedsatt MEK-hemning celler i S-fasen etter 24 timer, men heller ikke elimineres S-faseceller ved senere tidspunkter heller ikke forårsaket lignende fremtredende celledød (figur 4B, C). Endelig bilder av NCI-H716 celler avslører utbredt celle fragmentering etter 72 timers behandling med PD173074 eller en uM MK2461, i samsvar med celledød (figur S7 i File S1). Disse resultatene viser at NCI-H716 celle overlevelse er avhengig av FGFR2, og støtter også tidligere dokumentert at både AKT og ERK aktivitet er nødvendig for å overleve.
FGFR2 er nødvendig for NCI-H716 xenograft tumorvekst
Potent NCI-H716 følsomhet for FGFr hemmere
in vitro
antydet at xenograft tumorvekst kan også bli hemmet
in vivo
. NCI-H716 ble avledet fra en ascites, og i samsvar med tilpasning til dette miljøet, prolifererer cellelinjen fristilt i suspensjon. Vi forsøkte derfor å skape en ascites-modell ved hjelp av luciferase som uttrykker NCI-H716-celler injisert inn i bukhulen. Imidlertid luciferase avbildning viste en mangel på tumorcelle ekspansjon (data ikke vist). Vi har derfor testet for tumorvekst-inhibering i en standard subkutan xenograft modell. Fordi PD173074 har dårlig farmakokinetiske egenskaper, behandlet vi mus med MK2461. Når tumorer nådde 200 mm
3 i størrelse, MK2461 ble dosert en gang daglig (QD) ved enten 300 eller 800 mg /kg. I løpet av 21 dagers studie, 800 mg /kg behandling forårsaket fullstendig inhibering av tumorvekst, mens 300 mg /kg resulterte i partiell inhibering som ikke var statistisk signifikant (figur 5A). Verken dose resulterte i vekttap på over 5% (data ikke vist). Både høye og lave doser av MK2461 forårsaket fullstendig inhibering av FGFR2, ERK, og AKT-fosforylering i tumorer 2 timer etter dosering (figur 5B). Imidlertid, ved 23 timer etter dosering, bare den dose på 800 mg /kg hadde signifikant inhibering av FGFR2 og ERK-fosforylering. Den manglende evne /dose 300 mg kg for å forårsake kontinuerlig hemming av FGFR2 og ERK signal kan forklare mangelen på tilhørende effekt. Selv om 800 mg /kg forårsaket fullstendig veksthemming, ble det ikke spaltet PARP observert
in vivo
, i motsetning til
in vitro
behandling med MK2461 (data ikke vist). Mangelen på spaltet PARP
in vivo
er også i samsvar med fraværet av regresjon i xenograft modell, og kan resultere fra en mangel på potent hemming av AKT-fosforylering. For eksempel, når bare ERK var robust hemmet
in vitro plakater (med MEK hemmer PD0325901), det ble redusert vekst, men ikke celledød. Derfor er mangelen på potente AKT-inhibering kan forklare hvorfor regresjon ikke ble observert i xenograft modell. Årsaken til manglende AKT hemming
in vivo
er ikke klart, men kan potensielt skyldes kompenserende sti aktivering av endogene musevekstfaktorer eller cytokiner som ikke finnes i vev kultur media.
A. 5 x 10exp6 NCI-H716-celler ble implantert subkutant i Balb /c nakne mus og behandlet med MK2461 på enten 300 mg /kg eller 800 mg /kg på en gang daglig doseringsregime. Relativ tumorvekst er angitt på Y-aksen. B. tumorbærende mus ble behandlet med en enkelt dose av MK2461 ved enten 300 mg /kg eller 800 mg /kg. Svulster ble isolert på enten 4 eller 24 timer etter behandling, og plassert i flytende nitrogen. Tumorer ble bearbeidet ved anvendelse av vev lyzer (Qiagen) som beskrevet i materialer og metoder, og analysert ved hjelp av SDS-PAGE og western blotting med det angitte fosfor og total-antistoffer.
FGFR2 overekspresjon men ikke forsterkning er funnet i en undergruppe av primær kreft i tykktarmen og lymfeknutemetastaser
Vi definerte utbredelsen av FGFR2 overekspresjon og forsterkning i primær kreft i tykktarmen ved hjelp av immunhistokjemi (IHC) for FGFR2 uttrykk og FISH for
FGFR2
forsterkning. Fordi det er presedens for selektiv
FGFR2
forsterkning i en metastase, men ikke i den primære svulsten vi også analysert 15 leveren og 58 lymfeknutemetastaser sammen med tilhørende primære svulster. Fordi tidligere beskrevne C-terminus-antistoffer ikke skal finne de FGFR2 isoformer i NCI-H716-celler ved western blotting eller IHC (data ikke vist), optimalisert vi IHC-farging med den N-terminale H80 antistoff. Vi bekreftet sterk IHC reaktivitet i NCI-H716 xenograft og med en
FGFR2
forsterket magekreft tumor (figur 6).
