Abstract
Bakgrunn
T lymfom invasjon og metastase 1 (Tiam1) er en potensiell modifier for tumorutvikling og progresjon. Vår tidligere studie in vitro og i hårløse mus foreslo en kampanje rolle Tiam1 på invasjon og metastasering av tykktarmskreft (CRC). I denne studien, genererte vi Tiam1 /C1199-CopGFP transgene mus for å undersøke tumorigenetic, invasive og metastatisk endringer i tykktarm og endetarm av villtype og Tiam1 transgene mus etter 1,2-dimetylhydrazin (DMH) behandling.
Metoder
Transgene mus ble produsert ved fremgangsmåten ifølge pronuclear microinlectlon. Hele kroppen fluorescens imaging (Lighttools, Edmonton, Alberta, Canada), PCR, og immunhistokjemiske teknikker (IHC) ble anvendt sekvensielt for å identifisere de transgene mus. Den kreftfremkallende DMH (20 mg /kg) ble brukt til å indusere tykktarmssvulster om intraperitoneal (ip) injeksjoner en gang i uken i 24 uker fra 4 ukers alder på Tiam1 transgene eller ikke-transgene mus.
Resultater
Vi vellykket generert Tiam1 /C1199-CopGFP transgene mus og induserte primære svulster i tarmen hos både villtype og Tiam1 transgene mus ved DMH behandling. I tillegg Tiam1 transgene mus utviklet større og mer aggressiv svulst enn villtype-mus. Videre immunhistokjemisk farging viste at oppregulering av Tiam1 var korrelert med økt uttrykk av β-catenin og vimentin, og nedregulering av E-cadherin i disse musene.
Konklusjoner
Vår undersøkelse har gitt in vivo bevis som støtter at Tiam1 fremmer invasjon og metastasering av CRC, mest sannsynlig gjennom aktivering av Wnt /β-catenin signalveien, i en Tiam1 transgen musemodell
Citation. Yu LN, Zhang QL, Li X, Hua X Cui YM, Zhang NJ, et al. (2013) Tiam1 gene mus Visning Økt Tumor invasiv og metastatisk potensial tykktarmskreft etter 1,2-dimetylhydrazin Treatment. PLoS ONE 8 (9): e73077. doi: 10,1371 /journal.pone.0073077
Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: 21 juni 2013; Godkjent: 14 juli 2013; Publisert: 12. september 2013
Copyright: © 2013 Yu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av stiftelsen Natural Science of China (nos: 81001111, 81071735, 30901791) og Foundation Natural Science of Guangdong (S2011040003696) .Den finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) bidrar den tredje mest krefttypen i den vestlige verden. . Tilbakefall og metastasering er de viktigste årsakene til dødsfall av CRC. Om lag 50 prosent av pasienter med CRC vil dø på grunn av komplikasjoner av metastaser. Selv om forskere har identifisert flere gener som er ansvarlig for utviklingen av CRC, molekylære hendelser som er involvert i de komplekse prosesser av CRC metastase fortsatt i stor grad ukjent.
T lymfom invasjon og metastase 1 (Tiam1), en guanin nukleotid utveksling faktor som selektivt aktiverer Rho-lignende GTPase Rac, ble opprinnelig identifisert som en invasjon-induserende og metastase-induserende gen i T lymfomceller [1]. Tiam1 er en potensiell modifier startfasen og progresjon. Det ble påvist å være involvert i Rac-regulering av aktin polymerisasjon, celleadhesjon og motilitet, celleoverlevelse og cellesyklusprogresjon [2], [3]. Imidlertid har undersøkelser antydet at Tiam1 har motsatt effekt på forskjellige kreftformer. Noen studier har vist at oppregulering av Tiam1 er korrelert til aggressiv oppførsel av human kreft og dårlig klinisk resultat for pasienter i flere typer av maligne tumorer, slik som brystkreft, tykktarmskreft, prostatakreft, leverkreft, nasofaryngeal karsinom, samt esophageal squamous karsinom (ESCC) [4], [5], [6], [7], [8], [9]. Mens omvendt, forsterker Tiam1 homotypisk celle-celle adhesjon og hemmer invasjon i nyrecellekreft celler [10]. I tillegg spiller Tiam1 en invasjon-suppressor rolle i Madin-Darby kaninnyre (MDCK) celler [11]. En Tiam1 knock-out mus er relativt motstandsdyktig mot kjemisk induksjon av hudkreft [12]. I vev-konstruert menneskelig hud, Tiam1 reduksjon i dermale fibroblaster ført til økt invasivitet av epidermale keratinocytter med premaligne funksjoner [13].
Vår tidligere studie viste at Tiam1 ble oppregulert i CRC vev og høyt uttrykk nivå av Tiam1 ble nært forbundet med aggressiv og metastatisk potensial i CRC. Stanse av Tiam1 i CRC cellelinjer resulterte i hemming av celle migrasjon og invasjon in vitro, og metastase i nakne mus [9]. For bedre å forstå hvilken rolle og mekanismen for Tiam1 i utviklingen av CRC, genererte vi pCDFl-Tiaml-copGFP transgene mus og undersøkt påvirkning av Tiaml på utviklingen av karsinomer i tykktarmen og endetarmen som ble forårsaket av den kjemiske kreftfremkallende (DMH ), i kombinasjon med histologiske observasjon av lokal invasjon og fjernmetastaser.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk av Southern Medical University (Permit Number: scxK2007 – 0005). Alle operasjoner ble utført under natrium pentobarbital anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
Generering av Tiam1 /C1199-CopGFP transgene mus
full-lengde cDNA av Tiam1 fra C1199 ble klonet inn i lentivirus vektor pCDF1-CopGFP. Transgene mus ble produsert ved fremgangsmåten ifølge pronuclear microinlectlon. Totalt 60 super-eggløsning og 33 pseudo-gravid ICR mus ble benyttet i forsøket. Lentivirus inneholder TIAM1 /EGFP genet ble microinjected inn pronukleus av hvert embryo. Embryoet ble dyrket i 72 timer i FHM mellomstore og morula-trinns embryoene ble overført til egglederne av 0-5 dag etter samleie pseudopregnant. Mus var gravid, og valpene ble levert på 20-21 dager.
Identifikasjon av Tiam1 /EGFP transgene mus
Normal ICR mus ble brukt som kontroll. Hele kroppen fluorescens imaging (Lighttools, Edmonton, Alberta, Canada), PCR, og immunhistokjemiske teknikker (IHC) ble anvendt sekvensielt for å identifisere de transgene mus. Transgene mus og deres ikke-transgene kull dyr ble genotypet ved PCR ved anvendelse av de følgende primere for Tiam1: 5 «AAGACGTACTCAGGCCATGTCC 3» og 5 «GACCCAAATGTCGCAGTCAG 3». Genomisk DNA ble fremstilt fra musehale biopsier. PCR Temperaturprofilen var 94 ° C i 45 s, 58 ° C i 45 s, og 72 ° C i 45 s med forlengelse av den siste syklus i 10 min ved 72 ° C. PCR-produktene ble analysert ved agarosegel-elektroforese med etidiumbromid under UV-lys. PCR-analyse viste at 60 av de 124 dyrene var transgene. IHC ble utført som tidligere beskrevet [9]. Kanin polyklonale antistoff mot Tiam1 (Santa Cruz, CA, USA, fortynning 1: 200), mus anti-β-catenin (BD, MO, 1: 500), mus anti-E-cadherin (BD, MO, 1: 500) , mus anti-vimentin (Cell Signaling Technology, PO, 1: 200) ble brukt
RNA ekstraksjon og revers transkripsjon-PCR (RT-PCR)
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp Trizol reagens. (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. De RNAwas forbehandles med DNase og brukes for cDNAsynthesis med tilfeldige heksamer. MRNA fra Tiam1 ble PCR-amplifisert fra cDNA-prøver av transgene mus og ikke-transgene dyr. De følgende primere ble anvendt for amplifikasjon av Tiam1: forstand primer, 5-AAGACGrACTCAGGCCATGTCC-3; antisense-primer, 5-GACCCAAATGTCGCAGTCA-3. Glyseraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase ble amplifisert som en intern kontroll ved hjelp av forstand primer, 5-AATCCCATCACCATCTTCCA-3, og antisense-primer, 5-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3. Den riktige størrelsen på PCR-produkter ble bekreftet ved agarosegelelektroforese.
Behandling med DMH
For å undersøke effekten av Tiam1 på tykktarmskreft utvikling og progresjon, Tiam1 transgene og ikke-transgen mus ble randomisert i to -grupper, respektivt, ble behandlet enten med DMH (testgruppene) eller ikke (kontroll grupper). Kontrollgrupper 1 og 2 ble gitt 0,1 ml PBS i.p. en gang i uken i 10 uker. Testgruppene fikk kreftfremkallende DMH (20 mg /kg) gjennom intraperitoneal (i.p.) injeksjoner en gang i uken i 24 uker fra fylte 4 uker på Tiam1 transgene eller ikke-transgene mus. Alle musene hadde fri tilgang til vann fra springen og en standard diett. Alle dyrene ble observert daglig for kliniske tegn på dårlig helse.
Resultater
Generation og identifisering av Tiam1 /EGFP gene mus
I alt 823 egg ble hentet fra 60 super-eggløsning mus. Den Tiam1-EGFP rekombinert lentivirus ble mikroinjisert inn i perivitelline plass av 628 egg, som deretter ble overført til 33 ICR-pseudo-gravide mus. 21 av de 33 pseudopregnant musene ble impregnert. 67 potensielle Tiam1 /EGFP transgene mus ble født. Fem positive Tiam1-EGFP transgene mus, identifisert som F0-17 (♂), F0-36 (♀), F0-48 (♂), F0-52 (♀) og F0-61 (♀), ble generert av pro kjernefysiske perler mikroinjeksjon teknikk. Totalt 44 positive F1 (figur S1) og 146 positive F2 Tiam1 transgene mus ble generert av F0-36 (♀) og F0-48 (♂). Alle de positive Tiam1 genet PCR sekvenser ble matchet til Tiam1 gensekvensen som er tilgjengelig fra NCBI (data ikke vist).
Hele kroppen fluorescens bildebehandling viste sterk GFP signal i organer i F1 homozygot Tiam1 /EGFP transgene mus, inkludert tykktarm, mage, lunge, nyre og tesis (figur 1A). Frosne delen av disse organer fra EGFP transgene mus viser også sterk GFP signa (figur 1B). Det ble imidlertid ikke noe signal eller bare svakt signal ble observert i villtype mus (figur 1A og 1B). Immunhistokjemisk analyse ved anvendelse av et kanin-anti-humant antistoff Tiam1 bekreftet at det humane proteinet Tiam1 ble sterkt uttrykt i kolon av Tiam1 transgene mus, mens det bare ble svakt påvist i villtype mus (figur 1C).
( A og B) Observasjon av EGFP og Tiam1 ekspresjon i differente organer (A) og tilsvarende frosne seksjoner (B) fra pCDFl-Tiaml-copGFP transgene (Tg) mus og villtype (WT) mus ved en hel-legeme fluorescens bildesystem . (C) Påvisning av Tiaml protein i tykktarmen av pCDFl-Tiaml-copGFP transgene mus og villtype mus gjennom immunhistokjemi flekker. (D) Påvisning av Tiaml mRNA i tykktarmen av 10 pCDFl-Tiaml-copGFP transgene mus og 1 villtype mus gjennom RT-PCR.
uttrykk for menneskelig Tiam1 mRNA i tykktarmen ble analysert ved RT-PCR og kunne bare påvises i Tiam1 transgene mus med β-Actin benyttet som et uttrykk kontroll (figur 1D). Behandling med DMH induserte ikke ekspresjon av endogene Tiam1 på mRNA-nivået, hverken i transgene dyr og heller ikke i deres ikke-transgene kullsøsken (data ikke vist).
Effekt av pCDFl-Tiaml-copGFP på DMH-indusert tumorgenese
Åtte uker etter DMH-behandling, hyperplasi av lymfoid vev i mesenteriet og tarmveggen i begge pCDFl-Tiaml-copGFP (3/5) og ikke-transgene kullsøsken (2/5) ble observert. Hyperrugosity i kolorektal slimhinner og fortykkelse av tarmepitelet skjedde i både transgen (4/5) og hvete gruppe mus (3/5) ved 12 uker etter DMH-behandling. 16 uker senere, ble kolorektal adenom observert i både transgen (2/5) og hvete gruppe mus (1/5). 20 uker senere skjedde kolorektal tumor i begge transgene (1/6) og villtype-gruppe mus (1/6) som ble histologisk diagnostisert som kolorektal adenokarsinom (tabell 1). Etter DMH-behandling, 21/21 (100%) Tiam1 transgene mus og 18/21 (85,7%) ikke-transgene søsken utviklet svulster innen 32 uker (tabell 1). Figur 2A og 2C viste representanten makro-lesjoner og histologiske endringer (av H E flekker) forekom på mus kolon på tilsvarende tidspunkt. Rektal prolaps ble observert i 52,4% (11/21) av Tiam1 transgene mus (figur 2B).
(A) Representative Tumorer induseres under DMH behandling i tykktarm og endetarm fra villtype (WT) (øvre panel) og Tiaml transgene (Tg) dyr (nedre panel) ved forskjellige tidspunkter. (B) Rektal prolaps (pil) i en Tiaml transgen (TG) mus. (C) HE farging av representative tumorlesjoner i tykktarmen og endetarmen av villtype (WT) (øvre panel) ved ulike tidspunkt.
Det store flertallet av svulstene som finnes i kolon ble plassert på 1 til 8 cm fra anus (figur 3A). I begge genotypene ble ingen tumorer funnet i tynntarmen. Svulsten Forekomsten og svulsten antall per dyr ble ikke påvirket av Tiam1, som ble analysert ved 20 uker, 24 uker og 32 uker etter behandling DMH (data ikke vist). Men da gjennomsnittlig tumorvolumer ble analysert på 29 tumorer er valgt tilfeldig fra hver av de to grupper, var en signifikant økt tumorstørrelse ble observert i Tiam1 transgene mus (figur 3B og tabell 2) med et gjennomsnittlig tumorvolum (23.260 ± 2,119 mm
3) 4,7 ganger høyere (P . 0,001) enn i villtype mus (4,929 ± 0,580 mm
3)
(A) Fordeling av kolorektal tumorer i mus etter DMH behandling. (B) Sammenligning av volumet av kolorektal svulst i transgene mus og villtype mus.
Effekt av pCDFl-Tiaml-copGFP på invasiv og metastatisk evne DMH indusert CRC
for å bestemme innholdet av kolorektal massene, undersøkte vi svulstene bruker histologiske metoder. Ved mikroskopisk analyse, i de ikke-transgene mus, de fleste av tumorene utviklet under DMH behandling vises lesjoner med bare begrenset dybde av neoplastisk invasjon. Slik det ble vist i figur 4A-B, den neoplastiske kolonepitelet dannet en plaque-lignende masse som ble adskilt fra den tilstøtende normal slimhinne. De neoplastiske kjertler forlenget inn i og gjennom submucosa, men ikke tilstøtende muskel veggen.
(A-B) Svulster utviklet under DMH behandlings vist lesjoner med bare begrenset dybde av neoplastisk invasjon. De neoplastiske kjertler forlenget inn i og gjennom submucosa, men ikke tilstøtende muskel veggen. (C-F) Tiaml transgene mus inneholdt mer aggressive tumorer og vist dypere penetrasjon av neoplastiske celler i en muskel laget, såvel som lymfeknute i tarmveggen (G-H).
I samsvar med den større volum av tumoren utviklet under DMH behandling, Tiaml transgene mus inneholdt også mer aggressive tumorer og vist dypere penetrasjon av neoplastiske celler i muskelen lag (figur 4C-F), så vel som lymfeknute i tarmveggen (figur 4G-H) , hvor de dannet distinkte kjertler, sammenlignet med ikke-transgene kullsøsken. Disse aggressive svulster invadert fritt gjennom alle lagene i tarmen danner store mucin fylte kjertler.
I tillegg til lokale invasjon og node vev engasjement lymfe, Tiaml transgene mus også generert svulster spredt seg til fjerne steder, inkludert peritoneum, lever og lunge (Figur 5). Slik det ble sammenfattet i tabell 1, 52.4% (11/21) Tiaml transgene mus som genereres fjernmetastaser 32 uker etter DMH behandling. Det ble imidlertid ikke fjerne metastaser eller mikrometastatiske lesjoner ble funnet i alle de 21 ikke-transgene mus samtidig punkt (tabell 1). Videre, infiltrasjon av tumorceller inn i små kar ble også observert i Tiaml transgene mus, mens den ikke er i ikke-transgene mus (figur 5).
Aktivering av β-catenin veien var forbundet med pCDFl -Tiaml-copGFP transgene dyr
Vi neste undersøkt uttrykk for β-catenin, epitelial markør E-cadherin og mesenchymale markør vimentin i svulstene utviklet i villtype mus. Slik det ble vist i figur 6, vises immunohistokjemisk analyse som tumorer dannet i Tiaml-transgen gruppe viste høyere ekspresjon av total og atom β-catenin, og høyere svakere fargingen av E-cadherin, mens sterkere farging av vimentin, sammenlignet med villtype gruppe .
Diskusjoner
Tiam1 er foreslått å spille en rolle i utvikling og progresjon av kreft hos mennesker. På molekylære grunnlaget, in vitro studier gitt innsikt i effekten av Tiam1 kreftutvikling og tumorinvasjon. Videre in vivo studier viste at Tiam1 involvert i kreftutvikling og metastase i nakne mus.
Vår tidligere studie har gitt bevis for at Tiam1 var nært korrelert til metastatisk potensial av tykktarmskreft, og det er uttømming betydelig redusert tumorvekst og metastase muligheten av CRC-celler [9]. For bedre å forstå hvilken rolle og mekanismen for Tiam1 i CRC metastaser in vivo, i denne studien, utviklet vi pCDFl-Tiaml-copGFP-transgene mus og indusert tykktarmssvulstdannelse gjennom behandling av DMH. Ved histologisk analyse, har vi funnet at selv om tumorforekomst og tumor antall per dyr ble ikke påvirket av Tiam1, ble den gjennomsnittlige tumorvolumer signifikant økt i Tiam1-transgen gruppe enn i villtype-mus. I tillegg fant vi at Tiam1-transgene mus formet mer aggressive svulster inkludert lokale invasjon og vev engasjement lymfeknute, sammenlignet med villtype mus. Enda viktigere, Tiaml transgene mus også dannet tumorer som spredte seg til fjerntliggende områder, blant annet peritoneum, lever og lunge, samt infiltrering av tumorceller inn i små beholdere. Selv om ingen fjernmetastaser eller mikrometa lesjoner ble funnet i villtype gruppe.
To motstridende funksjonene Tiam1 på cellulær migrasjon, invasjon, og heft støttes av tidligere studier i ulike cellulære sammenhenger. På den ene side er det blitt rapportert at nærværet av Tiam1 tendens til å bli assosiert med god prognose i magekreft [14]. I Ras-transform Madin-Darby canine nyre (MDCK) celler og NIH3T3 celler induserer Tiam1 en Mesenchymale-epithelial overgang (MET) og hemmer cellevandring gjennom økt cadherin-mediert celle-celle adhesjon [11], [15], [16 ]. I humane nyrecellekarsinom cellelinjer, Tiam1 hemmer invasjon gjennom Rac-indusert oppregulering av tissue inhibitor of metalloproteinases-1 (TIMP-1) og TIMP-2 [10]. Det er blitt dokumentert at Rac signale kunne antagonisere Rho aktivitet direkte på GTPase-nivå, og den gjensidige balanse mellom Rac og Rho aktivitet bestemmer cellulær morfologi, vandrende og invasive egenskaper [17]. Derfor kan det hende at inhiberings effekter av Tiam1 på migrering og invasjon i ulike sammenhenger være forårsaket av Rac-formidlet hemming av Rho-aktivitet.
På den annen side er det også en rekke rapporter om at støttet rolle i å fremme Tiam1 av ondartet transformasjon, tumor proliferasjon, invasjon og metastase [9], [18], [19], [20], [21]. Tiam1 har vært innblandet i onkogene transformasjon av NIH3T3 celler [22]. I tillegg øker Tiam1 invasjon og metastasering i flere humane kreftcellelinjer inkludert melanom og brystkreft [18], [23]. Videre vår tidligere studie antyder også en viktig rolle Tiam1 i migrasjon og metastasering av CRC celler [9]. Vår nåværende studie gi bevis på at innføringen av menneskelig Tiam1 gen inn i bakterie-line betydelig forbedret invasjonen og metastasering av tykktarmskreft, mens bare ubemerka fremmer utviklingen av kolorektal tumorer som ble indusert etter DMH behandling. Dermed våre data støtter i hovedsak invasiv og metastatisk fremme funksjon av Tiam1 i CRC. I nok en annen undersøkelse, ved å sammenligne tumor biologiske atferd i APC mutant Min (multiple intestinal neoplasma) mus som uttrykker eller mangler Tiam1, fant forfatterne at Tiam1 laget forårsaket økt invasjon av ondartede tarmsvulster, selv om dannelse og vekst av polypper in vivo var signifikant redusert [24]. Den åpenbare avvik mellom våre nåværende resultater og de ovennevnte studien kan potensielt være knyttet til APC mutant bakgrunn og DMH behandling. Således er de forskjellige effekter av Tiam1 på migrering og invasjon er sannsynligvis avhengig av ulike sammenhenger, for eksempel celletypen, substrat, transformasjon status, og av aktiveringstilstanden av små G-proteiner i forskjellige typer celler. For bedre å illustrere Tiam1 rolle i kreft progresjon og metastaser, er videre studier viktig å forbedre vår forståelse av Tiam1 oppstrøms regulering.
Wnt /β-catenin signaliserer kritisk regulerer utvikling og progresjon av CRC [25]. Nuclear lokalisering av β-catenin er avgjørende for kanonisk Wnt signalaktivering. Medlemmer av Rho familie av små GTPases, inkludert RhoA, Rac1, og Cdc42, er blitt vist å delta i å fremme aktiviteten av Wnt signalering og kontroll plane celle polaritet i Drosophila [26]. Rac1 aktivering induserer nukleær translokasjon av β-catenin [27]. Som et Rac1 spesifikk utveksling faktor, fremmer Tiam1 samspillet mellom Rac1 og β-catenin, og er avgjørende for Rac1-mediert aktivering av den kanoniske Wnt veien [28]. I denne studien, viste vi at innføringen av Tiam1 inn i bakterie-line forårsaket en betydelig økning av kjernefysisk akkumulering av β-catenin, mink av membran E-cadherin og berikelse av vimentin i kolorektal tumorer med mer invasive evne. Dermed gir vår nåværende studie tyder på at Tiam1 fremmer invasjon og metastasering av CRC, og impliserer at Wnt /β-catenin veien kan involvere i effekten av Tiam1 på CRC invasjon og metastasering in vivo.
I konklusjonen, vår studie har gitt in vivo bevis som støtter at Tiam1 fremmer invasjon og metastasering av CRC, mest sannsynlig gjennom aktivering av Wntβ-catenin signalveien. Men Wnt /β-catenin signalveien kan ikke være den eneste mekanisme som Tiam1 kunne fremme utviklingen av CRC. Videre studier er nødvendig for å etablere regulatoriske nettverk av Tiam1 i kreft progresjon.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Identifikasjon av Tiam1 /EGFP transgene mus ved PCR. Transgene mus og deres ikke-transgene kull dyr ble genotypet ved PCR ved anvendelse av de følgende primere for Tiam1: 5 «AAGACGTACTCAGGCCATGTCC 3» og 5 «GACCCAAATGTCGCAGTCAG 3». Genomisk DNA ble fremstilt fra musehale biopsier
doi:. 10,1371 /journal.pone.0073077.s001 plakater (TIF)
