Abstract
Med sikte på å belyse etiologi av radioresistance, vi utforsket de genetiske endringer i ikke-radioresistant vs . resistente esophageal kreftceller ervervet av langsiktig fraksjonert stråling. Vi fant AKR1C3, en aldo-keto reduktase uttrykt sjelden i de fleste menneskelige vev, uttrykt høyere i radioresistance ervervet celler. Undertrykkelse av AKR1C3 via RNAi eller dens kjemiske hemmere restaurert følsomheten av de oppkjøpte tumorceller og xenograft BALB /c hårløse mus for ioniserende stråling (IR). Cellular overvåking av oksidativt stress i AKR1C3-forhøyet celler indikerte at IR-indusert ROS akkumulering og samtidig DNA skaden ble betydelig lindres, og slik beskyttende konsekvens forsvant på AKR1C3 knockdown. Disse funnene avdekke potensialet involvering av AKR1C3 i fjerning av celle ROS og forklare, i hvert fall delvis, den ervervede radioresistance av AKR1C3 overekspresjon. En retrospektiv analyse av esophageal carcinoma indikerte også en betydelig uttrykk for AKR1C3 i radiofast, men ikke radiosensitive kirurgiske prøver. Vår studie kan gi en potensiell biomarkør for å forutsi prognose av strålebehandling og selv lede en målrettet terapi for esophageal kreft og andre svulster
Citation. Xiong W, Zhao J, Yu H, Li X, Sun S, Li Y , et al. (2014) Forhøyet Uttrykk for AKR1C3 øker motstanden av kreftceller for ioniserende stråling via Modulation av oksidativt stress. PLoS ONE 9 (11): e111911. doi: 10,1371 /journal.pone.0111911
Redaktør: Marianne Koritzinsky, University Health Network, Canada
mottatt: 18 juni 2014; Godkjent: 02.10.2014; Publisert: 24.11.2014
Copyright: © 2014 Zhou et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer. Ifølge PLoS ONE krav og MIAME retningslinjer, har våre microarray data blitt deponert i NCBI Gene Expression Omnibus som GSE61620, GSE61772 og GSE61816
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Basic Research Program of China (973 Program 2010CB12300 for DM Zhou), Natural Science Foundation National of China (91029711, 20932001 og 20852001) og Finansiering fra Utdanningsdepartementet (20110001110054). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Ioniserende stråling (IR) er den mest effektive ikke-kirurgisk behandling for de fleste svulster [1]. Et slikt terapeutisk intervensjon bygger vanligvis på interaksjonen mellom IR- og vannmolekyler i celler som produserer høye reaktive oksygenarter (ROS) og således plasserer kreftceller i henhold omfattende oksidativt stress [2]. Den svært ustabile ROS reagere med DNA og andre makromolekyler i nærheten, som produserer gen feil, kromosomavviks og andre skader [3]. Mitokondrier skade ved IR kan også føre til langvarig oksidativt stress og dermed ytterligere skader DNA og andre cellulære molekyler [4]. Akkumulering av DNA-skade er en viktig faktor i å utløse IR-indusert svikt av celledeling og proliferasjon som fører til celle apoptose [5].
På tross av den terapeutiske betydning, er IR motstand et stort hinder for kreftterapi [ ,,,0],6]. Det har blitt rapportert at reparasjon av IR-indusert DNA skade, enten dobbelttrådbrudd eller enkelt tråd defekter, er en viktig mekanisme underliggende kreft tilbakefall og radioresistance [7] – [11]. Fjerning av IR-generert ROS av antioksidant enzymer utgjør alternativ mekanisme som fører til radioresistance. Glutationperoksidase (gpx), peroxiredoxin (TPX) og superoksid dismutase (SOD), den største klassen av antioksidant enzymer, har en slik evne til å redusere IR-indusert ROS opphopning [12] – [14]. Visse kreftceller og kreftstamceller inneholde et høyere uttrykk av antioksidant enzymer og er således fortrinnsvis spart fra bestråling [15], [16]. Funn av andre cellulære enzymer involvert i å motvirke oksidativt stress kan være nyttig for diagnostisering av ikke-følsomme pasienter til strålebehandling og selv lede en effektiv målrettet terapi for ondartede svulster.
Esophageal kreft er en vanlig kreft med en 5-årig overlevelse på 5-19% [17]. Det er sterke bevis som tyder på at radioresistance av spiserørskreft kan være medfødt,
dvs.
Knyttet til kjønn og etnisitet, eller være forårsaket av livsstil som røyking [18]. Derfor kan esophageal carcinoma gir en ideell modell for identifisering av cellulære faktorer som gjør radioresistance blir indusert. I denne studien fant vi at anskaffelse av radioresistance falt sammen med forhøyet uttrykk for AKR1C3 i esophageal kreftceller, og undertrykkelse av AKR1C3 uttrykk restaurert følsomheten av de oppkjøpte tumorceller og xenograft dyr for ioniserende stråling (IR). Videre cellulære overvåking av oksidativt stress i AKR1C3-forhøyet celler indikerte at ROS akkumulering og samtidig DNA skaden ble betydelig lindres, og slik beskyttende konsekvens forsvant på AKR1C3 knockdown. En retrospektiv analyse indikerte en betydelig AKR1C3 uttrykk i radio-resistente, men ikke-resistente kirurgiske esophageal karsinomer. Våre funn kan gi en ny biomarkør for prediksjon av ikke-følsomme pasienter til strålebehandling og selv lede en målrettet terapi for esophageal kreft og andre svulster.
Materialer og metoder
Cell kultur og bestråling
KY170 og TE13, to menneskelige esophageal plateepitel kreft cellelinjer, og deres avledet radioresistant cellelinjer KY170R og TE13R ble gitt som en gave ved Department of Radiology, MD Anderson Cancer Center, USA. Disse cellelinjer, opprinnelig rapportert av en japansk gruppe [19], ble godkjent og testet av leverandøren ved hjelp av korte tandem repeat profilering og karyotypering tester. Celler ble passert for mindre enn en måned før eksperimentering. En porsjon av sub-masse ble anvendt for de beskrevne her studiene. Celler ble dyrket i høy glukose RPMI 1640 (
Invitrogen
) supplert med 10% føtalt bovint serum (
HyClone
) og 50 enheter /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin. Celler ble opprettholdt i en fuktig inkubator med 5% CO
2 ved 37 ° C og delt hver 3-4 dager. Tumorcelle bestråling ble utført med en 6mV-X-ray lineær akselerator.
RNAi, AKR1C3-tie stabile celler
AKR1C3-målretting shRNA og krafse-shRNA kassetter ble konstruert ved PCR bruke opp -primer (hU6 promoter): TGGATCCaaggtcgggcaggaagag, down-primer (scramble): AGGATCCAAAAACAACAAGATGAAGAGCACCAACTCGAGTTGGTGCTCTTCATCTTGTTGGGTGTTTCGTCCTTTCGTCCTTT; ned-primer (shRNA1): 5′-AGGATCCAAAAACCA GAGGTTCCGAGAAGTAAACTCGAGTTTACTTCTCGGAACCTCTGGCCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC-3 «, (shRNA2): 5′-AGGATCCAAAAACCTAGACAGAAATCTCCACTACTCG AGTAGTGGAGATTTCTGTCTGGCCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC-3′, (shRNA3): 5»-AG GATCCAAAAACTCACTGAAGAAAGCTCAATTCTCGAGAATTGAGCTTTCTTCAGTGAGCCCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC-3 «. De oppnådde kassettene ble klonet inn i pSD31 for konstitutiv ekspresjon av shRNA å følge fremgangsmåten som ble foreskrevet tidligere [19]. Lentiviral vektor produksjon ble utført i henhold til Invitrogen standard protokoll. Eksperimenter for lentivector stabil transduksjon ble utført som følger: 1 x 10
6 av replikon-celler i en T25-kolbe ble podet og transdusert på dag 2 i nærvær av 8 mg /ml polybren. Seleksjon ble utført etter dag 3 ved 800 ng /ml puromycin til foreldrecellene i parallelle forsøk helt døde.
Colony dannelsesbestemmelsen og tumor bestråling
A monolaget av celler i eksponensiell fase av veksten ble bestrålt ved bruk av en 6 MV-X-ray lineær akselerator ved passende doser (2, 4, 8 Gy), og de bestrålte cellene ble sådd ut til å vokse i seks-brønns plater. Etter inkubering i 7-10 dager, ble de overlevende cellene farget med krystallfiolett og deretter tellet. Hvert forsøk ble utført i triplikat og gjentatt to ganger. Tumor-bestråling ble utført på følgende måte: når diameteren av xenograft tumorer nådde 6-8 mm, ble baklemmene av xenograft mus bestrålt med en enkelt dose (15 Gy). Etter bestråling ble tumorvekst overvåkes i opptil 36 dager.
RNA ekstraksjon og Microarray
RNA ble ekstrahert fra hver dyrket cellelinje ved hjelp av SV Total RNA Isolation Kit (
Promega
) i henhold til produsentens protokoll. Det ekstraherte RNA ble deretter behandlet med RNase-fri DNase sett (
QIAGEN
) for å fjerne eventuelle kontaminerende genomisk DNA i henhold til fremstilling protokoll. Gene profilering, i tre eksemplarer, ble utført av Illumina Shanghai Corporation bruker en microarray av opplyse Human-6 V3 og data ble samlet inn og analysert med Illuminated Beadstudio Programvare (GSE61620, GSE61772 og GSE61816). Gener med en Illumina DifferScore av ≥20 ble ansett å representere oppregulering, mens de med en Illumina DifferScore på ≤-20 ble ansett for å være nedregulering. P 0,05 indikerte en signifikant forskjell
Real-time RT-PCR
Den isolerte total RNA ble kvantifisert med en UV spektrofotometer (
Eppendorf
) og deretter 1,0 mikrogram. RNA ble revers transkribert ved hjelp av First Strand cDNA Synthesis Kit (
Toyobo, Japan
) med tilfeldige primere i et reaksjonsvolum på 20 ul. PCR-reaksjonen ble utført ved anvendelse av Taq-Go qPCR Master Mix kit (
Promega
) i henhold til protokollen som leveres av produsenten, og cDNA ble deretter anvendt som et templat for deteksjon av de forskjellige genekspresjon. PCR-primere ble designet av Primer 3.0 og et vindkast søk for å sjekke deres spesifisitet. Primere for PCR-amplifisering av AKR1C3 var 5’ATTTGGCACCTATGCACCTC 3 «(oppstrøms) og 5’TGAGTTTTCCAAGGCTGGTC 3» (nedstrøms) og β virkende 5 «AGCGAGC ATCCCCCAAAGTT 3» (oppstrøms) og 5’GGGCACGAAGGCTCATCATT 3 «(nedstrøms). De relative mRNA-nivåer av de forskjellige gener ble beregnet som følger: ΔCT (prøve) = CT (gen) – CT (GAPDH); ΔΔCT = ΔCT (post-bestråling tidspunkt) – ΔCT (0 h); Relativ uttrykk = 2
-ΔΔCT. Hver RT-PCR ble gjentatt minst to ganger.
Western blot-assay
dyrkede celler ble vasket en gang med PBS-buffer og deretter lysert i lyseringsbuffer (1% SDS, 50 mM Tris, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 1 mM NaF, 10 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 1 mM natriumortovanadat, 1 mM EDTA) i 5 minutter og ført gjennom en 27-gauge nål. Lysates ble sentrifugert ved 12 000
g
i 1 min og proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved hjelp av en Bio-Rad DC proteinanalyse. Like mengder protein ble separert ved 4~20% SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner. Membranene ble blokkert med 5% skummet melk eller 3% bovint serumalbumin i TBST (10 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20) i 1 time. Primære og sekundære antistoffer ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner, og dette ble fulgt av påvisning med en forbedret chemiluminescence teknikk (
Amersham Biosciences
). Western quantitations ble utført som følger: Western blot ble scannet med et densitometer for å oppnå tettheten av hvert bånd. Deretter ble forholdet mellom tettheten av et band av interesse som i sin interne kontrollbåndet (GAPDH) var i forhold til forholdet fra de negative kontrollforsøk. Hver Western blotting ble gjentatt minst to ganger
Overuttrykte AKR1C3
Menneske AKR1C3 cDNA ble kjøpt (
Origene
, Cat No:. SC321532)., Klonet inn pcDNA3.1 og deretter transfektert inn i KY170 celler i henhold til protokollen gitt.
flowcytometri assays
etanol-fikserte celler ble behandlet med RNase A (0,1 mg /ml) i 30 minutter etterfulgt av inkubasjon med PI (35 ug /ml). DNA-innhold av PI-fargede celler ble analysert ved hjelp av FACScan (Becton Dickinson) og prosentandelen av celler med G1, S og G2 /M-DNA-innholdet ble beregnet ved hjelp av MODFIT programvare. Flowcytometri målinger av dihydroethidium (DHE) -fluorescence ble brukt for å måle celle ROS nivåer. Monolagskulturer ble inkubert i 10 mM DHE i 45 minutter og deretter høstet. DHE-fluorescens ble analysert ved flow-cytometri (eksitasjon bølgelengde 488 nm, emisjon 585 nm). Gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) ble beregnet etter korrigering for autofluorescence og fold endringen ble beregnet i forhold til å rykke ut-KY170R celler. Hver flowcytometri analysen ble gjentatt to ganger.
Dyreforsøk
Mann BALB /c naken mus (SPF, kjøpt fra Vital River Laboratories, Beijing, Kina), i alderen 4-6 uker, ble plassert med en invers 12 timer dag-natt syklus med lysene på ved 8:30 i en temperatur (22 ± 1 ° C) og fuktighet (55 ± 5%) kontrollert rom. Alle mus ble gitt vann og chow
ad libitum
til alle tider. Xenograft nakne mus ble generert på følgende måte: KY170R-shRNA1 og KY170R-krafse-celler ble dyrket i fullstendig medium til 70% til 80% tetthet. Etter trypsinizing, ble cellene vasket en gang med PBS, og telles. Den hann, 4 uker gamle til 6 uker gamle nakne mus ble randomisert i to gruppe og injisert i den øvre del av en baklabb med en tetthet på 2 * 10
6/100 ul KY170R-shRNA1 og KY170R-krafse celler, henholdsvis. Tumorvekst ble overvåket daglig, og når tumoren nådde diameter 6 til 8 mm, var den «bestråling gruppe» dyr bestrålt en gang med en dose på 15 Gy. Regresjonen i ortotropiske tumorvekst ble fulgt i opp til 36 dager, idet tumorvolumet beregnet som formel V = π /6 (a * b
2), hvor en er den lengste og b er den korteste vinkelrett tumor akse. Tumorvolumet ble målt inntil tumorene nådde et volum på omtrent 1,0 cm
3. Deretter ble musene avlivet ved halshugging for senere eksperimenter.
Immunohistochemistry av vevssnitt
immunhistokjemi av menneskelige esophageal kreft vevssnitt, kjøpt fra patologi avdeling Peking University første sykehuset, og xenografttumorer ble utført som følger: 4-6 um vevssnitt ble montert og oppvarmet ved 72 ° C i 30 minutter. Snittene ble deparaffinized med xylen, rehydrert i gradert EtOH og skylt med 0,1 M Tris-HCl (pH 7,6). Endogen peroksidaseaktivitet ble blokkert ved inkubering av vevet seksjoner med 3% H
2o
2 i 30 minutter. Antigen gjenfinning ble utført med 0,01 M natriumsitronsyrebuffer (pH 6,0) ved 95 ° C i 1 time. Ikke-spesifikk binding ble blokkert ved inkubering av vevet seksjoner med 0,1 M Tris-HCl inneholdende 10% geiteserum i 2 timer. AKR1C3 ble så bestemt ved å inkubere seksjoner med mus anti-AKR1C3 monoklonalt antistoff ved en fortynning 1:200 i den ovenfor angitte blokkerende oppløsning i et fuktig kammer ved 4 ° C over natten. Etter vaskinger med 0,1 M Tris-HCl, ble delene behandlet med 1:400 fortynning av biotinylert heste anti-muse-sekundært antistoff og inkubert ved romtemperatur i 2 timer. Etter en ytterligere skylling med 0,1 M Tris-HCl, antistoff-binding ble påvist ved inkubering av vevet seksjoner med HRP-konjugert streptavidin ved romtemperatur i 30 min. DAB-H
2o
2-substrat ble deretter tilsatt til lysbildene som ble inkubert ved romtemperatur i ytterligere 4 min. Vevssnitt ble farget med hematoksylin, dehydrert i gradert alkohol, ryddet i xylen, og montert med Permount Monterings Media for visualisering av lys-mikroskopi.
Statistisk analyse
Student t-test ble brukt for å bestemme den statistisk forskjell mellom gjennomsnittene av to grupper og data. P-verdier. 0,05 ble vurdert som signifikante
Etikk erklæringen
Den dyrestudie ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes Helse. Alle forsøk ble gjennomført for å redusere lidelse. Og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter eller deres familier for forskning ved hjelp av disse vevsprøver. Alle celle, dyreforsøk og Immunohistochemistry av vevssnitt studien er godkjent av Peking University Institutional Review Board (sertifikat nr IRB00001052-12037).
Resultater
De differensierte uttrykk for AKR1C3 i kreftceller
å belyse etiologi radioresistance, to radioresistant esophageal kreft kloner, KY170R og TE13R er det etablert ved kontinuerlig fraksjonert bestråling av foreldre celler, KY170 og TE13 [20]. Genome-wide profilering av genuttrykk i KY170R
v.
KY170 og TE13R
v.
TE13 hjelp opplyse Human-6 V3 microarray viste at over 900 gener ble funnet å være bemerkelsesverdig differensiert (Fig. 1A), i samsvar med tidligere rapport [21]. Blant dem, AKR1C3, en aldo-keto-reduktase som eksisterer på et lavt nivå i de fleste humane vev, tiltrukket seg oppmerksomheten på grunn av sin betydelig ekspresjon i begge radioresistant celler. Sanntid RT-PCR (Fig. 1B) og Western blotting (Fig. 1C) analyser bekreftet forhøyet ekspresjon av AKR1C3 i KY170R og TE13R celler, henholdsvis, sammenlignet med foreldreceller: ~ 10-fold på mRNA-nivået, og mye høyere på proteinnivået. Denne profilen avslørte sammentreff av forhøyet uttrykk for AKR1C3 og radioresistance i esophageal KY170R og TE13R kreftceller. Colony-formasjon analyser bekreftet at KY170R og TE13R var faktisk mer motstandsdyktig mot IR enn foreldre KY170 og TE13 celler, med beregnet dose for reduksjon av overlevelse ved 90% for KY170 vs. KY170R som 5,5 Gy vs. 7,8 Gy (Fig. 1C ).
(A) Genome-wide profilering av genuttrykk i radioresistant KY170R og TE13R
versus
radiosensitive KY170 og TE13, henholdsvis på 0, 8 timer og 24 timer etter bestråling. (B) Validering av forhøyet ekspresjon av AKR1C3 på mRNA-nivå i KY170R vs. KY170 og TE13R vs. TE13-celler før og 8 og 24 timer etter bestråling som bestemt ved RT-PCR. (C) Validering av forhøyet uttrykk for AKR1C3 i radioresistant KY170R bestemmes av Western blot og følsomheten av KY170 og KY170R celler til bestråling som bestemmes av en koloni-formasjon analysen.
Effekten av AKR1C3 på respons av kreftceller til bestråling
Gitt den betydelige forskjellen i uttrykket av AKR1C3 mellom resistente og ikke-resistente esophageal kreftceller, vi spurte om det kan være en primær årsak eller bare en nedstrøms konsekvens av radioresistance. For å undersøke dette problemet, uttrykket nivåer av AKR1C3 i KY170R og TE13R ble nedregulert av shRNAs levert av lentivector pSD31 og effektene av AKR1C3 knockdown på radioresistance ble karakterisert. For å utelukke off-target saker ble tre shRNAs benyttes parallelt å belyse effekten av RNAi på KY170R celler med en rykke shRNA som en negativ kontroll. Western blot-analyse viste at alle tre shRNAs brukt i denne studien utøves sterke potens i transduserte celler KY170R med 80% AKR1C3 blir nedregulert sammenliknet med den krafse-shRNA (figur 2A.). Karakterisering av AKR1C3 knockdown på celleproliferasjon indikerte at KY170R-shRNA1, KY170R-shRNA2 og KY170R-shRNA3 (tre stabile cellelinjer som genereres av pSD31-mediert transduksjon) proliferated på nesten samme takt som KY170R-scramble celle, som selv hadde en hastighet nesten identisk med det som ble sett i KY170R og KY170 celler (fig. S1 A i File S1). Dette tyder på at AKR1C3 er ikke et nødvendig gen for spredning av disse kreftceller. I motsetning til dette bestråling beskrevet den biologiske effekten av AKR1C3 på å fremme celleoverlevelse. Koloni-formasjons analyser indikerte at de transduserte KY170R-shRNA1, -shRNA2 eller -shRNA3 celler ble vesentlig mer følsomme for stråling med færre kloner dannet enn KY170R-krypterings celler (Fig. 2B-C og fig. S1B i File S1), som hadde en beregnet dose på 6,5 Gy for reduksjon av overlevelse med 90%, mye høyere enn KY170R-shRNA1 celler (~4.5 Gy).
(A) Representative observasjoner av stabil knockdown av AKR1C3 i KY170R celler ved tre uavhengige shRNAs og overekspresjon av AKR1C3 i KY170 celler. (B) Effekten av AKR1C3 knockdown i KY170R celler og AKR1C3 overekspresjon i KY170 på utfallet av bestråling, dosert fra 0 til 8 Gy, bestemt ved kolonidannelsesbestemmelsen. En rykke shRNA (SCR.) Og den tomme pcDNA3.1 vektor fungerte som en negativ kontroll, henholdsvis. (C) Overlevelseskurvene for sammenligning av effekten av AKR1C3 på følsomheten av KY170R celler (knockdown) og (D) KY170-celler (overekspresjon) til bestråling, som bestemt ved koloni-formasjonstester.
bekreftelse av AKR1C3 effekt på responsen av tumorceller til bestråling
for å bekrefte den beskyttende effekten av AKR1C3 beskrevet av RNAi, den radioresistant KY170R og dets paren KY170 celler ble dyrket i nærvær av 200 pM metyl jasmonate (MJ) og deretter bestrålt. MJ er et veletablert lite molekyl med sin struktur som likner til prostaglandiner, substratet av aldo-keto reduktaser, og således virker som en konkurrerende inhibitor av AKR1C3. MEJ viser stor styrke i det celledelte systemet på grunn av den økte cellulære opptak med sin IC
50 for AKR1C3 ved ~150 uM [22]. Det ble funnet at behandling med mej også vesentlig forbedret responsen av KY170R celler til bestråling og slikt MJ-mediert forbedring ble ikke observert i KY170 celler (Fig. S1C i File S1). Det viste seg at undertrykkelse av AKR1C3 aktivitet via dens kjemiske inhibitor kan også bevisst KY170R celler til IR. Videre undersøkte vi hvorvidt forhøyet ekspresjon av AKR1C3 alene kan føre til KY170 celler til å være motstandsdyktig mot bestråling. Et AKR1C3 ekspresjonskonstruksjon, pcDNA3.1-AKR1C3, ble innført i paren KY170 celler for å generere AKR1C3-overuttrykkende transfektanter (fig. 2A). Det ble funnet at overekspresjon av AKR1C3 i KY170-celler, en 5-gangers økning, tillates flere kolonier til å overleve enn i tilfellet av pcDNA3.1-transfekterte celler ved den samme dose av bestråling (fig. 2B og 2D). Åpenbart er det forhøyet uttrykk for AKR1C3 som gjengir både KY170R og TE13R celler vesentlig resistente mot stråling.
Virkningen av AKR1C3 på veksten av bestrålte xenografttumorer
Vi utforsket om AKR1C3- mediert cellulær radioresistance var også operative i xenografttumorer. To xenograft modeller ble etablert av subkutant implantere KY170R-shRNA1 og KY170R-krafse celler, hver for seg, i nakne mus. Vi har funnet at begge xenotransplantat tumorer vokste hurtig med den tidligere vokser bare litt langsommere enn den sistnevnte (fig. 3A og B), som støtter den cellebaserte observasjon at AKR1C3 har langt mindre virkning på tumorvekst. Når tumorene hadde nådd en gjennomsnittlig volum på ca. 100 mm
3 (fig. 3A), 20 xenograft mus fra hver type ble utvalgt, halvparten av dem ble utsatt for lokal stråling ved en enkelt dose på 15 Gy og halvparten forble ubehandlet . Vi fant alle xenopodet svulster i 10 bestrålt KY170R-shRNA1 mus var følsomme for IR behandling med 8 mus blir nesten tumor-fri 5 uker etter bestråling (fig. 3A-B og fig. S2 i File S1). Farging med hematoxylin og eosin (HE) viste fravær av svulst, men bare en liten krympet rest i de bestrålte xenotransplants (fig. 3A). I motsetning til de ikke-bestrålte xenografttumorer i KY170R-shRNA1 og KY170R-krafse mus vokste til en gjennomsnittlig volum på 1000 mm
3 med full prolifererende celler (Fig. 3A-B og fig. S2 i File S1). I tilfelle av mus med KY170R-krafse xenotransplants, bestråling førte til et dårlig resultat: tumorvekst ble først undertrykt ved bestråling, men gjenopptatt i løpet av to uker (figur 3B.); omfattende neoplasme og sterk AKR1C3 ekspresjon ble påvist i tumorvev (Fig. 3A). Disse resultatene offentliggjort effekten av AKR1C3 høyde i å beskytte xenografttumorer fra bestråling, bekrefter hypotesen avledet fra cellebaserte eksperimenter.
(A) Representative observasjoner av veksten av xenograft KY170R-krafse og KY170R-shRNA1 svulster , og svarene av disse svulstene til en enkelt dose (15 Gy) av bestråling i form av tumorvolumet, HE farging og immunkjemiske farging av AKR1C3. (B) Tidsforløpet for vekst av KY170R-krafse og KY170R-shRNA1 xenografttumorer med eller uten en lokal IR behandling.
mekanistisk forklaring av AKR1C3-mediert radioresistance
For å utforske mekanismen som AKR1C3 utøver sin effekt på utfallet av IR, vi sammenlignet nivåene av mobilnettet ROS og DNA-skader, de kritiske meklere og den umiddelbare konsekvensen av IR-indusert celledød [23], i KY170R-shRNA1 versus KY170R-scramble celler. Det ble funnet at før bestråling ca. 2 ganger mindre ROS var i KY170R-krafse enn i KY170R-shRNA1 celler (Fig. 4A-B). Ved bestråling, nivået av ROS holdt seg lav i KY170R-krafse celler, men bemerkelsesverdig økt i KY170R-shRNA1 celler med forskjellen blir nesten 3 folder (Fig. 4B). Sammenfallende med samtidig AKR1C3 knockdown og ROS økning av bestrålte KY170R-shRNA-celler, antall foci av fosfo-γ-histon (fig. 4C-D), en biomarkør av DNA-skade [24], ledsaget av mange flere kromosomale pauser og brutto kjernefysiske forandringer (fig. S3A-B i File S1), var mye høyere enn i bestrålte KY170R-krafse celler 48 timer etter bestråling. Et parallellforsøk utført i nærvær av N-acetylcystein (NAC), et kjemisk rensemiddel for ROS [25], indikerte at IR-indusert DNA-skader i KY170R-shRNA1 celler og avledede morfologiske egenskaper ble forhindret (fig. 4E) . Vi konkluderte med at AKR1C3 har samme evne som NAC å lindre oksidativt stress og dermed redusere stråling-indusert DNA-skader, overdragelse radioresistance.
(A) Representant mikroskopisk visning av opphopning av ROS i KY170R-scramble
v.
KY170R-shRNA1 celler farget av DHE. (B) Kvantifiseringen av ROS-nivåer i KY170R-krafse
v.
KY170R-shRNA1-celler før og 24 timer etter IR i en dose på 4 Gy. (C) Representant mikroskopisk visning av fosfor-γ-histon foci i KY170R-scramble
v.
KY170R-shRNA1 celler. (D) karakterisering av fosfo-γ-histon i testede celler ved Western blotting. (E) N-acetyl cystein (NAC) -mediert fang av ROS ved et IR-dose på 4 Gy. Hver kvantitativ måling ble utført i tre eksemplarer og gjentas minst to ganger med et feilfelt mindre enn 25%.
Retrospektive studier av radioresistance og AKR1C3 uttrykk i esophageal carcinoma
Vi utførte retrospektiv studier for å vurdere potensialet relevansen av AKR1C3 relaterte radioresistance i esophageal karsinomer. Esophageal tumorprøver, et lite stykke vevsprøver tatt for patologisk diagnose, ble samlet inn fra 28 pasienter som var ikke villige til å akseptere kirurgi (Tabell S1 i File S1). Disse vevsprøver ble så siktet via immunhistokjemi for å bestemme uttrykket nivåer av AKR1C3. Alle pasienter akseptert esophageal sengen området konforme strålebehandling med stråledose på 58-64 Gy. De helsebringende effekter ble evaluert ved å gjennomgå bryst CT én måneder etter strålebehandling. Av disse pasientene, 20 var medfødt motstandsdyktig med tumorvolum krympet mindre enn 50% ved IR; 8 var radiosensitive og ble nesten tumor-fri på IR behandling.
Immunhistokjemisk farging analyser indikerte at 7 (35%) av de radioresistant vevsprøver vises høye nivåer (+++,
dvs.
75% tumorceller er AKR1C3 positiv), og 8 (40%) viste en middels AKR1C3 uttrykket (++,
dvs.
75% -50% tumorceller inneholder AKR1C3 protein) (figur 5A-B. og fig. S4 i File S1). De resterende fem (25%) hadde en lav eller ikke målbare nivåer av AKR1C3 uttrykk (+/-,
dvs.
0-50% tumorceller var AKR1C3 positive). I motsetning til dette ble ingen av de 8 radiosensitive tumorprøver funnet å uttrykke et høyt nivå (+++) av AKR1C3. Bare 3 (37%) av den radiosensitive tumorprøver hadde middels nivå av AKR1C3 men 5 (63%) viste en lav eller upåviselig nivå (+/-) av AKR1C3 ekspresjon (Fig. 5A-B og fig. S4 i File S1) . Åpenbart en sterk korrelasjon (p 0,017) eksisterer mellom forhøyet uttrykk for AKR1C3 og radioresistance av esophageal carcinoma, noe som tyder på at AKR1C3 kan være en prognostisk markør for kreft strålebehandling
(A) Subjektive nivåer av uttrykk for AKR1C3. , nemlig høy (+++), middels (++), lav eller ingen (+/-), i esophageal karsinomer. (B) Nivåer av uttrykk for AKR1C3 i esophageal carcinoma fra 28 pasienter som var medfødt sensitiv eller resistent mot IR.
Diskusjoner
ROS er viktige formidlere av mobilnettet oksidativt stress som avgjør mobilnettet redoks miljø [26]. Høye nivåer av ROS er kritiske i IR-indusert celledød. Bestrålte celler, særlig de under intermitterende eksponering som genererer overdreven ROS, vil eksistere i en tilstand av oksidativt beleiring der overlevelse krever cellene til å styrke sine forsvarssystemer å rømme oksidativ skade. Det har blitt demonstrert at superoksyd-dismutase utgjør den første linje av antioksidanter forsvarssystemer – katalyserer nedbrytningen av den superoksid inn i hydrogen peroksyder, som deretter fjernes ved hjelp av katalase [23]. Forhøyede uttrykk for superoksid dismutase 1 (SOD1) er rapportert hos mennesker hjernesvulst og dermed overdratt radioresistance [15], [16]. Glutationperoksidase og metionin reduktase er også antioksidant enzymer som metaboliserer ROS [23].
I denne studien, rapporterte vi sammentreff av differensiering av AKR1C3 uttrykk, cellular ROS nivå og DNA-skader i radioresistant KY170R vs. ikke-resistent KY170 celler. Vi foreslår at AKR1C3 er en cellulær komponent som deltar i prosessen med fang av celle ROS, dele de samme egenskaper som antioksidant enzymer, i det minste i
in vivo
å unnslippe oksidativ skade (fig. 6). Fjerning av ROS, enten ved antioksidant enzymer, AKR1C3 eller andre uidentifiserte cellulære faktorer, kan være en felles mekanisme konto for radioresistance. I motsetning til glutationperoksidase (GPX), peroxiredoxin (TPX) og superoksid dismutase (SOD) som er funnet i det vesentlige alle levende organismer, er AKR1C3 uttrykt ved et relativt lavt nivå i de fleste normale vev med unntak av prostata og brystkjertel [27], [28 ]. Dermed blir uttrykket nivået av AKR1C3 i tumorceller være nyttig som en biomarkør for prediksjon av mobilnettet radioresistance.
AKR1C3 har fått omfattende oppmerksomhet på grunn av sin sterke reduktiv aktivitet mot en rekke underlag. Det katalyserer NADPH-avhengig reduksjon av endogene aldehyder og ketoner til de tilsvarende alkoholer [28], [29]. Det katalyserer også konvertering av prostaglandin D
2 (PGD2) til 11β-PGF2, PGH2 til PGF2a og kinon til katekol [30]. Den forhøyede ekspresjon av AKR1C3 i tumorceller vil opprettholde en reduserende cellulært miljø, noe som ikke bare fører til lavere konsentrasjoner av ROS, men kan også være forbundet med chemoresistance.
