Abstract
Bakgrunn
Slettede leverkreft 1 (DLC1) er en Rho GTPase aktiverende protein (RhoGAP) ofte slettet og underexpressed i leverkreft (HCC) så vel som i andre kreftformer. Nyere uavhengige studier har vist interaksjon av DLC1 med medlemmer av tensin brennvidde heft protein familie i en Src homologi 2 (SH2) domeneavhengig mekanisme. DLC1 og tensins samhandle og co-Lokaliser til punktat strukturer ved fokale sammenvoksninger. Men mekanismene bak samspillet mellom DLC1 og ulike tensins fortsatt kontroversielt.
metodikk /hovedfunnene
Vi brukte en co-immunoprecipitation analyse for å identifisere en tidligere udokumentert bindingssete på 375-385 av DLC1 som hovedsakelig samhandlet med fosfotyrosin binding (PTB) domene tensin2. DLC1-tensin2 interaksjon er fullstendig avskaffet i en DLC1 mutant mangler denne romanen PTB bindingssetet (DLC1ΔPTB). Men som demonstrert av immunfluorescens og co-immunoprecipitation, verken det sentrale vedheft lokalisering eller samspillet med tensin1 og C-terminal tensin-lignende (cten) ble berørt. Interessant nok ble den funksjonelle betydning av dette nye området som oppvises av den delvise reduksjon av RhoGAP aktivitet, som, i sin tur, dempes den vekstundertrykkende aktivitet av DLC1 ved dens fjerning fra DLC1.
Konklusjoner /Betydningen
Denne studien har gitt nye bevis som DLC1 samhandler også med tensin2 i en PTB domeneavhengig måte. I tillegg til riktig lokalisering fokale sammenvoksninger og bevare RhoGAP aktivitet, DLC1 interaksjon med tensin2 gjennom denne romanen brennvidde heft bindingsstedet bidrar til vekst-undertrykkende aktivitet av DLC1
Citation. Chan LK, Ko FCF, Ng IO L, Yam JWP (2009) Slettet i Liver Cancer 1 (DLC1) Benytter en Novel bindingssetet for Tensin2 PTB Domain Interaksjon og er nødvendig for Tumor-undertrykkende funksjon. PLoS ONE 4 (5): e5572. doi: 10,1371 /journal.pone.0005572
Redaktør: Neil Hotchin, University of Birmingham, Storbritannia
mottatt: 21 januar 2009; Godkjent: 15 april 2009; Publisert: May 15, 2009
Copyright: © 2009 Chan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble finansiert delvis av den Hong Kong stipend~~POS=HEADCOMP Council (HKU 7674 /06m og HKU 1 /06C) og Michael Kadoorie Cancer Genetisk programmet~~POS=HEADCOMP til Kadoorie Charitable Foundation. I.O.L. Ng er Loke Yew professor i patologi. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
den lille, monomere G-protein Rho er blitt klassisk definert som en viktig biologisk regulator av aktin cytoskjelettet [1] – [3]. I sin tur, styrer dynamisk cytoskjelettet omsetningen et bredt utvalg av beslektede biologiske responser, som strekker seg fra definisjonen av celleformen til fremming av cellemigrering, celleadhesjon og cellespredning [4], [5]. Men en økende mengde bevis tyder på at Rho er også involvert i kontroll av viktige biologiske funksjoner som celleproliferasjon, celleinvasjon og gentranskripsjon [6] – [11]. Rho er innblandet i kreftutvikling, som har vist seg å være aktivert i ulike kreft hos mennesker [12], [13].
Slettede leverkreft 1 (DLC1)
er en tumor suppressor gen lokalisert på kromosom 8p21.3-22 og har vist seg å være hyppig unexpressed i et bredt spekter av humane kreftformer, inkludert hepatocellulært karsinom (HCC) [14] – [23].
DLC1
koder for et flerdomene RhoGAP protein med selektiv aktivitet mot RhoA, B og C og mindre mot CDC42 men ikke Rac1 [23], [24]. Omfattende undersøkelser har vist at DLC1 utnytter denne RhoGAP aktivitet til å undertrykke celledeling [15], [18], [23], [25] – [29], utløse apoptose [25], og for å redusere cellemigrering [26], [28 ], celleinvasjon og den resulterende kreft metastase i cellelinjer, så vel som musemodeller med forskjellige vev opprinnelse [29] – [31]. I en fersk undersøkelse, rollen DLC1 som en
bona fide
tumor suppressor i HCC ble bekreftet av en musemodell med en leverspesifikk, kort hårnål RNA-mediert DLC1 knockdown [32]. Selv om rollen som DLC1 i å beskytte celler fra kreftrelaterte eiendommer har blitt klart, spørsmål om sin biologiske regulering forbli ubesvart.
transcriptionally,
DLC1
uttrykket har blitt funnet å være epigenetiske brakt til taushet i ulike kreft hos mennesker. Hypermethylation av genet promoter-regionen trykkes
DLC1
gen-transkripsjon og ekspresjon i forskjellige vev [16], [17], [19], [22], [24], [33] – [35]. Post-translasjonelt, rotte DLC1 er blitt vist å bli fosforylert av Akt-kinase [36]; Men forekomsten i menneskelig DLC1 og dens biologiske betydningen er fortsatt aktuelle. På den annen side, en fersk studie identifisert DLC1 mutasjoner i prostata og brystkreft på bestemte tyrosin og serinresidua. Disse mutasjonene inaktivere DLC1 RhoGAP aktivitet gjennom en ukjent mekanisme [37]. Til dags dato er de beste karakterisert regulering av DLC1 på proteinnivået dens interaksjon med proteiner tensin [27], [28], [38]. Tensins er fokale adhesjonsproteiner bærer Src-homologi 2 (SH2) og fosfotyrosin bindende (PTB) domener på sitt C-termini [39]. Samle bevis tyder på at DLC1 samhandler med flere tensins. Generelt benytter DLC1 en SH2 bindingsmotiv som involverer residuet Y442 å samhandle med SH2 domene av tensin1 og C-terminale tensin-lignende (cten). Mutasjon ved Y442 forårsaket DLC1 å miste sin brennvidde heft lokalisering og tumorundertrykkende aktivitet. Denne observasjonen innebærer at tensin binding er en viktig regulerende hendelse i subcellulære lokalisering og svulsten undertrykkende funksjon DLC1 [27], [28]. Men vi har tidligere dokumentert interaksjoner mellom DLC1 og tensin2 PTB domene [38]. Dermed mekanismen for samspillet mellom DLC1 og ulike tensins og dets biologiske konsekvensene er fortsatt kontroversielt.
I denne studien, oppdaget vi en ny bindende mekanisme mellom DLC1 og tensin2 ved å identifisere en udokumentert bindingssete i DLC1, annet enn SH2 bindende motivet beskrevet av andre, for samhandling med tensin2 PTB domene. Det nye nettstedet ble godt bevart i DLC familier. Vi tilbyr også den første bevis for tensin2 samhandling som felles kjennetegn ved DLC1 og DLC2. Bortsett fra bindingen mekanisme, vi også demonstrert den funksjonelle betydningen av denne romanen bindingssetet i regulering av svulst undertrykkende aktivitet DLC1.
Resultater
Den tensin2 PTB domene var nødvendig for DLC1 samhandling
Vi demonstrerte at C-terminus tensin2 fragment, inklusive SH2 og PTB domener (SH2-PTB i fig. 1 B), var tilstrekkelig til å binde DLC1 (fig. 1A). For å vurdere betydningen av individuelle domener i DLC1 samhandling, vi utarbeidet flere tensin2 delesjonsmutanter inkludert tensin2 ΔSH2ΔPTB, ΔSH2, og ΔPTB og testet deres bindende affinitet mot DLC1 (Fig. 1B). Tensin2 ΔSH2ΔPTB viste konsekvent et fullstendig tap av DLC1 bindende. I motsetning til andre rapporter, fant vi at fjerning av SH2 domenet i tensin2 bare delvis redusert DLC1 bindende. Det er interessant å fjerne PTB domene i tensin2 var tilstrekkelig til fullstendig å avskaffe DLC1 interaksjon, noe som indikerer at nevnte PTB domene er nødvendig for binding (fig. 1C). Det har blitt rapportert at DLC1 Y442 og S440 danner en fosfo-uavhengige bindingsmotiv for SH2 domenet av tensin1 og cten [27], [28]. Vi neste sjekket bevaring av disse restene i binding til tensin2 SH2-domene. Interessant, fant vi ut at DLC1 Y442F og S440A mutanter viste bare en delvis reduksjon i tensin2 bindende. For å teste om Y442 og S440 megle samspillet med tensin2 SH2 domene, sjekket vi bindingsaffiniteten mellom DLC1 og tensin2 R1165A, en SH2 domene mutant med nedsatt anerkjennelse og binding av tyrosin-fosforylert mål. Vi fant at mutasjon ved R1165A i tensin2 resulterte i en nedgang i tensin2-DLC1 bindende. Ligner bindende affinitet mot R1165A ble observert blant DLC1 villtype, Y442F og S440A. Dette indikerte at Y442 og S440 kan bare være effektiv når SH2 domenet tensin2 var intakt (Fig. 1 D). Sammen er disse resultatene støtter konklusjonen om at en SH2 domene-mediert mekanisme bidrar også til DLC1-tensin2 interaksjoner.
(A) Uttrykk for tensin2 SH2-PTB fragment (som beskrevet i Materialer og Metoder og skissert i fig. 1B) var tilstrekkelig for interaksjon med DLC1. HEK293T celler ble transfektert med Myc-merket tensin2 fragment og FLAG-merket DLC1 konstruksjoner som angitt. Ryddet cellelysatene ble inkubert med anti-myc antistoff for å immunoutfelle tensin2. DLC1 i utfellingene ble påvist ved immunblotting med anti-FLAG-antistoff. (B) Skjematisk diagram som viser domenestrukturen av Myc-merket tensin2 og dets C-terminale, avkortede mutanter. Mutantene enten hadde både SH2 og PTB domener (ΔSH2ΔPTB) eller hadde individuelle domener blir fjernet (ΔSH2 og ΔPTB). SH2-PTB var den tensin2 C-terminale ende brukt i fig. 1A. (C) Kartlegging av DLC1 bindingssetet i tensin2. HEK293T celler ble transfektert med Myc-taggede tensin2 og FLAG-merket DLC1 konstruksjoner som angitt. Ryddet cellelysatene ble inkubert med anti-myc antistoff for å immunoutfelle tensin2. DLC1 i utfellingene ble påvist ved immunblotting med anti-FLAG-antistoff. Fjerning av tensin2 SH2 domenet (ΔSH2) resulterte i delvis reduksjon av DLC1 bindende. Fullstendig tap av DLC1 binding ble observert ved fjerning av tensin2 PTB domene (ΔPTB). Bandet intensiteten i hvert kjørefelt ble målt i IP og Co-IP paneler og målingene ble normalisert til lane 2. De relative Co-IP-til-IP forhold ble også inkludert. (D) Karakterisering av bindingen mellom tensin2 og fokale vedheft lokaliserings-defekt DLC1 mutanter. Villtype tensin2 eller SH2 domene mutant, R1165A, ble co-transfektert med DLC1 villtype, Y442F og S440A. Cellelysatet ble underkastet immunoutfelling med anti-myc antistoff, etterfulgt av immunblotting med anti-FLAG-antistoff. Y442F og S440A viste en delvis reduksjon i tensin2 bindende, men SH2 domenet mutant, R1165A, gjorde det ikke.
Identifikasjon av tensin2 PTB bindende domene i DLC1
Vi neste avhørt som region av DLC1 var nødvendig for dette PTB domene avhengige tensin2 interaksjon. Vi hadde tidligere foreslått senterområdet 375-509 av DLC1 å være regionens behov for tensin2 samhandling [38]. Til nettopp undersøke denne foreslåtte bindende regionen, vi klonet og uttrykt ulike DLC1 mutanter med ulike trunkeringer opprettet innenfor dette området (Fig. 2A). Vi fant ut at N-termini av DLC1 1-400 og 1-440, både mangler rapportert tensin SH2 bindingssete (Y442 av DLC1), var nok til å samhandle med tensin2. På den annen side, den gjensidig utelukkende C-terminale fragment 400 stoppe med et intakt bindingssete SH2 var ikke tilstrekkelig til å interagere med tensin2 (Fig. 2B). Et lignende resultat ble observert når 450-stopp, som ikke inneholdt noen forutsagt tensin-bindingsseter, ble anvendt (Fig. 2B). For å gi ytterligere bevis på at N-enden av DLC1 samhandlet med tensin2 gjennom en PTB domeneavhengig mekanisme, sjekket vi samspillet mellom DLC1 1-400 og de nevnte tensin2 sletting mutanter. Vi har observert at interaksjonen mellom DLC1 1-400 og tensin2 ikke ble påvirket, selv når SH2 domenet av tensin2 ble fjernet. I motsetning til dette ble interaksjon mellom de to igjen oppheves når nevnte PTB domenet av tensin2 ble fjernet, noe som indikerer at denne bindingen var utelukkende PTB domene avhengig (fig. 2C). For å presisere PTB bindingssetet i DLC1 videre, vi undersøkt bindingen av et panel av DLC1 N-terminale fragmenter til tensin2. Blant disse fragmentene, fant vi at DLC1 1-385 var den korteste fragment som var i stand til å binde tensin2 (Fig. 2D). Sammen er disse resultatene tyder på at regionen DLC1 375-385 fungerer som en tensin2 PTB bindingssete og er nødvendig for tensin2 bindende.
(A) N-terminalen av DLC1 var tilstrekkelig for interaksjon med tensin2. HEK293T celler ble transfektert med Myc-merket tensin2 fragment og FLAG-merket DLC1 konstruksjoner som angitt. Ryddet cellelysatene ble inkubert med anti-myc antistoff for å immunoutfelle tensin2. DLC1 i utfellingene ble påvist ved immunblotting med anti-FLAG-antistoff. (B) C-terminalen av DLC1 var ikke i stand til å binde tensin2. Myc-merket tensin2 ble ko-transfektert med to FLAG-merket DLC1 C-terminale fragmenter som angitt. Disse DLC1 C-terminale fragmenter kan ikke være co-immunopresipitert med tensin2. (C) N-terminale fragment 1-400 var involvert i tensin2 PTB bindende. FLAG-merket DLC1 1-400 kunne være co-immunopresipitert med tensin2. Fjerning av tensin2 SH2 domenet påvirker ikke affiniteten til å binde til 1-400, men et intakt PTB domene var nødvendig for binding. (D) Fin kartlegging PTB bindingssetet i DLC1. Myc-merket tensin2 ble ko-transfektert med et panel av FLAG-merket DLC1 N-terminale fragmenter. FLAG-merkede fragmenter i utfellingene ble påvist ved immunblotting-analyse med anti-FLAG-antistoff. Fragment 1-385 var den korteste fragment er i stand til å bli ko-immunopresipitert med tensin2. Bandet intensiteten i hvert kjørefelt ble målt i IP og Co-IP paneler og målingene ble normalisert til lane 2. De relative Co-IP-til-IP-forhold ble også inkludert.
Bevaring av tensin2 PTB bindende domene i DLC2
Hvis du vil kontrollere den biologiske bevaring av den tilordnede tensin2 bindende regioner i andre DLC familiemedlemmer, utførte vi aminosyre justering mellom DLC1 og DLC2 [40], [41]. Vi fant at både de SH2 og PTB bindingssteder er godt bevart i DLC2. Tilsvarende serin (S457) og tyrosin (Y459) rester i SH2 bindende domene ble funnet i DLC2. Den PTB bindingssetet i DLC1 375-385 ble funnet å samsvare med DLC2 400-410, noe som tyder på en mulig rolle i denne regionen i formidling PTB domeneavhengig binding mellom DLC familiemedlemmer og tensin2 (Fig. 3A). Basert på bevaring av tensin bindingsseter i DLC2, hypotese vi at DLC2 kan samhandle med tensin2. Ved hjelp av co-immunoprecipitation, viste vi at DLC2α og tensin2 påvirker hverandre, noe som bekreftet vår spekulasjon. Som med DLC1 ble RhoGAP aktiviteten av DLC2 ikke nødvendig for tensin2 interaksjon, slik som vist ved det positive samvirke mellom DLC2 RhoGAP mutant, R740E, med tensin2 (Fig. 3B). Vi spurte om DLC2 også lokalisert til knutepunkter sammenvoksninger i SMMC-7721 celler. Vi fant at uttrykket av DLC2γ indusert alvorlig celle krymping. For å lette observasjon, vi i stedet brukt et funksjonelt inaktiv mutant, DLC2γ R622E, som næret en mutasjon i sitt RhoGAP domene [41]. Vi fant ut at DLC2γ R622E kunne co-lokalisere med vinculin (Fig. 3 C), noe som indikerer at andre DLC proteiner kan også lokalisere til brenn adhesjon.
(A) Skjematisk viser tensin2 SH2 og PTB bindingsseter i DLC1. Innenfor minimal tensin2 bindende regionen 375-509, er separate elementer involvert i medie tensin2 binding via PTB eller SH2 mekanismer. Disse elementene er godt bevart i DLC1 paralog, DLC2. Konserverte rester ble understreket. (B) Samspill mellom DLC2 og tensin2 i en RhoGAP uavhengig. HEK293T celler ble transfektert med Myc-taggede tensin2 og GFP-merket DLC2 konstruksjoner som angitt. Ryddet cellelysatene ble inkubert med anti-myc antistoff for å immunoutfelle tensin2. DLC2 i utfellingene ble påvist ved immunblotting med anti-GFP-antistoff. (C) GFP-DLC2γ viste brennvidde heft lokalisering i en RhoGA uavhengig. Uttrykk av GFP-DLC2γ indusert alvorlig celle krymping når uttrykt i SMMC-7721 celler. Focal vedheft lokalisering av DLC2γ RhoGAP mutant R622E ble oppdaget. Den endogene vinculin ble visualisert ved hjelp av anti-vinculin antistoff. Scale bar = 10 mikrometer.
DLC1ΔPTB mutant viste spesifikk tap av tensin2 bindende, men beholdt sin brennvidde heft lokalisering
For å studere rollen til tensin2 PTB bindende domene av DLC1, vi klonet tre separate DLC1 mutanter som hadde minimale endringer i de følgende strukturelle elementer: Δ375-390 (ΔPTB # 1), Δ375-385 (ΔPTB # 2) og Δ380-390 (ΔPTB # 3), som hver bærer en spesifikk indre delesjon i PTB domene (DLC1ΔPTB) (fig. 4A). For å bekrefte den rolle PTB domene i tensin2 binding, vi først testet bindingen av disse mutanter med tensin2. Med en co-immunoprecipitation analysen, fant vi at alle DLC1ΔPTB mutanter viste et underskudd på tensin2 binding (fig. 4B). Tapet av binding ble ytterligere bekreftet ved redusert ko-lokalisering mellom DLC1ΔPTB # 1 og tensin2 (fig. 4C). For å møte spesifisiteten av kartlagt PTB bindende motiv mot andre tensin proteiner, utførte vi en co-immunoprecipitation analyse ved hjelp av en C-terminale fragment av tensin1, 648-stop. Tensin1 648-stopp dekker C-terminalen SH2 og PTB-domener, som har vist seg å være viktig i DLC1 binding [28]. Vi har bekreftet sin rolle i DLC1 samspill med våre co-immunoprecipitation system (Fig. S1). Interessant, fant vi at tensin1 648-stop viste sammenlignbar bindende affinitet med DLC1 villtype og DLC1ΔPTB (fig. 4D). Et positivt samspill med DLC1 ble også observert da cten ble immunopresipitert i co-immunoprecipitation analysen (fig. 4E). Disse observasjonene støtter den spesifikke involvering av dette PTB bindende motiv med tensin2. For å møte om fjerningen av nevnte PTB domenet ville påvirke det sentrale adhesjon lokalisering av DLC1 studerte vi lokalisering av DLC1ΔPTB i SMMC-7721 HCC celler med immunfluorescens. Vi fant at DLC1ΔPTB mutanter opprettholdt sin fokal adhesjon lokalisering, som indikert ved deres ko-lokalisering med fokal-adhesjon-assosiert protein vinculin. Denne observasjon antydet at fjerning av PTB bindingssetet i DLC1 påvirker dens binding med tensin2 men bevarer sin fokal adhesjon lokalisering, muligens via interaksjon med andre tensins gjennom en PTB-uavhengige bindingsmekanisme (fig. 4F).
( A) Skjematisk viser strukturen av tre FLAG-merket DLC1ΔPTB mutanter: Δ375-390, Δ375-385 og Δ380-390 (ΔPTB # 1-3). (B) DLC1ΔPTB viste redusert tensin2 bindende. HEK293T celler ble transfektert med Myc-taggede tensin2 og FLAG-merket DLC1 konstruksjoner som angitt. Ryddet cellelysatene ble inkubert med anti-myc antistoff for å immunoutfelle tensin2. DLC1 i utfellingene ble påvist ved immunblotting-analyse med anti-FLAG-antistoff. Fjerning av PTB bindende domene i DLC1 resulterte i tap av tensin2 bindende. (C) DLC1ΔPTB viste redusert samlokalisering med tensin2. SMMC-7721 celler ble transient ko-transfektert med GFP vektor eller GFP-tensin2 og indikerte Myc-merket DLC1. DLC1 ble visualisert ved hjelp av anti-myc antistoff, etterfulgt av Texas Red-konjugert sekundært antistoff. Scale bar = 10 mikrometer. (D) DLC1ΔPTB kunne samhandle med tensin1. HEK293T celler ble transfektert med Myc-merket tensin2 SH2-PTB (som skissert i Fig. 1B) eller Myc-taggede tensin1 C-terminale 648-stop (som skissert i fig. S1) og FLAG-merket DLC1 konstruksjoner som angitt. Ryddet cellelysatene ble inkubert med anti-myc antistoff for å immunoutfelle tensin2 eller tensin1. DLC1 i utfellingene ble påvist ved immunblotting-analyse med anti-FLAG-antistoff. Fjerning av PTB bindende domene i DLC1 påvirket ikke tensin1 binding. (E) DLC1ΔPTB kunne samhandle med cten. HEK293T celler ble transfektert med Myc-merket tensin2 eller Myc-merket cten og FLAG-merket DLC1 konstruksjoner som angitt. Ryddet cellelysatene ble inkubert med anti-myc antistoff for å immunoutfelle tensin2 eller cten. DLC1 i utfellingene ble påvist ved immunblotting-analyse med anti-FLAG-antistoff. Fjerning av PTB bindende domene i DLC1 påvirket ikke cten binding. (F) DLC1ΔPTB viste brennvidde heft lokalisering i SMMC-7721 celler. SMMC-7721 celler ble transient ko-transfektert med GFP-tensin2 og FLAG-merket DLC1 som angitt. DLC1 ble visualisert ved hjelp av anti-DLC1 antistoff, etterfulgt av FITC-konjugert sekundært antistoff. Den endogene vinculin ble visualisert ved hjelp av anti-vinculin antistoff, etterfulgt av Texas Red-konjugert antistoff. Scale bar = 10 mikrometer.
DLC1ΔPTB viste delvis reduksjon i RhoGAP aktivitet, men var tilstrekkelig til å undertrykke aktin stresset fiber dannelsen
Aktiv RhoA er best kjent for sin rolle i å simulere aktin stresset fiber formasjon. Å være en negativ regulator av RhoA, undertrykker DLC1 aktin stresset fiber formasjonen i en RhoGAP avhengig måte [26]. Ved hjelp av aktin stresset fiber som en indirekte biologisk avlesning, spurte vi om RhoGAP aktiviteten DLC1ΔPTB mutanter ville bli berørt. Vi fant at DLC1ΔPTB mutant-transfekterte celler, viste redusert aktin spenning fiberdannelse sammenlignet med de nærliggende ikke-transfekterte celler. Denne observasjonen var lik de av de fokal klebelokaliserings-defekte mutanter av DLC1, Y442F og S440A, som hver bærer en punktmutasjon i det tensin SH2-bindingsdomene (Fig. 5A). For direkte å kvantifisere RhoA inaktivering, utførte vi en Rhotekin pull-down analyse for å bestemme de Rho-GTP aktivitet i celler som uttrykker forskjellige DLC1 mutanter. Selv om vi funnet at DLC1ΔPTB mutant kunne undertrykke Rho-GTP aktivitet, var det interessant at denne undertrykkelse var mindre effektiv når sammenlignet med den til villtype DLC1 (Fig. 5B). På den annen side skal det bemerkes at de Y442F og S440A mutanter viste også en reduksjon i undertrykke Rho-GTP aktivitetsnivå. Til sammen fant vi at DLC1ΔPTB mutant viste en delvis reduksjon i egen RhoGAP aktivitet, men at denne aktiviteten var tilstrekkelig til å undertrykke aktin stresset fiber formasjon.
(A) SMMC-7721 HCC celler ble transfektert med angitt Myc -tagged DLC1 konstruerer og aktin stresset fibrene ble farget med TRITC-konjugert phalloidin en time etter serum induksjon. Stjernen (*) markerer DLC1-transfekterte celler. DLC1 Y442F, S440A, ΔPTB # 1 og # 2 kunne undertrykke aktin stresset fiber formasjon så effektivt som DLC1 WT. Scale bar = 10 mikrometer. (B) HEK293T-celler ble transfektert med de angitte FLAG-merket DLC1 plasmid i 24 timer. Etter transfeksjon ble cellene i serum-sultet i 24 timer og stimulert med 5 uM lysofosfatidisk syre i 30 minutter. Cellelysat ble deretter oppsamlet og utsatt for GST-RBD pull-down for RhoA-GTP. Rullegardin prøver ble utsatt for SDS-PAGE analyse og immunpåvist med anti-RhoA antistoffer. Bandet intensiteten av den aktive RhoA i hvert kjørefelt ble målt og avlesningene ble normalisert til vektor-transfiserte celler. Den DLC1, tubulin og RhoA totalt cellelysat ble immunpåvist med anti-FLAG, anti-tubulin og anti-RhoA antistoffer, henholdsvis. (C) HeLa-celler ble transfektert med de indikerte DLC1 konstrukter og valgt med G418 i 2 uker. Koloniene som ble dannet ble visualisert ved krystallfiolett farging. Gjennomsnittlig forskjell i kolonidannelse effektivitet mellom grupper ble funnet å være statistisk signifikant (
p
0,001; enveis ANOVA test).
DLC1ΔPTB viste redusert vekst-undertrykkende aktivitet
evnen DLC1 å undertrykke tumorvekst har blitt godt dokumentert. Vi spurte om de nevnte DLC1ΔPTB mutantene vist noen forskjell i DLC1-indusert veksthemming. I en HeLa celle kolonidannelsesbestemmelsen, vill-type DLC1 undertrykte betydelig kolonidannelse sammenlignet med vektor kontroll. I motsetning til dette, ektopisk ekspresjon av DLC1ΔPTB mutanter resulterte i en signifikant økning i antall kolonier sammenlignet med vill-type DLC1 (fig. 5C). Denne observasjonen tyder på at selv når DLC1ΔPTB viser riktig fokal adhesjon lokalisering, tap av dette tensin2 PTB bindingsmotiv vil resultere i redusert vekst undertrykkelse, sannsynligvis på grunn av delvis reduksjon i RhoGAP aktivitet. Det er sannsynlig at riktig tensin2 PTB bindende bidrar til DLC1-indusert veksthemming.
Diskusjoner
DLC1 har vist seg å utøve biologiske funksjoner ligner de klassiske tumorsuppressorgener. De ulike tumorundertrykkende effekter av DLC1 er sterkt avhengig av tilstedeværelsen av en funksjonell RhoGAP domene [26], [28]. Imidlertid har flere studier vist at RhoGAP aktivitet alene ikke er tilstrekkelig for den tumorundertrykkende funksjon [26] – [28], [42]. Foregående strukturanalyse fra vår gruppe gitt det første bevis på at disse funksjoner av DLC1 kan gjenopprettes bare når området mellom SAM og RhoGAP domener ble inkludert [26]. Identifiseringen av tensin2 som den første bindende protein som samhandler med denne funksjonelt viktige regionen videre antydet forholdet mellom tensin2 samhandling og DLC1 funksjon [38]. Denne oppfatningen ble også støttet av oppdagelsen av cten og tensin1 som bindende partnere av DLC1 i senere studier, noe som tyder på at det er biologisk viktig for tensin familie proteiner for å samarbeide for med DLC1 [27], [28].
Vi har tidligere foreslått at DLC1 375-509 er minimal binding regionen tensin2. Denne regionen dekker de viktigste rester Y442 og S440, som ble foreslått av andre studier å utgjøre en SH2 bindingssete for cten og tensin1 [27], [28]. Men vi kan ikke gi direkte bevis for at tensin2 SH2 domenet var tilstrekkelig for DLC1 binding [38]. I denne studien, og vår forrige rapport, våre funn konsekvent viste at det tensin2 PTB, snarere enn SH2, domene direkte interaksjon med DLC1.
Det er noen mulige forklaringer på avvikende funn. Første, selv om SH2-domener og PTB i tensin proteiner har en høy sekvenshomologi, forskjeller i deres sekvenser kan resultere i forskjellige bindingsmekanismer for DLC1 og andre tensin familiemedlemmer. For det andre, ble forskjellige bindingsanalyser brukes av forskjellige grupper for å studere mekanismen for binding mellom tensin og DLC1. For eksempel, gjær binde- og GST pull-down-analyser ble brukt av Liao et al. og Qian et al., respektivt, mens
in vivo
ko-immunutfelling ble anvendt i vår foreliggende undersøkelse. For det tredje ble det C-terminale fragmenter av tensin som inneholdt enten en eller begge av SH2-domener og PTB brukt i kartlegging av DLC1 bindingssetet i studiene av Liao et al. og Qian et al. Dette eksperimentell design antatt at den N-terminale region av proteinet tensin heller ikke var involvert i binding eller bidro til den normale proteinfolding av den C-terminale region.
I den foreliggende undersøkelse, gir vi det første bevis på at spesifikk fjerning av SH2-domener og PTB i tensin2 påvirker DLC1 binding i forskjellig grad (fig. 1C). For å dokumentere at PTB domene spiller en avgjørende rolle i DLC1-tensin2 bindende, kartla vi PTB-bindende domene på N-terminalen av DLC1 (fig. 2) og bekreftet sin rolle ved å karakterisere DLC1ΔPTB interne delesjonsmutanter (Fig. 4A). Vi identifiserte en udokumentert regionen 375-385 av DLC1 som PTB-domene-bindingssetet og DLC1-tensin2 interaksjon gikk tapt da denne regionen ble fjernet (Fig. 4B). Det er vel etablert at nevnte PTB domenet gjenkjenner en NPXY motiv, som illustrert i sin binding til integrin β [43]. Men motivet ble ikke funnet i vår kartlagt region i DLC1, noe som tyder på at den virke PTB-mediert interaksjon er en trolig atypisk. Selv DLC1ΔPTB viste tap av tensin2 bindende, var det fortsatt i stand til å lokalisere til fokale sammenvoksninger (fig. 4C og 4F). I tillegg fant vi at PTB domene var nødvendig for det sentrale vedheft lokalisering av tensin2 (data ikke vist). Derfor, i tillegg til å fungere som den fysiske bindingssete for DLC1, PTB domene kan også være viktig for å bringe tensin2 i umiddelbar nærhet til DLC1 ved fokale sammenvoksninger og lette deres interaksjon. Sammen er disse resultatene tyder på at DLC1 utnytter regionen 375-385 i formidling tensin2 bindende, mens den utnytter Y442 og S440 rester for focal vedheft målretting (Fig. 6).
DLC1 ble rettet mot brennvoksninger og nødvendige rester Y442 og S440. Ved fokal adhesjon, foruten SH2 bindingsmekanismen, DLC1 anvendes region 375-385 for å interagere med nevnte PTB domene av tensin2, som indikert ved den stiplede linjen. Dannelsen av denne bindingen komplekset var viktig for DLC1 å utøve vekst-undertrykkende funksjon.
Det er foreløpig ukjent om den foreslåtte tensin PTB-bindende domene i DLC1 er involvert i binding med andre tensins. Dette gjenstår å bli undersøkt. Det har vært rapporter om at uttrykk for tensin1 PTB domenet er tilstrekkelig for interaksjon med DLC1. Også, slette hele tensin SH2 bindingsmotiv (440-448), i stedet for å innføre en punktmutasjon i Y442F DLC1, er tilstrekkelig for interaksjon med tensin1 [28]. Dette indikerer at PTB-avhengig binding kan være til stede mellom DLC1 og tensin1, men spiller en subtil rolle, i motsetning til DLC1 og tensin2 samhandling. Basert på våre nåværende funnene, konkluderer vi at PTB bindende mekanismen er tensin2 spesifikk (fig. 4B, 4D og 4E), mens andre tensins utnytte en SH2 bindende mekanisme [27], [28]. Mulig kompensasjon av andre tensins kan forklare hvorfor DLC1ΔPTB kan være lokalisert til Focal voksninger i fravær av tensin2 interaksjoner. I tillegg har vi funnet at DLC1ΔPTB viste en delvis reduksjon i RhoGAP aktivitet, noe som resulterte i en delvis reduksjon i veksthemming (fig. 5B og 5C).
En begrensning i vår foreliggende undersøkelse er bruken av ectopically uttrykt tensin2. Påvisning av endogent tensin2 var ikke mulig, ettersom tensin2 antistoffet ikke var tilgjengelig i vårt laboratorium. Interaksjon mellom endogen DLC1 og tensin2 må undersøkes for å reflektere deres binding i selve biologisk sammenheng. På den annen side, utførte vi innledende kvantitativ sanntids-PCR-analyse for å bestemme mRNA-ekspresjonsnivåene av DLC1 og tensin2 i humane vev HCC. Våre upubliserte data viste at underexpression av både DLC1 og tensin2 ble korrelert med kortere total overlevelse sammenlignet med de som hadde normal uttrykk for en eller begge gener, støtter mulig funksjonell sammenslutning av DLC1-tensin2 med hepatocarcinogenesis.
Helt har vi identifisert en roman tensin2 PTB bindingssetet i DLC1 og viste sitt engasjement i tensin2 interaksjoner. Selv om fjerningen av nevnte PTB-bindingssetet ikke påvirker det sentrale vedheft lokalisering, vil det delvis reduserte RhoGAP aktivitet av DLC1, som dempes dens vekst undertrykkende funksjon.
