Abstract
Bakgrunn
Natur killer (NK) celler spiller en viktig rolle i anti-tumor immunterapi. Men det viste at kreftceller påvirket muligens på NK celle normale funksjoner gjennom noen molekyler mekanismer i svulstens mikromiljø.
Materiale og metode
Vår studie analysert endringen om NK-celler overflatemarkører (NK-celler reseptorer ) ved immunfluorescens, flowcytometri og real-time PCR, den drepte funksjon fra musemilt NK-celle og menneske høy /lav lungekreft cellelinjen ved ko-kulturen. Videre kan vi sertifisert ovenstående resultat på kreft modell av SCID mus lunge.
Resultater
Vi viste at infiltrasjon av NK-celler i tumor periferien hadde sammenheng med lungekreft pasienter «prognose. Og antall NK celle infiltrere i lungekreft vev er nært knyttet til de patologiske typer, størrelse på den primære kreft, røyking historie og prognose for pasienter med lungekreft. Uttrykket av NK-celler hemmer reseptorene økt bemerkelsesverdig i tumor mikro-miljø, i motsatt er uttrykk for NK-celler aktivert reseptorer redusere storartet.
Konklusjoner
overlevelse av kreftpasient lunge ble positivt relatert til NK celle infiltrasjon grad i lungekreft. Således kan nedregulering av NKG2D, Ly49I og oppregulering av NKG2A indikere immuntoleranse mekanisme og lette metastase i tumormiljøet. Vår forskning vil gi mer teori for klinisk strategi om svulst immunterapi
Citation. Jin S, Deng Y, Hao J-W, Li Y, Liu B, Yu Y, et al. (2014) NK Cell Fenotypisk Modulation i Lung Cancer Miljø. PLoS ONE 9 (10): e109976. doi: 10,1371 /journal.pone.0109976
Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: May 17, 2014; Godkjent: 13 september 2014; Publisert: 09.10.2014
Copyright: © 2014 Jin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Young People forskningsfond fra tilskuddene National Eleventh-Five-Year sentral oppgave Prosjekter av Kina (No. 2006BAI02A01) , National 973 Program (No. 2010CB529405), Tianjin Scientific Innovation System Program (No. 07SYSYSF05000, 07SYSYJC27900), Kina-Sverige Cooperative Foundation (No. 09ZCZDSF04100), tilskuddet National Natural Scientific Foundation of China (No 81201828), Young folk Foundation of Heilongjiang Provincial of China (No QC2012C013), Helse Institutt for Heilongjiang Provincial of China (No 2011-124) og Harbin Medical University Cancer Hospital stort prosjekt Foundation (No: JJZ-2010-01). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er en av de vanligste ondartede svulster i verden, som har høy sykelighet og dødelighet og står for om lag 25,4% av alle svulster. Det har vært en oppadgående trend i insidensraten i de senere år [1] – [4]. The American Cancer Society utgitt data viser at 222,520 tilfeller av luftveis kreft og 157,300 tilfeller av dødsfall i 2010, som er i første omgang av sykelighet og dødelighet av alle ondartede svulster [5]. En klinisk statistikk over stadium IV NSCLC i Kina viste at 1-, 2-, 3-, 4- og 5-års overlevelse var 44%, 22%, 13%, 9% og 6% henholdsvis [6]. For tiden, er kirurgisk fjerning fremdeles den viktigste metoden for å forlenge overlevelsestiden for lungekreft, men invasjon og metastasering av lungekreft er den største hindringen for å forbedre effektiviteten av den prognose for lungekreft. For inngående studie av lungekreft ondartet atferd og fokus på helhetlig behandling av metastatisk lungekreft, er det nødvendig å etablere passende dyremodell for å studere kreft tilbakefall lunge og metastasering og dens omfattende terapi.
Natural killer (NK ) celle, også kjent som store granulære lymfocytter, er en selvstendig og ikke-spesifikke immunceller. Det har ingen MHC restriksjons til målceller gjenkjennelse og ødeleggelse, og det kan direkte drepe tumorceller og virusinfiserte målceller uten antigen pre-sensibiliserte [7], [8]. Det kan også fremstille et stort antall av immunaktiv cytokiner for å forbedre eller utvide sin anti-tumor effekt, som kan betraktes som den første linjen i vertens forsvarssystemet [9]. Flere eksperimentelle bevis demonstrert den viktige rollen av NK-celler i eliminering av tumorceller. Vivier et al rapporterer at en lav NK-celle cytotoksisitet i perifert blod ble korrelert med en øket risiko for kreft [10]. Videre ble NK-celler infiltrerer i tumorvevet forbundet med god prognose i kolorektal [11], gastrisk [12], og lunge [13] kreftformer.
Med utviklingen av tumordannelse, maligne tumorceller og infiltrerende immunceller kommuniserer og komponert svulsten mikromiljøet. De fleste av studier publisert viste at et stort antall av immunceller infiltrere inn i tumorvevet spilte en viktig rolle i å forbedre tumor prognose [14], [15]. Men som vi alle kjente, prognosen for lunge-assosiert malignitet er veldig forferdelig, selv om det er mange immunceller i lungene. Vi ønsker å vite om det er en differensial sammensetning av immunceller infiltrere i maligne og ikke-maligne lunge vevsområder, og til og med kan potensielt kan bidra til denne effekten. Esendagli G et.al funnet at i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) pasienter, NK-celler ble ikke funnet nesten i de ondartede vev regionene, ikke-maligne motstykker ble selektivt befolket ved hjelp av NK-celler og disse NK-celler viste sterk cytotoksisk aktivitet ex vivo [16].
Så virkningen av NK-celle-reseptor-ekspresjon og funksjon kan være forskjellig på grunn av interaksjonen mellom NK-celler og tumor i tumor-mikromiljøet. Ved å utforske NK-celler i kroppen og /eller lungekreft mikro-miljø, diskutere dens fordeling, reseptorekspresjon, funksjonell status med lungekreft invasjon, metastase og prognose, klar mekanismen av NK-celler er involvert i lungekreft mikro-miljø fra den cellulære og molekylært nivå.
Materialer og metoder
tumorprøver og etikk erklæringen
Denne undersøkelsen ble gjennomført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen. Alle tumorprøver brukt i denne studien ble hentet fra Tianjin Lung Cancer Institute og patologiavdelingen i Tianjin Medical University General Hospital. Alle pasienter gitt skriftlig informert samtykke til uttak av prøver og påfølgende analyse. Og studien ble godkjent av Institutional Ethics Committee of Tianjin Medical University General Hospital.
Parafiner Prøve og opprinnelse Frozen vev av Lungekreft
Pasientene vil være kvalifisert for deltakelse i induksjonsfasen av studere om de har: histologic eller cytologisk diagnostikk av NSCLC (inkludert plateepitel karsinom, adenokarsinom og stor celle karsinom); ingen tidligere systemisk kjemoterapi, strålebehandling og biotherapy for lungekreft før operasjonen; ingen annen kreft historie; og ≤80 år.
Parafiner Prøveprøver ble samlet inn fra 84 pasienter diagnostisert med lungekreft mellom January1st 2008 og 31 januar 2011 (64 menn og 20 kvinner). Median alder for pasientene var 60,7 ± 7,9 år (fra 40 til 78 år). Det finnes forskjellige patologi typer: 37 plateepitel karsinom pasienter, 37 adenokarsinom pasienter og 10 store cellekreft pasienter. På tidspunktet for diagnose, ble pasientene vurdert etter AJCC /UICC den sjette klassifisering utgaven som følger: stadium IIA-1 pasienter, scene IIB- fire pasienter, Stage IIIA-58 pasienter stadium IIIB-12 pasienter, stadium IV-9 pasienter. Prøvene ble tatt i bruk fra Tianjin Medical University Pathology avdeling.
Frosne vevsprøver ble samlet inn 66 kirurgiske prøver med lungekreft mellom January1st 2008 og January1st 2011. Det er inkludert 52 menn og 14 kvinner. Median alder for pasientene var 60,5 ± 8,4 år (fra 40 til 78 år). Det var blant annet ulike patologityper: 28 plateepitel karsinom pasienter, 28 adenokarsinom pasienter og 10 store cellekreft pasienter. Pasientene ble vurdert i henhold til AJCC /UICC den sjette klassifisering utgaven som følger: stadium IIA-1 pasienter, stadium IIB-fire pasienter stadium IIIA-45 pasienter, stadium IIIB-9 pasienter, stadium IV-7 pasienter. Prøvene ble tatt i bruk fra Tianjin Lung Cancer Research Institute.
immunfluorescens
Immunophenotypes analyse av CD56 og CD16 ble gjort som følger. I korte trekk ble de formalinfikserte, parafininnstøpte seksjoner (4 pm) oppvarmes ved kokekaret i 45 minutter, deretter deparaffinized i xylen og rehydrert i en gradert serie av etanol-løsninger. Seksjonene ble deretter neddykket i sitronsyre-natrium-citrat-bufferoppløsning (pH 7) og mikrobølge ved høy brann i 5 min, lav brann i 15 min, og naturlig avkjøling til romtemperatur for å hente antigenisitet. Endogen peroksidase ble stanset med 3% H
2o
2 i 30 minutter. Etter vasking med PBS, ble seksjonene inkubert med 2% BSA i 2 timer i romtemperatur, og deretter inkubert med CD56 og CD16-antistoff (Santa Cruz, fortynnet ved 1:100) over natten ved 4 ° C. Snittene ble inkubert med muse-anti-geit og geit anti-mus fluorescens-antistoff (Santa Cruz, fortynnet ved 1:200) i 35 minutter og den DAPI i 5 min. Etter vasking med PBS fjerde ganger, ble seksjonene montering av glycerol (pH 9,0). Den røde fluorescens uttrykt CD56
+, grønn fluorescens uttrykt CD16
+ uttrykte blå fluorescens cellekjernen. Vi kan finne den CD56
+ og /eller CD16
+ uttrykker i NK-cellen. SPOT bildeanalyse programvare ble anvendt i analyseprosessen. Prosentandelen av CD56 og /eller CD16-positive celler ble bestemt ved telling per seksjon. NK celletall per view-feltet ble scoret etter følgende kriterier: +, NK legemer på per view felt 10; ++, NK legemer på per view felt 10, 20; +++, NK legemer på per view felt 20. Alle feltene i per seksjon i tre uavhengige eksperimenter ble beregnet.
RNA ekstraksjon, cDNA syntese og DNA
Den totale RNA ble ekstrahert med Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, California) i henhold til produsentens protokoll. Den totale RNA ble kuttet med R nase-free D nase-I (Promega, Madison, USA) og brukes for cDNA syntese med revers transkriptase system (Takara Biotech, Dalian, Kina).
Kvantitativ sanntid PCR
cDNA syntesen ble utført som beskrevet ovenfor. Den spesifikke primer RT forsøket var som følger: NK1.1: 5’TCTCTTGAATAAACACACAGCAT -3 «, NKG2A: 5’CTGAGAAGGATTTTG -3», NKG2D: 5’TTCTCACAGTTCCTCT -3 «, LY49I: 5’TTCTATTCTTGCTTTAG -3 «. Primerene og GAPDH primerpar ble brukt for Q-PCR med SYBR Premiks Ex Taq RT-PCR Kit (Takara, Dalian, Kina) i en ABI PRISM 7900 Sanntidssystem (Bio-Rad) med følgende vilkår: 95 ° C i 30 s, 40 amplifiseringscykluser (95 ° C i 5 s og 60 ° C i 30 sek), og et smeltesyklus fra 60 ° C til 95 ° C. Dataene ble analysert ved hjelp av ABI PRISM 7900 Manager-programvare. Alle reaksjoner ble utført med tre tekniske replikater.
Cell
De høye og lave metastase stor celle lunge kreft cellelinjer L9981-Luc og NL9980-Luc fra Tianjin Lung Cancer Institute [17], [ ,,,0],18] ble opprettholdt i RPMI 1640 medium (Hyclone, USA) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Hyclone, USA) i en fullstendig fuktet inkubator (Nuaire, US Autoflyt) ved 37 ° C med 5% CO
2. Cellene ble holdt i en eksponentiell vekstfase under forsøkene.
SCID-modell
SCID (alvorlig kombinert immunsvikt) mus kjøpt fra Chinese Academy of Medical Sciences dyre institusjoner ble plassert i patogen-frie dyr fasiliteter. Hunnmus ble brukt var 5-7 ukers alder ved eksperimentets begynnelse. Hunn SCID-mus (16 dyr for hver eksperimentell gruppe) ble inokulert subkutant i høyre inguen med 2 * 10
6-celler suspendert i 150 ul PBS. Ni dyr i kontrollgruppen hadde ingen vaksinasjon. Tumor størrelser ble målt hver 7. dag og deres fluorescens intensitet ble målt med USAs sanne essensen av levende bildesystem (XENOGEN IVIS200). Etter 6 uker med observasjon, ble disseksjon utføres og Eksplanterte svulster, lungene og milten ble fjernet for videre analyse. Disse eksperimentene ble gjentatt minst to ganger for å bekrefte resultatene. Dyret eksperimentelle protokoller ble godkjent av komiteen for Ethics of Animal Eksperimentering og forsøkene ble utført i henhold til retningslinjer for dyreforsøk i Tianjin Medical University Cancer Research Center.
lymfocyttkontroll samle og flowcytometri oppdage
De lunger og milt ble polert i stykker. Deretter lymfocyttene samle ble ekstrahert med lymfocytt Separation Medium (Shenzhen, Kina) i henhold til produsentens protokoll. Prosenter av NK-celler ble evaluert og er adskilt med strømningscytometri ved å bruke monoklonale antistoffer (MoAb) anti-CD3
– FITC /NK1.1
+ PE (BD Phamingen, San Di ego, CA). Under analyse, CD3
– ble /NK1.1
+ Befolkning bestemt. For å bestemme overflate-ekspresjon av NK-celle ligander på NK-celler, ble cellene deretter farget med geit anti-mus NK1.1-FITC, CD3- Alexa Fluor 647, NKG2A-FITC, NKG2D-PE, Ly49I-PE (BD Phamingen, San Di ego, CA) i 30 minutter ved 37 ° C i mørket. Analysen ble utført på FACS Sorter (Becton Dickinson, Mountain View, California) bruker Cell quest software (Becton Dickinson) og celleoverflaten uttrykk ble kvantifisert ved verdien av middel fluorescensstyrkene oppnådd med de spesifikke mAbs.
Co-kultur
Renset NK1.1
+ /CD3
– NK-celler (aktivert med 100U /ml IL-2 i løpet av 2 h) fra mus milt ble ko-dyrket med lungekreft cellelinje L9981-Luc /NL9980-Luc som (A) 0.25:1, (B) 0.5:1, (C) 01:01 og (D) 2:01 til 24, 48, 72 timer. Etter co-kultur, ble fluorescens intensitet av NK-celler målt med USAs sanne essensen av levende imaging system.
kvantitativ real-time PCR
RNA ble isolert fra eksplanterte svulster via Trizol og reverse transkribert ved hjelp av spesiell priming (Invitrogen). Kvantitativ RT-PCR ble utført på en ABI PRISM 7900 instrument, ved hjelp av SYBR grønn analyser. De spesifikke primere er oppført i følgende (tabell 1). Amplifikasjonen ble utført som følger. Etter innledende denatureringstrinn ved 95 ° C i 30 sekunder, ble maler denaturert ved 95 ° C i 5 sekunder, primere ble glødet og DNA-utvidelse ble utført ved 60 ° C i 30 sekunder (hver cyklus ble gjentatt 40 ganger). Uttrykket av målgener ble kompensert ved å bruke uttrykk for GAPDH og presentert av uttrykket forholdet mellom ubehandlede kontrollceller og behandlede celler.
Statistisk analyse
Forsøkene ble utført tre ganger. Data er presentert som middelverdier ± SD. Den statistiske evalueringen ble utført ved hjelp av enveis ANOVA tester eller rang-sum test når måledata er Gaussisk fordeling med SPSS programvaresystem, versjon 17.0. Hvis dataene er oppregning data, Chi-square test ble brukt.
P
verdier på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Samlet overlevelsesraten ble sammenlignet med Kaplan-Meier overlevelseskurve, Logg-rank rank-sum test som brukes blant grupper.
Resultater
NK celle lokalisering og morfologi karakteristisk i lungekreft mikro-miljø
infiltrerte NK-celler i lunge kreftvev ble konsentrert i tumoren stroma, som utgjør den tumor-mikromiljøet (Fig.1). I NSCLC-vev, CD56
+ NK-celler med 1, 2 og 3 graden av infiltrering var 44,0%, 22,6%, 33,3%, CD16
+ NK-celler var 45,2%, 22,6%, 32,1%, og CD56
+ CD16
+ NK-celler var 45,2%, 23,8%, 31,0%, respektivt. ble ikke observert noen signifikant forskjell (
p
0,05). blant NK-celler med CD56 eneste positive, CD16 eneste positive og CD56CD16 dobbelt positiv i lungekreft vev (tabell 1)
infiltrert NK-celler i lunge kreftvev ble konsentrert i tumoren stroma. NK-celler viser med CD56 enkel positive (grønn fluorescens), CD16 eneste positive (rød fluorescens) og CD56CD16 dobbel positive (gul fluorescens) i lungekreft stroma vev.
NK celle infiltrasjon og lungekreftpasienter klinisk patologi fysiologiske funksjon
1, 2 og 3 grad med CD56
+ CD16
+ NK celleinfiltrasjon var 24,3%, 32,4%, 43,2% i plateepitelkarsinom, og 62,2%, 16,2 %, 21,6% i adenokarsinom og 50,0%, 10,0%, 40,0% i stor celle lungekreft, respektivt. Det var signifikant forskjell på CD56
+ CD16
+ NK celleinfiltrasjon grad mellom ulike patologiske typer lungekreft (
p
= 0,019) (figur 2, tabell 2). Ekspresjonen av NK-celler i squamous cell carcinoma var signifikant høyere enn i adenokarsinom og stor celle karsinom. 1, 2 og 3 grad med NK celle infiltrasjon var 48,1%, 3,7%, 48,1% i lungekreft pasienter med ingen historie med røyking, var 42,1%, 31,7% og 26,3% hos pasienter med røyking historie. Røyking historie lungekreft pasienten er relatert til NK celle infiltrasjon grad (
p
= 0,011). 1, 2 og 3 grad og NK-celleinfiltrasjon var 60,6%, 18,4%, 21,1% i T1-T2 kreft, og 42,1%, 31,7%, 43,5% i T3-T4 kreft, respektivt. En vesentlig forskjell fra NK-celleinfiltrasjon grad ble funnet mellom forskjellig størrelse på tumor (
p
= 0,019) (tabell 3).
A. Lung plateepitel karsinom; B. Lung adenokarsinom; C. Stor celle lungekreft. Uttrykket av NK-celler i plateepitelkarsinom var betydelig høyere enn i adenokarsinom og stor celle karsinom.
NK celle infiltrasjon og lungekreftpasienter prognose
overlevelse av lungekreft pasienten var positivt relatert til NK celle infiltrasjon grad i lungekreft. Jo mer infiltrering av NK-celler ble eksisterte, jo lengre overlevelsestid for pasienter gjorde (
p
= 0,030) (figur 3, tabell 4).
overlevelsestid for lungekreftpasient var positivt relatert til NK celle infiltrasjon grad i lungekreft. Den mer infiltrering av NK-celler ble eksisterte, jo lengre overlevelsestid for pasienter gjorde. Pasientene i nivå 3 gruppen har den lengste overlevelse. Blant tre grupper statistisk signifikans er exit. (
p
= 0,030)
Real-time PCR bekrefte NK celleinfiltrasjon grad i lungekreft
Forskjellene av NK celle reseptorer CD56 og CD16 mRNA uttrykk mellom ulike patologiske typer lungekreft ble funnet og bekreftet av real-time PCR. Vi fant ut at NK-celler fenotype mRNA i annen histologisk type lungekreft har statistisk signifikans (Fig.4). Dette er i samsvar med resultatet av histologi.
NK-celler reseptorer CD56 og CD16 fenotype mRNA i ulike histologiske typer lungekreft har statistisk signifikans.
Transplantert svulster-lunge metastaser modeller etablert
Transplanterte svulster-lunge metastase modellene ble vellykket etablert i SCID mus med høy (L9981) /lav (NL9980) metastatiske menneske store celle lunge kreft cellelinjer. Den fjerne metastasering av de xenograft tumoren ble påvist ved fluorescens imaging in vitro (Fig.5A). Sammenlignet med lavt metastatisk gruppen (6,84 x 10
6 ± 3,26 x 10
6), lungemetastaser fluorescens-verdi av mus i høy metastatisk gruppe (30,97 x 10
6 ± 14,3 x 10
6) var bemerkelsesverdig høyere enn i lav-metastatisk gruppe (
p
= 0,035) (Fig.5B, C, D)
A:. Leve fluorescens bildebehandling oppdage musemodell ( venstre er riktig inguen subkutant svulst i 1 uke og midten er for 6 uker etter injeksjon, er den rett lungemetastaser svulster i seks uker etter vaksinasjon), B:. vekst~~POS=TRUNC kurve~~POS=HEADCOMP av subkutant transplantasjon svulst i SCID mus, C: lungemetastaser luminescens avbildning av tumorbærende mus in vitro, D:. sammenligningen av luminescens verdi mellom transplanterte kreft og lungemetastaser av høy (L9981) /lav (NL9980) metastatiske menneske store celle lunge kreft cellelinjer
NK celle fenotypiske modulasjon i lungekreft mikro-miljø
NK1.1
+ CD3
– NK-celler i lungene av høy metastatisk gruppen (3,40 ± 0,90) var betydelig høyere enn det i milt (0,10 ± 0,06) (
p
= 0,003). NK1.1
+ CD3
– NK-celler i milt fra høy-metastase-gruppen (0,10 ± 0,06) var betydelig lavere enn den i lav-metastase-gruppen (1,66 ± 0,82) og kontrollgruppen (3.80 ± 2.05) (
p
= 0,017,
p
= 0,025) (figur 6)
NK1.1
+ CD3
-. NK-celler i lungene av høy -metastatic gruppen var vesentlig høyere enn i milt (
p
= 0,003). NK1.1
+ CD3
– NK-celler i milt fra høy-metastase-gruppen (0,10 ± 0,06) var betydelig lavere enn den i lav-metastase gruppe (
p
= 0,017) og styre gruppe (
p
= 0,025).
NKG2D uttrykk nivå av NK-celler fra milt i high-metastaser gruppen (4,17 ± 0,85) var bemerkelsesverdig lavere enn i kontrollgruppen (7,80 ± 2,67) (
p
= 0,034) og lav-metastase gruppen (6,00 ± 0,96) (
p
= 0,040) (Fig.7B)
A:. NKG2A uttrykk nivå av NK-celler fra lunge i høy metastatisk L9981 gruppen var signifikant høyere enn i lav-metastatisk NL9980 gruppe og en kontrollgruppe (
p
= 0,000). Ly49I ekspresjonsnivået fra lungen i L9981 gruppe og NL9980 gruppen var signifikant høyere enn i kontrollgruppen (
p
= 0,000) B: NKG2D ekspresjonsnivå av NK-celler fra milt i L9981-gruppen (4,17 ± 0,85) var bemerkelsesverdig lavere enn i kontrollgruppen (
p
= 0,034) og NL9980 gruppe (
p
= 0,040). Ly49I uttrykk nivå i NL9980 gruppe var bemerkelsesverdig høyere enn i L9981 gruppe (
p
= 0,010) og kontrollgruppen (
p
= 0,004). C: NKG2A ekspresjonsnivå av NK-celler fra lunge var signifikant høyere enn den fra milt i høy metastatisk L9981 gruppe (
p
= 0,007) og Ly49I ekspresjonsnivået fra lungen var bemerkelsesverdig oppregulert enn det i milten (
p
= 0,003) D: Ingen signifikant forskjell av alle reseptorer uttrykk grad av NK-celler ble eksistert i lav metastaser NL9980 gruppe. E: Ly49I Ekspresjonsnivået av NK-celler fra lungene var signifikant høyere enn den fra milten i kontrollgruppen (
p
= 0,033)
NKG2A ekspresjonsnivå av NK-celler. fra lungene (5,13 ± 2,36) var betydelig høyere enn fra milt (1,47 ± 0,68) i høy metastatisk gruppe (
p
= 0,007) (Fig.7C). NKG2A uttrykk nivå av NK-celler fra lunge i high-metastatisk gruppen (5,13 ± 2,36) var betydelig høyere enn i lav-metastatisk gruppen (4,70 ± 1,96) og kontrollgruppen (0,73 ± 0,26) (
p
= 0.000) (figur 7a).
Ly49I uttrykk nivå av NK-celler fra lunge i høy metastatisk gruppen (4,82 ± 1,78) var bemerkelsesverdig oppregulert enn i milt (1,50 ± 0,10) (
p
= 0,003) (Fig.7C). Den Ly49I Ekspresjonsnivået av NK-celler fra lungene (2,79 ± 0,40) var signifikant høyere enn den fra milten (1,13 ± 0,40) i kontrollgruppen (
p
= 0,033) (Fig.7E). Ly49I ekspresjonsnivå av NK-celler fra lungen i høy metastatisk gruppen (4,82 ± 1,78) og lav-metastatisk gruppe (6.11 ± 2.23) var signifikant høyere enn i kontrollgruppen (2,79 ± 0,40) (
p
= 0.000) (figur 7a). Ly49I Ekspresjonsnivået av NK-celler fra milt i lav-metastaserende gruppe (3.40 ± 1.00) var bemerkelsesverdig høyere enn den i høy metastatisk gruppen (1,50 ± 0,10) (
p
= 0,010) og kontrollgruppen (1,13 ± 0,40) (
p
= 0,004) (Fig.7B).
NK celle dødelig effekt på lungekreft mikro-miljø
NK1.1
+ CD3
– NK-celler aktiveres av IL-2 in vitro har betydelig cytotoksisk aktivitet til høy /lav metastatisk lungekreft store celler. Det ble observert en signifikant forskjell mellom forskjellige effektor-target ratio (
p
= 0,005,
p
= 0,017). NK-celler hadde høyere cytotoksisk aktivitet til NL9980 enn den til L9981 i samme effektor-target-forhold (
p
= 0,035) (tabell 5).
NK-cellereseptoren mRNA uttrykker i subkutant transplantert tumor fra mus
i de transplanterte tumorer i tumor-bærende gruppe, NKG2D ekspresjonsnivå av NK-celler i høy-metastase gruppen var signifikant høyere enn den i lav-metastase gruppe (
p
= 0,018), og Ly49I uttrykk nivået av NK-celler i høy metastaser gruppen var også bemerkelsesverdig høyere enn lav-metastase gruppe (
p
= 0,001). Imidlertid ble ingen signifikant forskjell i NK1.1 og NKG2A uttrykk nivå av NK-celler eksisterte mellom høy og lav metastase gruppe (
p
0,05) (figur 8)
NKG2D. uttrykk nivå av NK-celler i høy metastase L9981 gruppen var signifikant høyere enn i lav-metastaser NL9980 gruppe (
p
= 0,018), og Ly49I uttrykk nivået av NK-celler i L9981 gruppen var også bemerkelsesverdig høyere enn NL9980 gruppe (
p
= 0,001). Ingen signifikant forskjell i NK1.1 og NKG2A uttrykk nivå av NK-celler ble eksisterte mellom høy og lav metastase gruppe.
Diskusjoner
Denne studien viste at NK-celler infiltrasjon og NK-celler reseptor uttrykk endring i NSCLC svulst miljø. Fra vår forskning, fant vi at NK-celler infiltrert hovedsakelig i tumor stroma, som utgjør svulsten mikromiljøet. Disse observasjonene er i samsvar med tidligere observasjoner som viser at lungetumor mikro-miljø [16]. I tillegg fikk vi overraskelse at antall NK celle infiltrere i lungekreft vev er nært knyttet til de patologiske typer, størrelse på den primære kreft, røyking historie og prognose for pasienter med lungekreft.
Forrige litteraturen underforstått at noen molekyler uttrykker i svulsten og noen medier som frigjøres fra tumor ofte ført til svulst rømningsmekanismene fra NK celle immunologisk overvåking [19], [20]. Det er høye nivåer av ikke-klassiske MHC I molekyl HLA – E og HLA – G på tumorcelleoverflaten. De var NK-celleaktivering CD94 /reseptor-NKG2A og celle-overflate-immunglobulin prøven transkripsjon molekyl 2 (ILT2) inhiberende ligand, som kan holde NK-celleskade funksjon [21] – [23]. På samme tid, kan tumorceller utskiller noen tumor suppressor faktorer inhibering av NK-celle-funksjon, så som IL-10 [24] og TGF-β [25]. Rundt tumor infiltrerer NK celle, hadde noen spesielle endringer i enkelte andre humane tumorer blitt undersøkt. I nyrekreft, kan NK-celle innenfor tumor bare ble aktivert ved hjelp av IL-2-stimulering har målcellen løsning funksjon. Og til de samme pasientene var det signifikante forskjeller mellom det perifere blod NK-celle-fenotype med i tumor [26] – [28]. NK-celleoverflaten reseptor DNAM-en, 2B4, CD16 uttrykk redusert i eggstokkreft, noe som kan resultere i at NK-celle aktivering funksjon ble hardt skadet [29].
Vår forskning resultat meldingen som den aktiverte reseptoren av NK celler er nedregulert og hemmende reseptoren av NK-celler er oppregulert i det transplanterte svulsten og fjerne metastatiske lesjoner av menneske store celle lunge kreft cellelinjer, som kan være den viktigste grunnen fører til NK celledrepende evne redusert.
NKG2D er en reseptor for MHC klasse i kjederelaterte A og B molekyler, som ofte uttrykt av epiteliale kreftformer. Ligering av NKG2D induserer anti-tumorale effektorfunksjoner i både NK og T-celler. NKG2D gjenkjennelse spiller en viktig rolle i tumor immunovervåkning [30] og det NKG2D virker primært til å utløse perforin-mediert apoptose [31]. Vår forskning bekreftet at NKG2D uttrykk nivå av NK-celler fra milt i high-metastaser gruppen var bemerkelsesverdig lavere enn i kontrollgruppen (
p
= 0,034) og lav-metastase gruppe (
p
= 0.040). I de transplanterte tumorer i tumor-bærende gruppe, NKG2D mRNA ekspresjonsnivå av NK-celler i høy-metastase gruppen var signifikant høyere enn den i lav-metastase gruppe (
p
= 0,018).
NKG2A er en hemmende NK-reseptor som er blitt rapportert til å danne disulfid-bundne heterodimerer med invariant CD94. Den NKG2A ligand er blitt identifisert som HLA-E, et ikke-klassisk MHC klasse-I-b-molekyl som er vidt fordelt blant forskjellige vev oppviser forholdsvis lav overflate-ekspresjon, og har begrenset polymorfisme [32]. Den inhiberende reseptor CD94 /NKG2A spiller en viktig rolle i NK-celle-mediert lysis av aktiverte CD4
+ T-celler [33]. NKG2A uttrykk nivå av NK celle fra lunge var betydelig høyere enn fra milten i high-metastatisk gruppe (
p
= 0,007). NKG2A uttrykk nivå av NK-celler fra lunge i high-metastatisk gruppen var signifikant høyere enn i lav-metastatisk gruppe og en kontrollgruppe (
p
= 0,000). Således kan nedregulering av NKG2D og oppregulering av NKG2A indikere immuntoleranse mekanisme og lette metastase i tumormiljøet.
Interaksjon av MHC klasse I med Ly49 reseptorer forhindre aktivering av NK-celler og dermed lysis av målcellen. Dermed NK-celler utnytte Ly49 reseptorer for å skille «selv» fra «missing-selv «. Tap av MHC klasse I molekyler på målceller avlaster NK-celle av Ly49-mediert inhibering, og dermed gir NK-celler til å mediere cytotoksisitet [34]. Den Ly49I Ekspresjonsnivået av NK-celler fra lungene var signifikant høyere enn den fra milten i kontrollgruppen (
p
= 0,033). Ly49I ekspresjonsnivå av NK-celler fra lungen i høy metastatisk gruppe og lav-metastatisk gruppen var signifikant høyere enn i kontrollgruppen (
p
= 0,000). I de transplanterte svulster i tumorbærende gruppe, Ly49I mRNA uttrykk nivå av NK-celler i høy metastase gruppen var også bemerkelsesverdig høyere enn lav-metastase gruppe (
p
= 0,001).
Videre, en høyere resistent overfor cytotoksiske aktivitet av NK-celle eksisterer i den humane høy-metastatisk stor celle lungekreft cellelinjen L9981, som er mye høyere enn den i den lave metastatisk stor celle lungecancer cellelinje NL9980. I tillegg er det mulig at andre reseptorer av NK-celler endres i tumormiljøet.
