Abstract
Bakgrunn
In vitro
cellekultur eksperimenter med primærceller har rapportert at celleproliferasjon er tilbakestående i nærvær av ambient forhold til fysiologiske O
2 nivåer. Kreft er i første rekke en sykdom av avvikende cellevekst, derfor, å studere kreftceller dyrket under omgivelses O
2 kan være uønsket. For å forstå bedre effekten av O
2 på spredning av kreftceller
in vitro
, vi sammenlignet vekstpotensialet av et panel av eggstokkreft cellelinjer i henhold til omgivelses (21%) eller fysiologisk (3% ) O
2.
hovedfunnene
Våre observasjoner viser at tilsvarende primære celler, mange kreftceller opprettholde en iboende følsomhet for O
2, men noen skjerm ufølsomhet overfor endringer i O
2 konsentrasjon. Videre analyser viste en sammenheng mellom defekt G2 /M cellesyklus overgang regulering og O
2 ufølsomhet resulterende fra overekspresjon av 14-3-3 σ. Målrette 14-3-3 σ overekspresjon med RNAi restaurert O
2 følsomhet i disse cellelinjene. I tillegg fant vi at metastatiske ovarietumorer ofte overuttrykker 14-3-3 σ, som sammen med fosforylert RB, gir dårlig prognose.
Konklusjoner
Kreftceller vise differensial proliferativ følsomhet for endringer i O
2 konsentrasjon. Selv om en direkte kobling mellom O
2 ufølsomhet og metastase ikke ble bestemt, denne undersøkelsen viste at en O
2 ufølsom fenotype i kreftceller til å korrelere med metastatisk tumorprogresjon
Citation. Ravi D, Chen Y, Karia B, Brown A, Gu TT, Li J et al. (2011) 14-3-3 σ Expression Effects G2 /M Response til oksygen og korrelerer med eggstokkreft metastasering. PLoS ONE 6 (1): e15864. doi: 10,1371 /journal.pone.0015864
Redaktør: Janine Santos, medisinske og odontologiske av New Jersey, USA
mottatt: 26 august 2010; Godkjent: 25 november 2010; Publisert: 10 januar 2011
Copyright: © 2011 Ravi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av NIEHS (K22-ES12264) og en Voelcker Fund Young Investigator Award fra Max og Minnie Tomerlin Voelcker Fund til AJR Biskop. Kleberg Senter for molekylære markører ved MD Anderson Cancer Center, The MD Anderson Cancer Center Lege Scientist Program, McNair Scholars Program støttes av Robert og Janice McNair Foundation og American Society of Clinical Oncology (ASCO) kreft foundation Career Development Award (CDA ), Cancer Foundation og av en Science Foundation Irland (SFI) /Helse Board (HRB (Irland)) translasjonell forskningspris (TRA), alle til BT Hennessy. B. Karia støttes av DOD CDRMP Breast Cancer Research Program Predoctoral Praksisplass Award (BC093931). A. Brown er støttet av NIA T32 trening stipend (T32AG021890). Y. Chen støttes av NIH /NCI Cancer Center stipend (P30 CA054174-17) og NIH /NCRR CTSA stipend (1UL1RR025767). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP avledet fra kreftpasienter gir et eksperimentelt manipulere modellsystem som forenkler etterforskning kreft biologi og dens behandling. Den ubegrensede spredning potensialet av cancerceller er en viktig kjennetegn på malignitet, men ved bruk av standard protokoller vevskultur begrenser ofte celleproliferasjon, som observert med primære cellelinjer [1], [2], [3], [4]. Selv om bruk av fysiologiske betingelser er kjent for å påvirke
in vitro
proliferasjon av cancerceller [5], [6], [7] og primærceller er kjent for å forplante seg bedre ved fysiologisk O
2, virkningen av fysiologiske O
2 på
in vitro
kreftcelle spredning er relativt uutforsket. Imidlertid har det blitt rapportert at endrede konsentrasjoner av O
2 gir klare forskjeller i celleproliferasjon og respons på behandling i kreftcellene [8], [9], [10].
Oxygen i tillegg til næringsstoffer og vekstfaktorer, er avgjørende for riktig cellevekst og dens tilgjengelighet har en direkte innvirkning på cellulær metabolisme, signalveier, proliferasjon, differensiering og overlevelse [3], [11], [12], [13]. Mange
in vitro
undersøkelser har vist fordelene med fysiologisk O
2 for vev kultur. For eksempel, den biologiske oppførsel av primære cellekulturer med en fysiologisk konsentrasjon av O
2 (2,7 til 5,3%) er langt overlegen i forhold til standard praksis med voksende cellene under atmosfærisk eller «omgivelsestemperatur» O
2 konsentrasjon ( 21% O
2) [4]. Faktisk er disse to vekstforhold kjent å gi tydelig metabolske og molekylære egenskaper [13].
Betydningen av å vurdere O
2 spenninger i kreft biologi er godt etablert. For eksempel, har det faktum at mange krefttyper finnes i en «hypoksisk «tilstand ført til utvikling av hypoksi-rettet terapi [14], [15]. Generelt er det hypoksiske konsentrasjon på O
2 er mindre enn 1% for de fleste solide svulster, men den hypoksiske konsentrasjonen kan variere basert på celletyper og normal perfusjon status [16] og i tillegg har en tendens til hypoksi for å inhibere celleproliferasjon [ ,,,0],17]. Fysiologisk O
2 spenningen varierer 2,7 til 5,3% i mellomrommet [18], hvor mange primære svulster bor, til 14,7% i den arterielle sirkulasjonen og lungene, der migrering og potensielt metastatiske kreftceller er ofte funnet. Derfor kreft studier som kun er gjennomført i ambient (21%) O
2 kan gå glipp av relevante biologiske observasjoner. Dette kan være spesielt viktig når man forsøker å studere utviklingen av kreft til metastatisk sykdom, som er en viktig hendelse i kreft etiologi og er assosiert med dårlig prognose [19]. Tatt i betraktning forskjellene i O
2 spenning i forskjellige avdelinger av kroppen, en forståelse av virkningen av O
2 konsentrasjon på kreftcelleformering kan gi nyttig innsikt i de som er involvert i den patologiske utviklingen av kreft mekanismer.
kreft~~POS=TRUNC celler~~POS=HEADCOMP som har fått mutasjoner i enten onkogener eller tumorsuppressorgener vise en karakteristisk ukontrollert spredning fenotype [20]. For eksempel tumor dempere som p53 eller RB fungere som «molekylære portvakter» kjent for å påvirke cellesyklusprogresjon. Mutasjon av slike faktorer muliggjør ubegrenset proliferasjon i kreftceller [20]. Cellesyklusprogresjon omfatter en sekvensiell serie av hendelser katalysert av cykliner og cyklin-avhengige kinaser (CDK) [21], og i normale celler er en tett regulert prosess. Den tumor suppressor p53 er en hovedregulator av G1 /S og G2 /M-fase overgang i cellesyklusen [22] og er kjent for å ha en viktig rolle i å svare på oksygenkonsentrasjonen, spesielt hypoksi (mindre enn 1% O
2) [23] eller hyperoksi (95% O
2) [24]. Selv om å undersøke effekten av ekstreme O
2 betingelser er viktig og avslørende, må det bemerkes at disse tidligere undersøkelser ikke undersøke responsen til p53 ved fysiologisk (3%) O
2 og omgivelsene (21%) O
2. p21 og 14-3-3 σ er transkripsjonelle mål for p53 som er involvert i regulering G1 /S og G2 /M-overganger av cellesyklus ved å målrette mot CDK2 og CDC2 (også kjent som CDK1), henholdsvis [22], [25] . Den CDK i sin tur regulerer RB-protein funksjon, for å mediere cellesyklusprogresjon gjennom G1 /S og G2 /M [26]. Derfor, forstyrrelser av RB-funksjon kan også påvirke kontroll av cellesyklusutvikling [26]. Tatt i betraktning at forskjeller i O
2 -konsentrasjon resultat i endrede cellecyklusprogresjonen i primærceller, men kreftceller ofte vise cellesykluskontroll defekter, det er helt klart en mulighet for at disse feilene kan påvirke hvordan kreftceller svare på endret O
2 nivåer på en måte som kan ha stor innvirkning på kreft progresjon.
Her er vi undersøkte den biologiske oppførsel av eggstokkreft celler under fysiologiske og ambient O
2. Interessant nok, noen av ovarie cancer-cellelinjer hadde en normal respons på O
2 konsentrasjon (
ie
redusert celleproliferasjon med øket O
2-konsentrasjon), mens proliferasjonen av andre eggstokkkreftcellelinjer var upåvirket av denne O
2 økning. Videre våre undersøkelser avslørte at 14-3-3 σ og dens rolle i cellesyklusen påvirker den proliferative respons til endrede O
to nivåer. Tatt i betraktning variasjonen i partialtrykket av oksygen i hele kroppen, og den potensielle betydning at denne forbindelse kan ha på kreft progresjon, er det viktig å forstå virkningen av O
2 konsentrasjon på kreftcellevekst og progresjon av kreft. Vi gir bevis for at kjøpet av O
2 ufølsomhet kan være en komponent i kreft progresjon og et kjennetegn på vellykkede metastatisk sykdom.
Resultater
Fysiologiske oksygen fører til økt celledeling i eggstokkreft celler
i våre innledende studier vi sammenlignet effekten av fysiologiske (3% O
2) og ambient (21% O
2) oksygenkonsentrasjonen ved hjelp A2780 eggstokkreft celler og observert at 12 dager cellekultur under disse betingelser resulterte i en 2,6 gangers veksthemming under 21% O
2 (figur 1). Derfor undersøkte vi effekten av O
2 konsentrasjon på vekstpotensialet av seks eggstokkreft cellelinjer ved hjelp av fysiologiske (3% O
2) og ambient (21% O
2) oksygenkonsentrasjoner. Siden serum til stede i cellekulturmedium kan også ha en dominerende innflytelse på vekst, vi også testet virkningen av forskjellige konsentrasjoner av serum. Uavhengig av mengden av serum tilstede i vekstmediet, dyrking i 21% O
2 vanligvis resulterte i en signifikant reduksjon i celleformering for fire av ovarian cancer-cellelinjer (A2780, OVCAR5, OVCAR8 og HOC8) sammenlignet med tre % O
2 (figur 2). Det eneste unntaket var observert med HOC8 celler i nærvær av den høyeste konsentrasjon av serum (10% v /v), hvor en ubetydelig O
2-avhengig vekst effekt ble observert (figur 2). Antagelig den manglende respons i Hoc8 resultater fra en dominerende innflytelse av serum, som ikke ble observert med A2780, OVCAR5 og OVCAR8. I motsetning til dette var det ingen signifikant effekt på veksten av SKOV3 og HeyA8 cellelinjer ved å øke O
2-konsentrasjonen til 21%, uavhengig av serumkonsentrasjoner (figur 2). Den observerte Unntaket var HeyA8 dyrket med 2% serum, som viste redusert celleproliferasjon på 21% O
2 mot 3% O
2 (
p
0,001). I motsetning til effekten av O
2 plan, økning av konsentrasjonen av serum resulterte i en proporsjonal økning i vekst ovarian cancer cellelinjer A2780, OVCAR5 og OVCAR8 (
p
10
– 5, figur 2). Konsentrasjonen av serum hadde en moderat påvirkning på vekst i SKOV3 og HeyA8 (figur 2); en serumkonsentrasjon mellom 2 og 6% hadde en signifikant effekt (
p
10
-5) i SKOV3, mens HeyA8 serumkonsentrasjon mellom to og 10% serum hadde størst effekt på 3% O
2 (
p
10
-5) (figur 2). Økende serumkonsentrasjon fra 6% til 10% hadde liten effekt på veksten av HeyA8, SKOV3 og HOC8 (figur 2). Sammen, viser det seg at både oksygennivå og serumkonsentrasjons påvirke veksten av disse ovarian cancer-cellelinjer, men i en uavhengig måte. Som forventet fra arbeid med andre med primærceller [4], observerte vi at de fleste av eggstokkreft celler viste nedsatt celleformering ved omgivelses O
2-konsentrasjon sammenliknet med fysiologisk O
2-konsentrasjon. Men gjorde to cellelinjer ikke ut til å ha hemmet celleproliferasjon ved høyere (ambient) O
2 nivåer. Vi kategorisert derfor eggstokkreft cellelinjer basert på disse forskjellene, er enten O
2 sensitive (A2780, OVCAR5, OVCAR8 og HOC8) eller ufølsom (SKOV3 og HeyA8) (figur 2). Samlet er disse forskjellene tyder heterogenitet i vekstregulering svar på fysiologiske signaler fra O
2 nivåer i disse dyrkede cellelinjer.
like mange A2780 eggstokkreft celler ble sådd i en 10 cm petriskål og var rutinemessig holdes under 3% O
2 (fysiologisk) eller 21% O
2 (ambient). Økningen i celletall ble bestemt ved å telle manuelt en gang i tre dager, og det totale antall celler ble beregnet og plottet ved hjelp av lineær skala (i Graf A) og logg skala (i Graf B).
ovarian cancer cellelinjer ble dyrket under 3% eller 21% O
2, og graden av spredning ble bestemt etter 3 dagers vekst (se Materialer og metoder). For hver cellelinje, den prosent av celleproliferasjon ved 3% O
2 (lette skraverte søyler) og ved forskjellige konsentrasjoner av serum ble sammenlignet med spredning under standard vev kulturbetingelser som består av 21% (omgivende) O
2 (mørk fargede søylene) og 10% FBS. Feilstolpene representerer standardavvikene mener og statistisk signifikant (av student T Test) forskjeller i spredning mellom 3% og 21% O
2 for hver konsentrasjon av serum er merket med en stjerne [(*)
p
0,05, (**)
p
0,001 og (***)
p
. 0,0001]
Det er mulig at den tilsynelatende O
2 ufølsomhet og forskjeller i spredning resultat av forskjeller i doblingstiden for hver cellelinje. For eksempel, hvis SKOV3 og HeyA8 (O
2 ufølsomme cellelinjer) spre seg mer langsomt, O
2 avhengige endringer sprednings kan være for ubetydelig til å måle. Derfor har vi målt cellen dobling tid for alle eggstokkreft cellelinjer. Våre resultater viste at under vevskulturbetingelser standard (10% serum og 21% O
2) doblingstiden for alle ovarie cancer-cellelinjer var relativt lik ( 24 timer), bortsett HOC8, som hadde en forlenget doblingstiden på ca 45,5 ± 4,9 timer (Tabell S1, og se Metoder S1). Derfor er de fleste av eggstokkreft cellelinjer var å dele på en tilnærmet lik hastighet, og brutto forskjell i dobling tid er usannsynlig å være en faktor i de observerte forskjellene spredning mellom cellelinjer under forskjellige forhold.
Oxygen følsomhets korrelater med dynamiske endringer i S og G2 faser av cellesyklus
med tanke på forskjellene i spredning observert for eggstokkreft cellelinjer dyrket under enten 3% eller 21% O
2, vi undersøkt om O
2-konsentrasjonen endrer cellesyklusen profilen av hver cellelinje. Uavhengig av serumkonsentrasjon, sammenligner 3% O
2 til 21% O
2 resulterte i en betydelig reduksjon i prosentandelen av celler som var i G1 fasen av cellesyklusen, og en signifikant økning i prosentandelen av celler i S-fasen (tabell 1), noe som var forventet basert på tidligere observasjoner gjort med primærceller [27]. Videre i tre av O
2 sensitive cellelinjer (A2780, OVCAR5 og OVCAR8) den prosent av cellen befolkningen i G2 fasen ble økt betydelig i 21% O
2. Men en betydelig økning i G2 ble ikke observert i den fjerde O
2 sensitiv cellelinje, HOC8 (tabell 1). I likhet med HOC8, O
2 ufølsomme cellelinjer, SKOV3 og HeyA8, ikke viser et signifikant endring i andelen av celler i G2-fasen av cellesyklusen når den vokser under 3% O
2 eller 21% O
2 (tabell 1). Tatt i betraktning at O
2 sensitive cellelinjer proliferated saktere på 21% O
2 mot 3% O
2 til tross for at mindre andeler av sin cellepopulasjon i G1 og en økt andel i S og G2, vi konkludere med at disse cellene må utvikler mer langsomt gjennom cellesyklusen. Men for O
2 ufølsomme cellelinjer og HOC8 (med betydelig utvidet dobling tid), hadde vi ikke observere en betydelig økning i andelen av celler i G2 når O
2 nivåer ble økt. Disse resultater antyder at selv om G1 og S faser av cellesyklusen reagerer på samme måte overfor endringer i O
2-konsentrasjonen i både O
2 sensitive og ufølsomme cellelinjer, er det G2-fasen av cellesyklusen som er ikke responderer på O
2 -konsentrasjon i O
2 ufølsomme cellelinjer. Derfor kan forskjellen i cellesyklusen responsen observert med disse ovarie cancer cellelinjer være på nivå med regulering i løpet av cellesyklusprogresjon fra G2 til M fase. Det er også mulig at forandringene observert med G2 og O
2 følsomhet i disse kreftcellelinjer er reflektert i den mitotiske komponenten av cellesyklusen. Vår observasjon av mitotiske celler i O
2 sensitive og ufølsomme cellelinjer dyrket under 3% og 21% O
2 støtter denne konklusjonen; O
2 sensitive cellelinjer viser en forholdsmessig reduksjon i den mitotiske cellepopulasjonen ble observert ved 21% O
2 i forhold til 3% O
2, (figur 3), svarende til en akkumulering av celler i G2 på 21% O
2 (tabell 1). Tilsvarende i O
2 ufølsomme cellelinjer (HeyA8 og SKOV3) andelen av mitotiske celler forble uendret uavhengig av O
2 konsentrasjoner (figur 3). Dette er forventet fordi, som bemerket tidligere (tabell 1), andelen av celler i G2 i O
2 ufølsomme cellelinjer var også upåvirket av O
2-konsentrasjon. Vi konkluderer med at de fleste kreftcellene beholder en evne til å regulere cellesyklus i respons til endringer i O
2-konsentrasjon sammenlignes med villtypeceller [27]. Imidlertid kan noen kreftceller mister O
2 konsentrasjonsavhengig kontroll av cellesyklus (som i O
2 ufølsomme kreft cellelinjer), noe som resulterer i en distinkt fenotype.
mitotisk indeks i eggstokkene kreftcellelinjer som ble dyrket med 3% eller 21% O
2 i 3 dager ble bestemt ved telling av kjerner med kondensert kromosomer, blant de minst 1000 celler som er tilstede i hvert eksperiment. Statistisk signifikans ble bestemt av ANOVA og signifikant forskjell i mitotisk indeks mellom 3% og 21% O
2 er merket med en stjerne [(*)
p
0,05, (***)
p
0,0001]
Oksygen ufølsomhet korrelerer med endrede G2 /M komponenter
Så langt har vi vist at O
2. sensitiv cellesyklus respons på G2 /M overgang mangler i O
2 ufølsomme cellelinjer. Vi gikk derfor inn for å karakterisere denne observasjonen ytterligere ved å bestemme hva komponent i G2 /M regulering er mangelfull i O
2-insensitive kreftceller. Den store effektor av G2 /M overgang er CDC2 [22], [28]. CDC2 danner et kompleks med cyclin B [29], [30], som fosforylerer ulike strukturelle proteiner som resulterer i sammenbruddet av den kjernefysiske konvolutten, kondens og segregering av kromosomer [30], [31] og inaktivering av andre cellesyklusregulerende proteiner slike som WEE1, RB og CDC25C [30], [32]. I normale celler, blir de totale nivåer av protein CDC2 holdes konstant gjennom hele cellesyklusen [33] og er regulert av post-translasjonell modifikasjon [33] og cellulær lokalisering [30], [31]. Når Tyr15 residuet på CDC2 blir defosforylert ved CDC25C danner aktivert CDC2 et kompleks med cyclin B, akkumuleres i kjernen, og fremmer G2 /M overgang [30], [33], [34]. Dette skjer på en trinnvis måte gjennom økende mengder av kjerne CDC2 protein [30]. Vår undersøkelse av total CDC2 protein og fosforylert CDC2 protein avdekket at begge er betydelig lavere i O
2-ufølsomme cellelinjer (HeyA8 og SKOV3) sammenlignet med O
2-sensitive cellelinjer (figur 4A). Selv om nivåene av CDC2 var relativt høy i O
2-sensitive cellelinjer (A2780, OVCAR5 og OVCAR8) (figur 2), vi observerte en nedgang i Tyr15 fosforylering status uavhengig av O
2 konsentrasjonen for A2780, OVCAR5 og OVCAR8 med økende serumnivåer (figur 4A). Dette samsvarer med den observasjon at ved å øke serumkonsentrasjonen fører til økt cellulær proliferasjon og resulterer i en samtidig reduksjon i andelen av celler i G2 /M (sammenlign med tabell 1). Det ble imidlertid ikke utilslørt O
2 avhengig endring i totalt eller fosforylert cyclin B eller CDC25C observert i O
2 sensitive cellelinjer (A2780, OVCAR5, OVCAR8 og HOC8) sammenlignet med O
2 ufølsom -cellelinjer (HeyA8 og SKOV3) (figur 4A). Derfor ser det ut til at den observerte nedgang i cellepopulasjonen i G2 i 21% O
2 ikke kan være avhengig av fosforylering-mediert inaktivering av CDC2. Det bør bemerkes at disse forsøk ble utført i asynkront voksende celler og derfor er det mulig at forbigående endringer i CDC2 status ble savnet. Interessant, nivåene av CDC2, syklin B og CDC25c (negativ regulator av CDC2) var betydelig lavere i O
2 ufølsomme cellelinjer (HeyA8 og SKOV3) sammenlignet med O
2-sensitive cellelinjer (A2780, OVCAR5, OVCAR8 og HOC8) (figur 4A). Disse observasjonene tyder på en iboende mangel i de viktigste komponentene som er involvert i G2 /M progresjon i O
2 ufølsomme cellelinjer.
Protein lysates preparert fra eggstokkreft cellelinjer opprettholdes i vekstmedium som består av økende konsentrasjoner av serum og 21% eller 3% O
2 ble analysert ved hjelp av Western blot. (A) sammenlignet med O
2 sensitive cellelinjer, redusert ekspresjon av de viktigste komponentene som er involvert i G2 /M-cellesyklusprogresjon CDC2 /cyklin B1-komplekset og dets aktivator CDC25c er observert i O
2 ufølsomme cellelinjer ( angitt med stjerne og kursiv), mens ekspresjonen av 14-3-3 σ, et protein som inhiberer CDC2 er opphøyd i O
2 ufølsomme cellelinjer. (B) fosforylering av RB og Wee1 ble overvåket som en indikator for CDC2 funksjon fordi både RB og Wee1 er kjent mål for fosforylering av CDC2. Lik belastning av proteinekstrakter ble overvåket ved å måle de avisolerte Western blots med det primære antistoff for β-aktin.
p53, p21 og 14-3-3 σ er faktorer som har evnen til å negativt påvirke CDC2 aktivitet og G2 /M overgang [22]. Nåværende forståelse er at p53 og p21 innflytelse cellesyklus i hypoksisk og hyperoksiske betingelser [23], [24], [35], [36]. Med tanke på reduserte nivåer av CDC2 og tilsynelatende defekt G2 /M sjekkpunkt i O
2 ufølsomme cellelinjer (HeyA8 og SKOV3), utforsket vi muligheten for at verdifall skyldes en feil i noen av disse molekylære regulatorer. Western blot-analyse funnet p53 og p21 å være overuttrykt i en O
2-insensitive cellelinje (HeyA8). Men begge var fraværende i den andre O
2-insensitive cellelinje (SKOV3), og uttrykket mønster for disse proteinene forble uforandret, uavhengig av endringer i O
2 eller serumkonsentrasjon (figur S1), noe som tyder på at hverken p53 eller p21 er relevant for CDC2 funksjon i O
2 følsomhet. Interessant, observerte vi en betydelig heving i uttrykket av 14-3-3 σ (figur 4A) i O
2 ufølsomme cellelinjer (HeyA8 og SKOV3) sammenlignet med O
2-sensitive cellelinjer. Selv om nivået av 14-3-3 σ ekspresjon var betydelig lavere i alt O
2-sensitive cellelinjer sammenlignet med HeyA8 og SKOV3, vi observere en økning i ekspresjon av 14-3-3 σ ved 21% O
2 med A2780 (figur 4A). Selv om motstridende til den kjente hemmende rolle 14-3-3 σ på CDC2 aktivitet, konkluderte vi med at høye nivåer av 14-3-3 σ kombinert med reduserte nivåer av CDC2 i en prolifererende kreftcelle kan indikere en mangel på kontroll av G2 /M progresjon i respons til O
2 nivåer.
for å klargjøre konsekvensen av lave nivåer av CDC2 protein observert i O
2-ufølsomme cellelinjer, bestemt vi den funksjonelle aktiviteten av de gjenværende CDC2 ved å undersøke fosforylering av to av sine substrater, RB og WEE1. Fosforylering av RB i Ser 807 residuet medieres av CDC2 [32], og vi har observert dette fosforylering uavhengig av CDC2 nivåer eller O
2 nivåer med 10% serum for alle cellelinjer med unntak av HOC8 (figur 4B), som indikerer usvekket CDC2 aktivitet i disse cellelinjene. En reduksjon i fosforylert RB korrelert med reduksjon av serumkonsentrasjon (figur 4B) og korrelert med økt akkumulering av total RB i O
2-sensitive cellelinjer (A2780, OVCAR5 og OVCAR8), men ikke i HOC8 (figur 4B) . Total RB var knapt synlig i O
2-ufølsomme cellelinjer (HeyA8 og SKOV3) (figur 4B), med unntak av 2% serum ved 3% O
2 tilstand i HeyA8 cellelinje. Interessant, en sammenligning mellom den RB uttrykksmønster (figur 4B) og celleproliferasjon (figur 2) viste at HOC8, HeyA8 og SKOV3-celler vokse bedre i cellekulturmedium med en lav konsentrasjon av serum (2%) i forhold til A2780, OVCAR5 og OVCAR8. Det viser seg derfor at det totale RB-proteinnivået reaksjon forblir intakt i O
2-sensitive cellelinjer, og at denne responsen er sannsynligvis mer relevant for serumkonsentrasjoner enn O
to nivåer. Det andre mål for CDC2-mediert inaktivering ved fosforylering er WEE1, som også kan gjensidig hemme CDC2 funksjon ved fosforylering [37]. Vi observerte økt fosforylering av WEE1 i O
2 sensitive cellelinjer (A2780, OVCAR5 og OVCAR8), knapt påvisbare nivåer i HOC8, (figur 4B) og et fullstendig fravær i O
2-insensitive cellelinjer ( HeyA8 og SKOV3, figur 4B). Dette mønsteret ble i stor grad rekapitulert for total WEE1 proteinnivå (figur 4B). Derfor ikke fravær av fosfor-WEE1 i O
2-ufølsomme cellelinjer indikerer fravær av CDC2 aktivitet, men heller et fravær av WEE1 underlaget. Fra disse resultatene vi konkluderte med at til tross for reduserte mengder CDC2 i O
2-ufølsomme cellelinjer, er CDC2 funksjonelt aktiv og uhemmet av den økte nivåer av 14-3-3 σ. Det bør bemerkes at RB og CDC2 virker på hverandre for å regulere hverandres funksjon [38], og fosforylering av RB-status [26] eller CDC2 [39] kan påvirke E2F-mediert ekspresjon av cykliner som er essensielle for cellesyklusprogresjon. Derfor vurderer dette komplekse forholdet mellom RB og CDC2 er fosforylering mønster av RB utilstrekkelig til å forutsi G2 /M progresjon.
I sammendraget, O
2-sensitive cellelinjer (A2780, OVCAR5 og HOC8 ) viste økt uttrykk av CDC2 og cyclin B kombinert med lavt nivå av 14-3-3 σ uttrykk. Dette tyder på at cellesyklus komponenter som kreves for en dynamisk proliferativ respons til forskjeller i O
2-konsentrasjonen er til stede i disse cellelinjene. Men i O
2-ufølsomme cellelinjer som uttrykker høye nivåer av 14-3-3 σ og lave nivåer av CDC2 og CDC25C en slik dynamisk cellesyklus respons til endringer i O
2-konsentrasjonen kan være svekket. Vi fulgte derfor muligheten for at dette invers korrelasjon mellom 14-3-3 σ og CDC2 kan være viktig for O
2-sensitive regulering av G2 /M overgang.
14-3-3 σ og mitotisk progresjon i oksygen følsomhet
Våre tidligere observasjoner tyder på en sammenheng mellom forhøyet nivå av 14-3-3 σ og O
2-ufølsomhet som må bekreftes. Derfor ønsket vi å få bekreftet at 14-3-3 σ gjør faktisk påvirker O
2-avhengige spredning. For denne delen av studien, begrenset vi vår analyse til to cellelinjer med villtype p53: O
2-sensitive A2780 [40], og O
2-ufølsomme HeyA8 cellelinjer [41]. Så langt har vi brukt Western blot analyse for å overvåke den generelle uttrykk nivåer av 14-3-3 σ og CDC2 (figur 4A). Men siden de funksjonelle responser av disse proteiner er avhengig av deres cellulær lokalisering, brukte vi immunofluorescens for å bestemme deres cellulære plassering i henhold til 3% O
2 og 21% O
2. I O
2-sensitive A2780 cellelinje, ble lokaliseringen av 14-3-3 σ begrenset til cytoplasma i henhold til 3% O
2 (figur 5A), men ble funnet i både kjernen og cytoplasmaet hos 21% O
2 (figur 5A). CDC2 ble fordelt i hele cellen og dens lokalisering var upåvirket av O
2 konsentrasjon. Det synes derfor at atom utelukkelse av 14-3-3 σ korrelerer med en redusert andel av celler i G2 /M-fase og en uhemmet cellesyklusprogresjon når A2780 dyrkes på 3% O
2, som bemerket tidligere (tabell 1). I motsetning til dette, vil O
2-insensitive HeyA8 cellelinjen viste høye nivåer av 14-3-3 σ og lave nivåer av CDC2 (figur 4A), med en betydelig mengde av 14-3-3 σ i cytoplasma (figur 5A). Videre, 14-3-3 σ forble utelukket fra kjernen, selv ved 21% O
2 i den HeyA8 celler (figur 5A). Disse observasjonene ble ytterligere bekreftet ved Western blot analyse av kjernefysiske og cytosoliske cellefraksjoner som oppnås fra disse cellene (Figur 5B). Til slutt, for å bekrefte effekten på G2 /M overgang, bestemt vi andelen av disse cellene i M fase for forskjellige O
2 konsentrasjoner ved hjelp av mitose spesifikk markør fosfor-histon H3. I O
2-sensitive A2780 celler, under 21% O
2, observerte vi en nedgang i mitotisk indeks (P 0.001), sammenlignet med 3% O
2 (figur 5C). Ingen slik O
2 avhengig endring i mitotisk indeks ble observert for O
2-ufølsomme HeyA8 celler (figur 5C). Disse resultatene støtter vår første konklusjon, at O
2-ufølsomme cellelinjer har en mangel i å regulere cellesyklusprogresjon på G2 /M som svar på økt O
2 nivåer (figur 2).
(A) Cellular lokalisering av immunofluoresence viser at 14-3-3 σ (grønn) ligger i cytoplasma og CDC2 (Red) er til stede i kjernen (blå). Sammenlignet med O
2 sensitive A2780 celler, nivået på 14-3-3 σ er høyere og CDC2 er lav i O
2 ufølsomme HeyA8 celler. I O
2 sensitive A2780 er 14-3-3 σ lokalisert både i kjernen og cytoplasma med 21% O
2. (En stiplet gul linje, skisserer en representant kjerner for å indikere relativ lokalisering av 14-3-3 σ og CDC2 i disse cellene). (B) Western blot-analyse av nukleære og cytoplasmiske fraksjoner som viser lave nivåer av 14-3-3 σ i kjernen i forhold til cytoplasma, med økte mengder 14-3-3 σ er tilstede i cytoplasma i O
2 ufølsomme HeyA8 celler. Nivået av CDC2 er høyere både i kjernen og cytoplasmaet i O
2 følsom A2780, men til stede i mindre mengde bare i kjernen for O
2 ufølsomme HeyA8 celler. Histone H1 og β-actin ble brukt som laste kontroller for kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner, henholdsvis. (C) Mitotiske celler ble bestemt ved telling av celler som farget positivt for en mitose spesifikk markør, fosfo-Histone H3 fra den totale cellepopulasjonen. (C).
