Abstract
Nucleolin er innblandet å spille en rolle i angiogenese, en viktig prosess i tumorvekst og metastasering. Men tilstedeværelsen og kliniske relevansen av nucleolin i menneskets ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er fortsatt i stor grad ukjent. I denne studien utforsket vi uttrykket og prognostiske implikasjon av nucleolin i kirurgisk resected NSCLC pasienter. En kohort av 146 NSCLC pasienter som gjennomgikk kirurgisk reseksjon ble valgt for tissue microarray. I dette vevet microarray, ble nucleolin uttrykk målt ved immunfluorescens. Farging for CD31, en markør for endotelceller, ble utført for å markere blodkar. En Cox modellen ble brukt til å vurdere den prognostiske betydningen av nucleolin. Nucleolin ekspresjon ble observert i 34,2% av alle pasienter, og 64,1% i høy CD31 ekspresjon pasienter. Den sykdomsfri overlevelse (DFS) var signifikant kortere hos pasienter med høy nucleolin (CD31
hiNCL
hi) sammenlignet med pasienter med lav tumorblodårer (CD31
loNCL
LO) (5 YS DFS 24% vs 64%,
p
= 0,002). En slik forskjell ble påvist i følgende stratifiserte analyser: stadium I (
p
0,001), plateepitelkarsinom og adenosquamous cell carcinoma (
p
= 0,028), liten tumor ( 5 cm,
p
= 0,008), og kirurgi alene (
p
= 0,015). Multivariat analyse videre avdekket at nucleolin uttrykk uavhengig spådd for lavere overlevelse (
p
= 0,003). Denne studien viser at nucleolin er assosiert med kliniske resultater i postoperative NSCLC pasienter. Dermed kan uttrykket nivåer av nucleolin gi en ny prognostisk markør for å identifisere pasienter med høyere risiko for behandlingssvikt, spesielt i enkelte undergrupper
Citation. Zhao H, Huang Y, Xue C, Chen Y Hou X Guo Y, et al. (2013) Prognostic Betydningen av den kombinerte Score av endotel Expression of Nucleolin og CD31 i Kirurgisk reseksjon ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 8 (1): e54674. doi: 10,1371 /journal.pone.0054674
Redaktør: Mitsunobu R. Kano, Okayama University, Japan
mottatt: 16 juli 2012; Akseptert: 17. desember 2012; Publisert: 31 januar 2013
Copyright: © 2013 Zhao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall i. menn og kvinner [1]. Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) står for ca 85% av all lungekreft, og det er vanligvis forbundet med dårlige resultater. Tilbakefall av NSCLC er betydelig høy hos pasienter med komplett reseksjon av primærtumor, som står for den høyeste kreftrelatert dødelighet på verdensbasis. For stadium I /II NSCLC, er tilbakefall rundt 35-67% og 5-års overlevelse varierer fra 33-63% [2], [3]. Faktisk er de fleste behandlingssvikt skyldes i stor grad fjerne tilbakefall.
Angiogenese er en kritisk prosess i løpet av tumorutvikling og metastase [4], [5]. Det er blitt vist at neoangiogenesis er en vesentlig faktor prognostisk for både total overlevelse og sykdomsfri overlevelse i lungekreft [6] – [12]. Tallrike studier har målt tumormicrovessel tetthet (MVD) av CD31 flekker. Men fortsatt er sammenheng mellom MVD og overlevelse hos pasienter med lungekreft uavklart [13].
Nucleolin er en allestedsnærværende ikke-histone protein som opprinnelig ble isolert fra nucleolus [14]. Som en multifunksjonell protein, spiller nucleolin grunnleggende roller i mange viktige prosesser, herunder celleproliferasjon, ribosom montering, rDNA transkripsjon, pakking av pre-RNA, og organisering av nukleolært kromatin [15], [16]. Men, samler bevis indikerer at nucleolin kan shuttle til cytoplasma og membran fra nucleolus [17] – [20]. Selv om nucleolin hovedsakelig er lokalisert i den kjerne, er det også blitt funnet på celleoverflaten av en rekke celletyper i en fosforylert form [21]. Nylig ble nucleolin ekspresjon observert på overflaten av endotelceller i voksende tumorblodkarene [22], [23]. I fravær av celleoverflate nucleolin, endotelcellene delvis mistet sin motilitet og mislyktes i å danne tubulære strukturer [24]. Videre, som en ny funksjonell reseptor for endostain, er nucleolin ansvarlig for potente antiangiogene og antitumor-aktivitet av endostain [25], [26]. Tidligere studier har funnet nucleolin uttrykk lokalisert til de fleste blodkar xenograft tumorer, noe som antyder den potensielle engasjement av nucleolin i tumor angiogenese [23], [26]. Men så langt er det i dag få rapporter som studerer effekten av nucleolin i menneskelig NSCLC.
Basert på tidligere studier av prognostiske biomarkører i NSCLC pasienter [27], [28] og involvering av nucleolin i tumor angiogenese, vi antatt at nucleolin kan fungere som en viktig markør for tumor neoangiogenesis og er assosiert med en dårlig prognose i begynnelsen av NSCLC etter radikal kirurgi. I denne studien undersøkte vi sammenhengen mellom nucleolin uttrykk og clinicopathogical variabler i 146 betjenes NSCLC.
Materialer og metoder
Pasienter
Det er totalt 146 sammenhengende NSCLC pasienter behandlet med radikal kirurgi fra august 2000 til november 2004 på Cancer Center of Sun Yat-Sen universitetet ble inkludert i denne studien. Studien ble godkjent av Medical Ethics Committee of Sun Yat-Sen University. Pasienter med tidligere historie av ondartede sykdommer ble ekskludert. Tumor vevsprøver og oppfølgingsdata var tilgjengelig for alle inkluderte tilfeller. Pasient demografi er oppført i tabell 1. klasse av tumor differensiering ble bestemt i henhold til kriteriene for Verdens helseorganisasjon. Den patologisk Tumor-Node-metastaser (TNM) status ble vurdert av TNM-klassifikasjon av International Union mot Kreft (UICC, 2002). Sykdomsfri overlevelse ble definert som perioden fra datoen for operasjonen til dato for sykdomsprogresjon eller død. Hvis det ikke er observert sykdomsprogresjon eller død på slutten av oppfølging, ble sykdomsfri overlevelse definert fra dato for operasjonen til den siste tiden av svulst evaluering. Total overlevelse ble definert som perioden fra datoen for operasjonen til dødsdato eller siste oppfølging. Bone metastase tid ble definert fra dato for operasjonen til datoen for bein metastasering. Hvis ingen bein metastase ble notert i den siste oppfølging, ble bein metastase tid beregnes intervallet fra dato for operasjonen til den siste tiden av svulst evaluering. Startdatoen for neoadjuvant kjemoterapi ble ignorert. Sluttdato for oppfølgingsstudie var 3. mars 2010. Median oppfølgingstid på 70,8 måneder. (Område: 10.4-114 måneder)
Bygging av microarray (TMA)
TMA ble konstruert i henhold til en fremgangsmåte som tidligere er beskrevet [29]. I korthet, den individuelle donorvevet blokken og den tilsvarende hematoxylin og eosin (H . 0,05
Resultater
Cohort Beskrivelse og kliniske Prediktorer
De kliniske og patologiske egenskapene til hver pasient er oppført i tabell 1. bety svulst størrelsen var 4,25 cm (rekkevidde, 1-12 cm). Seksti av 146 pasienter (41%) som gjennomgikk kirurgi også mottatt kjemoterapi eller strålebehandling. Tumorprogresjon ble registrert i 71 pasienter (49%), med fjernmetastaser hos 62 pasienter og lokalt tilbakefall i 9 pasienter. Femti-tre pasienter (36%) døde i løpet av oppfølgingstiden. Den estimerte 5-års sykdomsfri overlevelse var 47% (95% KI, 40,7% -59,3%) og 5-års overlevelse rente var 69% (95% KI, 63,2% -78,7%) for alle 146 pasienter. Som forventet, univariate analysen viste signifikante assosiasjoner kreft differensiering, tumorstørrelse, N scenen, og patologisk scenen med både sykdomsfri overlevelse og total overlevelse. Men behandlingsform ble bare forbundet med sykdomsfri overlevelse, men ikke total overlevelse (tabell 1).
Nucleolin Expression i NSCLC
Nucleolin ble påvist i 50 pasienter ut av den totale pasient kohorten (34,2%). Videre analyser med patologiske faktorer avslørte at nucleolin uttrykk var signifikant forbundet med store svulster (≥5 cm) (store versus små: 44,4% vs 28,3%,
P
= 0,047). Det var ingen signifikante sammenhenger mellom nucleolin og andre faktorer som alder, kjønn, histologisk subtype, kreft differensiering og patologiske etapper.
Spesielt var høy CD31 uttrykk bemerket i 53,2% av hele kullet (n = 78 ). Nucleolin ble colocalized med pan-endothelial markør CD31 i alle 50 pasienter med nucleolin uttrykk (64,1%). Men nucleolin var fraværende i andre 28 pasienter med CD31 uttrykk. Disse funnene tyder på en mulig rolle for nucleolin i utvikling av tumor angiogenese. Pasientene ble videre delt inn i tre grupper basert på status for nucleolin og CD31 uttrykk (figur 1). Dette inkluderte høy forekomst av tumorblodkarene med nucleolin uttrykket (CD31
hiNCL
hi), en gjennomsnittlig blodkar antall på mer enn 10 /felt, og typisk blodkar morfologi bør være innlysende. Videre er ekspresjonsnivået av NCL på disse tumorblodkarene er betydelig høyere (i det minste 2 ganger høyere midlere fluorescensintensitet, målt ved Nikon NIS-elementer Software) enn basal NCL nivå innenfor hele tumor region. Økt samlokalisering ble også observert mellom CD31 positive rørformede strukturer og NCL positive områder. Pasientene ble også delt av den høye forekomsten av tumorblodårer uten nucleolin uttrykk (CD31
hiNCL
lo). Disse kriteriene omfatter en tilsvarende høy blodåre tetthet som de av CD31
hiNCL
hi-gruppe, ekspresjonsnivå av NCL på tumorblodkarene ikke var signifikant høyere (mindre enn 2-ganger, betyr fluorescens-intensitet) enn den basale NCL nivå innenfor hele tumorvevet. Dessuten ble det ikke observert signifikante forskjeller mellom samlokalisering av CD31 positive rørformede strukturer og NCL positive områder.
Svulsten blodkar og nucleolin ble farget med anti-CD31 (grønn) og anti-nucleolin (rød) hhv. Kjerner ble farget med DAPI (blå). Representative bilder fra de tre gruppene ble vist her. (A) CD31
hiNCL
hei, (B) CD31
hiNCL
lo, (C) CD31
loNCL
lo. Scale bar, 50 mikrometer.
Når det gjelder lav tumorblodårer (CD31
loNCL
LO), gjennomsnittlig antall blodkar med typiske rørformet struktur bør være mindre enn 10 /feltet. Disse tumor blodkar bør verken uttrykke høy nucleolin eller co-lokalisere med CD31 positive fartøy. Knapt noen lav blodåre tetthet-høy nucleolin uttrykk delen ble observert blant NSCLC seksjoner.
Univariat Survival Analysis
Vi brukte univariat analyse for å fastslå effekten av nucleolin uttrykk på overlevelse av NSCLC med resektable svulster. Overlevelsen data er presentert i tabell 2. Nucleolin uttrykk var signifikant assosiert med redusert sykdomsfri overlevelse (
P =
0,002, figur 2), men ikke påvirke total overlevelse (
P =
0,841 ). Stratifisert analyse viste en signifikant sammenheng med nucleolin uttrykk med sykdomsfri overlevelse hos pasienter med plateepitel eller adenosquamous cell carcinoma (
P =
0,028, figur 3), men ikke hos pasienter med adenokarsinom (
P =
0,061). Nucleolin uttrykk var også assosiert med sykdomsfri overlevelse når stratifisert av andre tumor egenskaper, for eksempel lav kreft differensiering (
P =
0,038, figur 3), median /høy kreft differensiering (
P =
0,01), kirurgisk behandling alene (
P =
0,015), og mindre tumorstørrelse (
P =
0,008, figur 3). Enda viktigere, nucleolin hatt en betydelig innvirkning på sykdomsfri overlevelse i fase I pasienter (
P
0,0001, figur 3), men ikke hos pasienter med stadium II til IIIA sykdom (
P =
0,374). Men det var ingen signifikante forskjeller for total overlevelse mellom de tre nucleolin grupper i forhold til kliniske og patologiske kreft variabler
HH. CD31
hiNCL
hei, HL: CD31
hiNCL
lo, og LL: CD31
loNCL
lo
HH. CD31hiNCLhi, HL: CD31hiNCLlo, og LL. CD31loNCLlo
Uniltivariate farer ratio analyse ble brukt til å vurdere signifikant sammenheng mellom nucleolin og sykdomsfri overlevelse. Totalt sett pasienter med nucleolin uttrykk (CD31
hiNCL
hi) hadde en høyere risiko for tilbakefall enn pasienter med lav tumorårer (CD31
loNCL
lo) (HR = 2,768, 95% KI 1,544 ~4.964,
P
= 0,001). Sammenlignet med den CD31
hiNCL
hi gruppe, CD31
hiNCL
lo gruppen hadde en lavere risiko for tilbakefall (HR = 0,568, 95% KI 0.325~0.991,
P
= 0,046). Videre analyser viste at CD31
hiNCL
hi gruppen hadde også en høyest risiko for tilbakefall i følgende undergrupper: plateepitelkarsinom og adenosquamous cell carcinoma (HR = 3,907, 95% KI 1.285~7.462,
P =
0,012), lav og median /høy differensiering (HR = 2,363, 95% KI 1.129~4.949,
P =
0,023 og HR = 4,201, 95% KI 1.568~11.253,
P =
0.004, henholdsvis), liten tumor ( 5 cm) (HR = 3,382, 95% KI 1.505~7.603,
P
= 0,003), stadium I (HR = 11,371, 95% KI 3.003~43.059,
P
0,001), og kirurgi alene (HR = 3,012, 95% KI 1.345~6.747,
P =
0,007). I disse subgruppeanalyser, sammenlignet med CD31
loNCL
lo gruppe, CD31
hiNCL
lo gruppe var ikke assosiert med en høyere risiko for tilbakefall, unntatt hos pasienter med median eller høy kreft differensiering (HR = 2,826, 95% KI 1.081~7.386,
P
= 0,034). Dermed kan nucleolin bli en verdifull markør for å identifisere risiko for tilbakefall for pasienter med tidlig stadium NSCLC.
Multivariate fare Ratio Analyse
En multivariat overlevelsesanalyse ved hjelp av Cox proporsjonal risikomodell for valg av prognostiske faktorer for sykdomsfri overlevelse, inkludert clinicopathological parametere som er nevnt ovenfor og immunfluorescens costaining resultatene av blodkaret tetthet og nucleolin uttrykk nivå, indikerte at både nucleolin uttrykk på kreft fartøy og klinisk stadium III er uavhengige faktorer av dårlig prognose for sykdomsfri overlevelse (
P
= 0,003 og
P
0,0001, henholdsvis tabell 3). Men avansert stadium, men ikke nucleolin uttrykk var en uavhengig prognostisk faktor for total overlevelse (
P
0,001 for stadium II /III).
Bone metastase er en vanlig komplikasjon av NSCLC. De fem-års overlevelse av pasienter «med bein metastasering, og CD31
hiNCL
hei, CD31
hiNCL
lo, CD3l
loNC
lo are72%, 81%, og 82%, respektivt. Men verken CD31
hiNCL
hi eller CD31
hiNCL
lo grupper vises en høyere risiko for beinmetastaser i forhold til CD31
loNCL
lo (
P
= 0,556 og
P
= 0,338, henholdsvis). Høy risiko for beinmetastaser ble kun observert hos pasienter med avansert stadium NSCLC (
P
= 0,014) (data ikke vist).
Diskusjoner
I denne studien har vi funnet at nucleolin uttrykk ble påvist i 34,2% av NSCLC pasienter med resected svulster. Dette kan være forbundet med den ko-lokalisering av nucleolin og CD31, som er i overensstemmelse med tidligere observasjoner av nucleolin på tumor endotelceller [23]. Nucleolin er også betinget uttrykkes på overflaten av endotelceller bare i løpet av tumor angiogenese [23]. En mulighet for heterogeniteten av nucleolin ekspresjon på celleoverflaten er den lokale variasjon av endotelcelleproliferasjon i angiogene lesjoner in vivo [24]. Dessuten, vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), ekstracellulær matriks, og intracellulær motor protein er essensielle for ekspresjon av nucleolin på overflaten av endotelceller i løpet av angiogenese [24]. Disse studiene kan forklare hvorfor nucleolin er ikke lett synlig i tumorvev mangler CD31 uttrykk i vår studie. Men studier om forholdet mellom MVD og nucleolin uttrykk er få, spesielt i ikke-småcellet lungekreft. Utvalgsstørrelsen var ikke stor nok til å oppdage pasienter med lav CD31 og høy nucleolin, og et større utvalg er nødvendig for å bekrefte dette forholdet. Videre forskning med mer følsomme blodårer markører er nødvendig. Videre observerte vi at en undergruppe av NSCLC uttrykte CD31 i fravær av nucleolin. For å avgjøre om CD31 alene kan tjene som en prognostisk markør i NSCLC, fordelt vi pasientene inn i tre grupper: CD31
hiNCL
hei, CD31
hiNCL
lo og CD31
loNCL
lo
.
Vi fant at nucleolin uttrykk ble bare forbundet med store svulster (≥ 5 cm), men ikke med andre patologiske faktorer som kjønn, alder eller histologisk grad. En forklaring kan være at større svulster har tilstrekkelig oksygen og næring levert av tumor angiogenese. Spesielt, har nucleolin blitt vist å være positivt korrelert med tumorvekst [24]. I flere nyere studier, spesifikke antagonister av nucleolin oppviste antitumoraktivitet ved å inhibere tumor angiogenese [23], [26], [30], [31].
Dette er den første studie for å undersøke den prognostiske verdi av nucleolin uttrykk i NSCLC pasienter. I multivariat Cox regresjonsanalyse ble nucleolin uttrykk evalueres som en faktor av betydning sykdomsfri overlevelse i NSCLC (HR = 2,414), noe som tyder på at nucleolin kan spille en viktig rolle i tumor tilbakefall ferd med NSCLC. Angiogenese er en viktig begivenhet for tumorinvasjon og metastasering. Etter fjerning av svulster, pro-angiogene miljø var i stand til å utløse hvilende tumorer for å vokse raskt [32] – [34]. Dette er sannsynligvis på grunn av øket ekspresjon av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) eller redusert ekspresjon av endostatin og angiostatin stolpe kirurgi, som kan endre pro-angiogene bryter [34], [35]. Den forbedrede angiogenese sammen med oppføring av flere tumorceller i omløp forenkler således tumormetastase [6], [36], [37]. Det er godt dokumentert at utseendet på neoangiogenesis er en signifikant indikator på dårlig prognose for både sykdomsfri overlevelse og total overlevelse i lungekreft [6], [7], [9], [11], [38], [ ,,,0],39]. I vår studie, den viktigste årsaken til tilbakefall er fjernmetastaser (87,3%) som er nært knyttet til angiogenese. På den annen side, vi klarte ikke å finne at nucleolin er en prognostisk faktor for total overlevelse. En mulig forklaring er at pasientene skulle få ulike behandlingsstrategier (for eksempel endostain, bevacizumab) etter sykdomsprogresjon, noe som kan påvirke overlevelsen prognose.
I videre overlevelse analyser, fant vi at nucleolin uttrykket var signifikant assosiert med en redusert sykdomsfri overlevelse og en høy tilbakefallsrisiko, spesielt i undergruppene med stadium i, mindre tumor ( 5 cm) og kirurgi alene. Klinisk er en liten brøkdel av neoplasme er ganske aggressiv selv ved tidlige stadier som kan være dødelig [40]. I noen tilfeller kan fjerning av den primære tumoren akselerere tumorresidiv lokalt eller systemisk, [34], [41], [42]. Derfor kan nucleolin tjene som nyttig markør for å identifisere pasienter med et dårlig resultat og for å veilede postoperativ behandling i tidlig stadium NSCLC.
Bone metastase er en hyppig komplikasjon av lungekreft. Eksperimentelle observasjoner tyder på at beinmetastatiske tumorceller har evnen til å indusere endotelisk celle proliferasjon, migrering og differensiering [43]. Men i denne studien, vi klarte å identifisere en sammenslutning av nucleolin uttrykk med høy risiko for beinmetastaser. En større kohort kan være nyttig for å ytterligere bekrefte forholdet mellom nucleolin uttrykk og bein metastasering i NSCLC.
I konklusjonen, vurderer vi for første gang uttrykk for nucleolin i NSCLC. Våre funn gir bevis for at nucleolin er lokalisert med CD31 i tumorvev fra NSCLC, noe som tyder nucleolin også er funnet på overflaten av tumor endotelceller. Vi viser også at nucleolin uttrykket kan brukes som en negativ prognostisk faktor på sykdomsfri overlevelse for NSCLC pasienter behandlet med radikal kirurgi. Den prognostisk indikator på nucleolin kan også anvendes, spesielt i pasienter med SCC + ADSCC, trinn I, liten tumor, og kirurgi alene, noe som indikerer at administrering av anti-perioperative NL stoffer, for eksempel endostatin, kan være nyttig.
