Abstract
Bakgrunn
Vogn-forbundet polypeptider 2 (LAP2) er en kjernefysisk protein som forbinder atom lamina med kromatin. Selv om dens kritiske roller i genetiske lidelser og blodkreft malignitet har blitt beskrevet, har sitt uttrykk og roller i fordøyelseskanalen kreft vært dårlig karakterisert.
Metoder
For å undersøke uttrykket av LAP2 i pasient vev, vi utført immunhistokjemi og real-time PCR. For å undersøke bevegeligheten av kreftceller, ansatt vi Boyden kammer, sårheling og Matrigel invasjonen analysene. For å avsløre sine roller i metastaser in vivo, vi brukte en levermetastaser xenograft modell. For å undersøke den underliggende mekanismen, ble et cDNA microarray gjennomført.
Resultater
Immunohistochemistry i pasient vev viste utbredt uttrykk for LAP2 i diverse fordøyelsessystemet kreft, inkludert magen, bukspyttkjertel, lever og galle duct kreft . Real-time PCR bekreftet at LAP2β er over-uttrykt i mage kreft vev. Knockdown av LAP2β ikke påvirke spredning av de fleste fordøyelseskanalen kreftceller unntatt kreft i bukspyttkjertelen celler. Imidlertid knockdown av LAP2β redusert motilitet i alle testede cancerceller. Videre overekspresjon av LAP2β økt bevegelighet av mage og kreft i bukspyttkjertelen celler. I levermetastaser xenograft modell økte LAP2β metastatisk effekt av magekreftceller og dødelighet hos mus ble testet. cDNA mikromatriser viste muligheten for at Myristoylated alanin-rik C kinase substrat (MARCKS) og interleukin6 (IL6) kan megle LAP2β regulert motilitet av kreftceller.
Konklusjoner
Fra ovennevnte resultatene, vi konkludere med at LAP2 er mye overuttrykt i diverse fordøyelsessystemet kreft og LAP2β regulerer motilitet av kreftceller og foreslår at LAP2β kan ha verktøy for diagnostikk og terapi i fordøyelseskanalen kreft
Citation. Kim HJ, Hwang SH, Han ME , Baek S, Sim HE, Yoon S, et al. (2012) LAP2 er mye overexpressed i diverse fordøyelseskanalen kreft og Regulerer motilitet av kreftceller. PLoS ONE 7 (6): e39482. doi: 10,1371 /journal.pone.0039482
Redaktør: Terence Lee, University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 8 september 2011; Godkjent: 24 mai 2012; Publisert: 20 juni 2012
Copyright: © 2012 Kim et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Medical Research Institute Grant (2010-25), Pusan National University Hospital, medisinsk forskningssenter program av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi /Korea Science and Engineering Foundation (2011-0006190) og National Kjerne Research center program fra Ministry of Education, Science and Technology (No. R15-2006-022-01001-0). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
metastaser av kreftceller i stor grad påvirker prognosen for kreftpasienter. Overlevelse av pasienter som har fjernmetastaser er betydelig lavere enn de som er lokalisert tumor i de fleste typer kreft [1]. En av kritiske faktorer i metastaser er motilitet av kreftceller [2]. Mange viktige molekyler som regulerer motilitet av kreftceller er blitt identifisert. Fordi hemming av migrasjon er effektiv i behandling av metastaser i mange aspekter, mange migrasjons hemmere er under klinisk utvikling [3]. For eksempel, er Rho-kinase en liten GTPase som regulerer actin og microtubulin nettverk og cellulære fremspring. Så, en inhibitor som retter seg mot Rho kinase er under klinisk utvikling [3].
Vogn-forbundet polypeptider 2 (LAP2) er en av LEM-domene proteiner som er indre kjernefysiske membran proteiner som deler et felles motiv av omtrent 40 aminosyrer, kjent som LEM-domenet [4], [5]. LEM-domene proteiner koble den indre kjernemembranen og atom lamina med kromatin gjennom barrieren til autointegration (BAF). Familien av LEM-domene proteiner inkluderer LAP2 [6], [7], [8], emerin [9], MAN1 [4], LEM2 [10] og LEM3 [11]. Navnet LEM stammer fra LAP2, Emerin og MAN1 [4].
I tillegg til sine strukturelle roller i kjernemembranen, har LEM-domene proteiner vist seg å spille viktige roller i ulike cellulære prosesser som DNA replikasjon og regulering av genekspresjon. LAP2β regulerer DNA-replikasjon ved å samhandle med HA95 under G1 fasen av cellesyklusen [12]. Denne interaksjonen med HA95 fører de prereplication komplekser til replika og stabiliserer det. Forstyrrelse av dette samspillet fører utgivelsen av prereplication komplekse komponenter og utløser proteolyse av Cdc6.
Patologisk konsekvensene har blitt beskrevet for LEM-domene proteiner i genetiske lidelser hos mennesker og er kollektivt kalt laminopathies [5], [13 ]. For eksempel fører Emerin mangel Emery-Dreifuss muskeldystrofi (EDMD) [9], fører [14], [15] og MAN1 mangel på osteopoikilosis, Buschke-Ollendorf syndrom og melorheostosis [16]. I tillegg til disse laminopathies har involvering av LAP2 i karsinogenese blitt beskrevet. For eksempel har LAP2β blitt vist å være involvert i proliferasjon av ondartede lymfocytter [12], [17], [18]. Videre overekspresjon av LAP2α ble rapportert i strupehode, lunge, mage, bryst og tykktarm kreft vev [19]
LAP2 familie av LEM domene proteiner, består av minst seks isoformer hos pattedyr. Α, β , γ, δ, ε, ζ, [6], [20], [21], [22]. Disse isoformene er generert av alternativ spleising av det samme transkriptet. Alle isoformer unntatt pattedyr LAP2α og LAP2ζ er indre kjernefysiske membran proteiner og dele en lignende domene organisasjon. Den N-terminale segment inneholder LEM-domenet og LEM-lignende domene. I motsetning til LEM-domene, kan LEM-lignende domene samhandle direkte med kromatin uten hjelp av BAF. Den C-terminale segment av LAP2 proteiner har Lamin-bindende domener. Særlig den C-terminale segment av α-isoformen mangler et antatt transmembrandomene, slik at proteinet blir fordelt over kjernen. Selv om LAP2α, β, og γ er uttrykt overalt i de fleste pattedyrceller, differensiell ekspresjon av LAP2 isoformer har blitt beskrevet. Differensierte vev sterkt uttrykk for LAP2γ isoform imidlertid vev med prolifererende celler uttrykker flere av LAP2α og LAP2β isoformer [23].
Selv om dens kritiske roller i genetiske lidelser og blodkreft malignitet har blitt beskrevet, uttrykk og roller LAP2 i andre celler eller sykdommer er dårlig karakterisert. I denne studien fant vi for første gang en roman rolle LAP2β i reguleringen av motilitet av kreftceller og overekspresjon av LAP2 i diverse fordøyelsessystemet kreft.
(A) Immunhistokjemisk farging viste overekspresjon av LAP2 i diverse fordøyelseskanalen kreft inkludert bukspyttkjertel, lever, mage og galle duct kreft. Merk overekspresjon av LAP2 i metastatiske kreftceller. Scale bar, 200 mikrometer. (B) Overuttrykte LAP2β i mage kreft vev ble undersøkt ved real-time PCR med spesifikke primere for β-isoformen. GAPDH ble brukt til å normalisere alle opplysninger.
Western blotting (A, B) og real-time PCR (C, D) ble anvendt for å bestemme effektiviteten av knockdown (A, C) eller overekspresjon ( B, D) av LAP2β i SNU638 eller PANC1 celler. Dataene er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter (* P 0,01, Student t-test). (E) Effekt av LAP2β knockdown på proliferasjon av cancerceller. WST-1-assay ble anvendt for å måle proliferasjon av kreftceller i nærvær av 10% FBS. Fem dager etter transfeksjon med ved 100 nM LAP2β siRNA eller 100 nM egge (SCR) siRNA, WST-1 proliferasjonsanalyse ble utført. (F) Effekt av LAP2β overekspresjon på proliferasjon av cancerceller. WST-1-analysen ble utført på SNU638 eller PANC1 celler som overuttrykker LAP2β gen eller kontrollvektor. Dataene er midler ± SD av tre uavhengige eksperimenter i quintuplicate (* P 0,01, t-test).
Metoder
cellekulturer og Transfeksjon
følgende fordøyelseskanalen kreftceller ble anvendt; mage kreftceller (SNU216, SNU638), kolangiokarsinom celler (SNU1079, HuCCT1), kreft i bukspyttkjertelen celler (PANC1, MIA-PACA2), hepatokarsinom celler (Huh7, HepG2). HuCCT1, HepG2, SNU216, SNU638, SNU1079 og Huh7-celler ble dyrket i RPMI 1640 supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 100 ug /ml av penicillin /streptomycin. PANC1 og MIA-PACA2-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DME) /høy glukose supplert med 10% FBS og 100 pg /ml penicillin /streptomycin. De fleste celler ble dyrket ved 37 ° C, 5% CO2 inkubator. Cellene ble transfektert med siRNA hjelp DhamaFECT Reagens 3 (Dhamacon, Lafayette, CO, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Sekvensene av siRNA er som følger: LAP2β siRNA (Bioneer, Daejeon, Korea), 5’ACA AGA GGG UCA AGA AGA A (dTdT) -3 «og 5’UUC UUC UUG ACC CUC UUG U (dTdT) -3 «; egge (SCR) siRNA (Dhamacon, Lafayette, CO, USA), 5’GAU CCG CAA AAG AGC GAA A (dTdT) -3 «og 5’UUU CGC UCU UUU CGC GAU C (dTdT) -3 «.
overuttrykte LAP2β
DNA uttrykk konstruere pCMV-SPORT6-LAP2β (Thermo Scientific åpen biosystem, Huntsville, AL, USA) ble brukt til å drive overekspresjon og G418 (Sigma-Aldrich, St. Louis , MO, USA) ble brukt for valg. Celler ble ko-transfektert med pCMV-SPORT6-LAP2β /Pires-Neo på en 5:02 ratio hjelp Fugene HD (Roche, Nutley, NJ), i henhold til produsentens instruksjoner. Mock celler ble etablert samtidig bruker tom kontroll vektor.
Western blotting
Etter gelelektroforese og overføring til en PVDF membran, ble membranen blokkert for en time. Etter å legge primære antistoffer (mus anti-human LAP2β (BD Biosciences, San Jose, CA, USA, 1:1000) og mus anti-α-tubulin (BioGenex, 1:10000)) i blokkering løsning membranen ble inkubert i primær -antistoff ved 4 ° C over natten på en ristemaskin. Den passende sekundært antistoff ble påført (1:2000, pepperrot-peroksidase-konjugert anti-mus) og inkubert ved romtemperatur i 2 timer på en rister. Til slutt ble proteinene detektert ved anvendelse av LAS3000.
Boyden kammer assay (A-G) og sårtilheling assay (H, SNU638 celler) ble brukt til å måle migrering av kreftceller. LAP2β siRNA inhiberte signifikant FBS- eller EGF-indusert migrering sammenlignet med SCR siRNA i SNU638 (A, C), PANC1 (A, D) eller andre fordøyelseskanalen kreftceller (G). Overekspresjon av LAP2β i SNU638 (B, E) eller PANC1 (B, F) celler signifikant øket vandring sammenlignet med kontrollen vektor (B, E, F). EGF (100 ng /ml) eller 10% FBS ble anvendt for å indusere kjemotaksis. Mitomycin C (0,01 ug /ml) ble tilsatt for å fjerne effekter av proliferasjon. To dager etter transfeksjon med 100 nM LAP2β siRNA eller 100 nM egge (SCR) siRNA, begge overførings analyser ble utført. Fire eller seks timer senere etter tilsetning av EGF eller FBS inn i Boyden kammer analysen ble cellene fiksert. Etter en ripe i sårtilheling analysen ble overført cellene fiksert på de angitte tider. Representative farging av migrerte celler ble presentert (A, B). Migrerte celler ble tellet og data er presentert som grafer (C-G). Dataene er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter i triplikat (C-G, * P 0,01, t-test).
Matrigel invasjon assay ble anvendt for å måle invasjon av kreftceller. Knockdown av LAP2β inhiberte signifikant FBS- og EGF-indusert invasjon sammenlignet med SCR siRNA i SNU638 (A, C) eller PANC1 (A, D) -celler. Overekspresjon av LAP2β i SNU638 (B, E) eller PANC1 (B, F) -celler betydelig invasjon sammenlignet med kontrollen vektoren. EGF (100 ng /ml) eller 10% FBS ble anvendt for å indusere invasjon. Mitomycin C (0,01 ug /ml) ble tilsatt for å fjerne effekter av proliferasjon. To dager etter transfeksjon med 100 nM LAP2β siRNA eller 100 nM egge (SCR) siRNA, invasjonen analysene ble utført. Representative farging av invaderte celler ble presentert (A, B). Invaderte celler ble tellet og data er presentert som grafer (C-F). Dataene er midler ± SD av tre uavhengige forsøk i tre eksemplarer (CF, * P 0,01, t-test)
Real-time PCR
magekreft vev ble oppnådd. med skriftlig informert samtykke fra pasienter som gjennomgikk kirurgisk reseksjon ved Pusan National University Hospital og Pusan National University paraply Hospital, og studien ble godkjent av Institutional Review board av sykehusene (Permit Number 2009-13). Total RNA fra vev eller celler ble hentet ved hjelp Trizol reagens (Invitrogen, Calsbad, CA, USA) eller RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll. cDNA ble syntetisert med MMLV revers transkriptase (Promega, Madison, WI, USA), dNTP og oligo-dT primere. Primersekvensene var som følger: LAP2β, 5′- AGG GCA GAG CAA AGA CTC CAG TAA CAA 3 «og 5′-TTA TTC CAG CTT GAG AAT AGC TCT GAT TGT GC-3»; MARCKS, 5’GTG CCC AGT TCT CCA AGA CCG CA -3 «og 5’GGC CAT TCT CCT GTC CGT TCG CT -3», IL6; 5’TAG CCG CCC CAC ACA GAC AGC C -3 «og 5’TTC TGC CAG TGC CTC TTT GCT GCT -3»; STAT3, 5’AAC ATG GCT GGC AAG GGC TTC TCC T -3 «og 5’AGT GCT CAA GAT GGC CCG CTC CC -3»; GAPDH, 5’GCA GCC TCC CGC TTC GCT CT -3 «og 5’TGG TGA CCA GGC GCC CAA TAC G – 3». Real-time RT-PCR ble utført ved hjelp av Power SYBR Grønn PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) i en ABI Prism 7500 sekvens detektor (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll. GAPDH ble brukt til å standardisere cDNA inngangsnivåer.
Immunohistochemistry
Etter deparaffination og rehydrering, ble platene utsatt til 0,3% hydrogenperoksid i 30 min for å slukke endogen peroksidase aktivitet. Blokkering ble gjort med 10% normal esel serum (NDS) og 1% BSA i 1 x PBS. Da objektglassene ble inkubert over natten ved 4 ° C i blokkeringsbuffer inneholdende følgende primære antistoff; anti-human LAP2 (1:200, BD Biosciences, San Jose, CA, USA), anti-STAT3 (1:100, Cell Signaling, Beverly, MA, USA), anti-IL6 (1:100, Abcam, Cambridge, UK) eller anti-MARCKS (01:50, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) antistoff. Sekundært antistoff (pepperrot-peroksidase-konjugert) binding ble utført ved en 1:200 fortynning i blokkeringsbuffer i 2 timer ved RT. Deteksjon ble utført med HRP (Vector Laboratories) ved hjelp av DAB underlaget kit (Vector Laboratories). Kontra ble gjort i 1 min med hematoksylin flekker buffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).
Cell Proliferation Assay
To, tre eller fem dager etter transfeksjon med siRNA, la vi 10 ul ferdigblandet vannløselige tetrazoliumsalt-1 (WST-1, Roche, Indianapolis, IN, USA) celleproliferasjon reagens til hver brønn. Disse cellene ble inkubert i to timer i inkubatoren. Cellelevedyktigheten ble målt ved absorbans ved 450 nm ved anvendelse av en ELISA-leser (TECAN, Mannedorf, Sveits).
Boyden kammer Assay
Migrering av kreftceller ble målt i en Boyden kammer. Omtrent 5 x 10
4 celler i 0,05 ml av serumfritt RPMI 1640 medium ble podet til den godt membran belagt med type I kollagen. For å fjerne virkningene av proliferasjon, ble mitomycin C (0,01 ug /ml, Sigma, USA) tilsatt. Celler ble tillatt å migrere til fire eller seks timer. Membranene ble fiksert og farget ved hjelp av Diff-quik løsning (Sysmex, Kobe, Japan) for en min og vasket med destillert vann. Celle nummer i 10 tilfeldig utvalgte felt ble bestemt ved hjelp av et lysmikroskop. Eksperimenter ble utført i tre eksemplarer og gjentatt tre ganger.
Wound Healing analysen
Cellemono var riper med en gul pipettespiss og migrasjon av celler til de sårede området ble observert under en invertert mikroskop. For å fjerne virkningene av proliferasjon, ble mitomycin C (0,01 ug /ml, Sigma, USA) tilsatt. Bilder ble tatt på de angitte tider. Målinger ble tatt fra fem individuelle mikroskopiske felt i hvert forsøk, og de representative data fra tre eksperimenter er presentert.
Matrigel invasjonen analysen
Evnen til kreftceller til å invadere ble bestemt ved bruk av 24-brønn BioCoatTM MatrigelTM kammerinnsatser (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Den indre innsatsen av invasjonen kamrene ble belagt med 0,5 mg /ml vekstfaktor-redusert Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) og den ytre innsatsen ved 0,5 mg /ml fibronektin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Celler ble sådd ut i innsatser ved en tetthet på 5 x 10
4 pr innskuddet i serumfritt medium og deretter overført til brønnene fylt med dyrkningsmedium inneholdende 10% FBS og 100 ng /ml EGF som et kjemotiltrekkende. For å fjerne virkningene av proliferasjon, ble mitomycin C (0,01 ug /ml, Sigma, USA) tilsatt. Etter 24 (10% FBS) eller 52 timer (100 ng /ml EGF) inkubering, ble ikke-invaderende celler på toppen av membranen fjernes ved skraping. Invaderte celler på bunnen av membranen ble fiksert, etterfulgt av farging med Diff-quik løsning. Forsøk ble utført in triplo, og minst 10 felt ble telt i hvert eksperiment.
levermetastaser xenograft modell
Enes evne til transfektantene å metastasere til leveren ble bedømt ved langsom injisering av celler ( 5 x 10
6 /0,05 ml) i milten hos nakne mus via en 27-gauge nål (NK4 gruppe, mock gruppe; n = 5 /gruppe). For patologiske studier ble alle mus drept ved 5 uker og lever ble isolert, fiksert i 10% nøytral – buffret formalin og innstøpt i parafin. Seksjonene ble farget med hematoksylin og eosin. Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Den Pusan National University Institutional Animal Care og bruk Committee (PNUIACUC) godkjente forsøksprosedyrer (Permit Number: PNU-2010-00083).
cDNA microarray
Total RNA ble ekstrahert fra SNU638-LAP2 og SNU638 mock celler ved hjelp RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll. Kvantifisert RNA ble så brukt for microarray analyse on Human HT-12_v4_Bead chips (Illumina Inc., San Diego, CA, USA). Totalt RNA prøver ble merket med Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit (Ambion, Applied Biosystems, CA, USA) for cDNA syntese og in vitro transkripsjon. Single-RNA (cRNA) ble generert og merket ved å innlemme biotin-NTP (Ambion). En total på 0,5 mikrogram av biotin-merket cRNA ble hybridisert ved 58 ° C i 16 timer til Illumina Human HT-12_v4_BeadChip (Illumina). Den hybridiserte biotinylert cRNA ble påvist med streptavidin-Cy3 og kvantifisert ved hjelp av en BeadArray Reader Scanner (Illumina) i henhold til produsentens instruksjoner. Array data ble bearbeidet og analysert ved Illumina BeadStudio versjon 3.0 software (Illumina). Skannede data ble normalisert ved quantile-quantile normalisering metode og log-transformert (ved basen to). Alle data er MIAME kompatibel og rådata ble sendt til offentlig register. (NCBI er GEO deponeringsnummer: GSE31450)
Gastric kreftceller som overuttrykker LAP2β gen eller kontroll vektor ble injisert i milten og metastaser til leveren ble undersøkt 5 uker senere. Metastatisk tumor regioner ble angitt med stiplede sirkler. Representative immunostainings med anti-LAP2, anti-IL6, anti-STAT3, og anti-MARCKS antistoffer, og H E stainings i en levermetastase er presentert. Stjerne indikerer tumorlesjoner. Scale bar, 50 mikrometer.
Data Analysis
Alle data er presentert som gjennomsnitt ± SD. Forskjellen mellom de midlere verdier av to grupper ble evaluert ved bruk av Student t-test (uparet). For sammenligning av mer enn 3 grupper, ble en en-veis analyse av varians (ANOVA) etterfulgt av Tukey største multiple sammenligninger anvendt. * Indikerer en p-verdi. 0,05, som ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
LAP2 er mye overuttrykt i diverse fordøyelseskanalen Kreft
For å undersøke uttrykk mønstre av LAP2 i tarmsystem kreft inkludert mage, bukspyttkjertel, lever og galle duct kreft, gjennomførte vi immunhistokjemi med pasient vev (n = 15 per hver krefttype). LAP2 protein ble mye overuttrykt i kreftområdet vev sammenlignet med ikke-kreft områder (Fig. 1A, 47% i magekreft, 27% i bukspyttkjertelen kreft, 30% i leverkreft, 40% i gallegang kreft). Spesielt uttrykk for LAP2 ble observert i metastatiske kreftceller ved pasientenes vev. Fordi LAP2 har mange isoformer, fokuserte vi på LAP2β. For å bekrefte resultatene av immunohistochemistsry, vi utførte real-time PCR ved hjelp LAP2β-spesifikke primere i mage kreft vev. Selv om alle testede vev ikke overuttrykker LAP2β, ble det overuttrykt i 13 tilfeller (totalt 24 tilfeller, Fig. 1B).
Roller av LAP2β i spredning, migrasjon og invasjon av kreftceller
for å undersøke roller LAP2β i kreftutvikling, vi banket ned eller overexpressed LAP2β hjelp siRNA eller cDNA, henholdsvis. Vi sjekket effektiviteten av modulering av LAP2β-genet ved western blotting eller sanntids-PCR (fig. 2A-D). LAP2β siRNA (100 nM) ble redusert mRNA-nivået av LAP2β i SNU638 eller PANC1 celler sammenlignet med SCR siRNA med 42% eller 61%. Overekspresjon av LAP2β av cDNA-transfeksjon øket mRNA-nivå av LAP2β i SNU638 eller PANC1-celler (klon # 6) sammenlignet med kontrollvektor med 1,7 eller 19,6 folde hhv.
Deretter undersøkte vi rolle i spredning LAP2β av kreftceller. Fem dager etter transfeksjon med SCR eller LAP2β siRNA, ble WST-1 spredning analyse utført. Knockdown av LAP2β ikke påvirke proliferasjon av de testede cancerceller med unntak av kreft i bukspyttkjertelen celler (fig. 2E). LAP2β siRNA hemmet spredning av MIA-PaCa2 og PANC1 bukspyttkjertelen kreftceller sammenlignet med SCR siRNA med henholdsvis 74% og 46% (Fig 2E.). Vi observerte lignende resultater når vi utførte WST-1 spredning analysen to eller tre dager etter transfeksjon. Overekspresjon av LAP2β i SNU638 eller PANC1 cellene litt påvirket spredning (Fig. 2F).
For å finne ut hvilken rolle LAP2β i migrering av kreftceller, gjennomførte vi studier ved hjelp av en Boyden kammer analysen. I alle de testede cancerceller, knockdown av LAP2β inhiberte migrering av kreftceller (Fig. 3). For eksempel, LAP2β siRNA hemmet FBS- eller EGF-indusert migrering av SNU638 celler sammenlignet med SCR siRNA med henholdsvis 47% og 70% (figur 3A, og amp;. 3C). I constrast, overekspresjon av LAP2β økt FBS- og EGF-indusert migrering av SNU638 celler sammenlignet med mock-celler ved henholdsvis 145% og 387% (figur 3B . 3E). Lignende resultater ble oppnådd i LAP2β- overekspresjon PANC1-celler (figur 3B 4C). Lignende resultater ble oppnådd i PANC1 (figur 4A . 4E). Lignende resultater ble oppnådd i PANC1 (figur 4B . 4F). Celler
LAP2β Forbedrer metastatisk effekt av Gastric kreftceller i en levermetastaser Xenotransplantat Modell
Regulering av bevegeligheten av kreftceller ved LAP2β antydet muligheten for at LAP2β regulerer metastase av kreftceller in vivo. For å undersøke denne mulighet, injiserte vi magecancerceller inn i milten hos nakne mus og deretter observert metastaser i leveren. Interessant, overekspresjon av LAP2β øket effektivitet og størrelsen av levermetastaser (fig. 5) og dødelighet av testede mus. 67% av mus injisert med magekreftceller som overuttrykker LAP2β døde 8 uker senere etter injeksjonen, mens alle kontrollmusene injisert med magecancerceller som uttrykker kontroll vektor overlevde. I histologisk undersøkelse av xenograft vev, bekreftet vi overekspresjon av LAP2β i xenograft avledet fra mus injisert med LAP2β-overekspresjon celler (Fig. 5).
LAP2β-induserte endringer i mRNA uttrykk
for å avdekke den underliggende mekanismen for LAP2β regulerte motilitet, utførte vi en cDNA microarray (NCBI er GEO deponeringsnummer: GSE31450). Selv om mRNA nivået av LAP2β ble overuttrykt i stabil cellelinje omtrent 1,7 ganger, de av mange gener ble endret ved overekspresjon (figur 2 0,01, t-test).
Diskusjoner
LAP2, en av LEM domene proteiner, har vært hovedsakelig beskrevet å spille en strukturell rolle i kjernemembranen og for å være involvert i en rekke genetiske sykdommer. Men her presenterer vi for første gang sitt uttrykk og roller i diverse fordøyelseskanalen kreft. Spesielt fant vi at LAP2β kan kontrollere bevegeligheten av kreftceller, samt bidra til metastasering av kreft celler.
metastaser av kreftceller i stor grad påvirker prognosen for kreftpasienter. Flere resultater i denne studien støtte som LAP2β regulerer motilitet og metastasering av kreftceller. In vitro eksperimenter i Boyden kammer, sårheling og Matrigel invasjonen analysene viste at knockdown redusert mens overekspresjon av LAP2β økt migrasjon og invasjon av kreftceller (fig 3 . 4). Videre, i xenograft modell, LAP2β forbedret metastase av kreftceller (Fig. 5). Selv om kontroll vektor-transfiserte celler forårsaket metastase i xenograft modell, effekten var ganske ineffektiv og langsom. I motsetning til dette, LAP2β-overuttrykt celler viste en mer aggressiv oppførsel i xenograft. Videre fant vi overekspresjon av LAP2 med metastatisk kreft celler i vev fra pasienter (Fig. 1).
Hvordan kan LAP2β bidra til bevegelighet og metastasering av kreft celler? Vi har funnet flere gener som ble indusert av LAP2β i cDNA mikromatriseanalyse (tabell 1), noe som ble ytterligere bekreftet ved sanntids-PCR (fig. 6) og immunhistokjemi i xenograft (fig. 5). En av dem, MARCKS, er ansvarlig for binding og tverrbinding av aktin filamenter direkte til membran [24]. Overekspresjon av MARCKS har blitt funnet i en rekke kreftformer, inkludert hepatocellulært karsinom [25], bukspyttkjertelkreft [26], glioblastom [27] og kolangiokarsinom [28]. Dessuten spiller MARCKS en avgjørende rolle i EGFR-indusert invasjonen av glioblastom celler [29]. Mange andre studier har blitt vist å involvere MARCKS i cellulær motilitet [30].
En annen kandidat-gen som medierer LAP2β-indusert motilitet er IL-6, som i hovedsak er produsert i løpet av akutt og kronisk inflammasjon. Kreftceller som er utsatt for IL-6 eller utskiller det cytokin som en autokrin faktor viser økt invasivitet [31], [32], [33]. Videre inaktivering av gp130, en transduser av IL-6-signalering, redusert aggressiviteten av brystkreftceller in vivo [34]. Flere IL-6 signalveien-relaterte gener inkludert STAT3 er også knyttet til migrering og invasjon av kreftceller [35], [36], [37]. IL-6 er allment uttrykt i mange solide kreftformer inkludert prostata [38], bryst [39], lunge [40] kreft, og glioblastom [41].
Hvordan kan LAP2β regulere genuttrykket? LEM-domene proteiner er blitt vist å være i stand til å regulere genekspresjon ved transkripsjonelle regulatorer avsette på atom lamina. MAN1 bindes til reseptor-regulert R-Smads og motvirker signaliserer ved å transformere vekstfaktor β (TGFfi), activin og bein morphogenic protein (BMP) [42]. MAN1 mangel fører til embryonale vaskulær remodeling defekter i mus og bein utvikling hos mennesker [16], [43]. Et annet eksempel er emerin binding til p-catenin, et nedstrøms mål av Wnt signalering, som fremmer sin exit fra kjernen [44]. Emerin mangel fører til atom opphopning av β-catenin. LAP2β er vist å interagere med HDAC3 og regulere aktivitet av E2F, p53 og NF-kB transkripsjonsfaktorer [5], [45]. I fremtidige studier, hvordan LAP2β kan regulere MARCKS eller IL-6 uttrykk garanterer videre etterforskning.
Involvering av LAP2β i replikering ble foreslått av en studie der avkortet LAP2β endret DNA replikasjon effektivitet [18]. Regulering av DNA-replikasjon ved LAP2β har blitt foreslått for å være formidlet av to mulige veier. LAP2β kan redusere aktiviteten av E2F-komplekset alene eller sammen med bakterie-celle mindre (GCL) [46]. Den andre bane er gjennom interaksjon med HA95 under G1 fasen av cellesyklusen [12]. Dette samspillet med HA95 bidrar til stabiliteten i prereplication komplekser. I denne studien, gjorde knockdown av LAP2β ikke påvirke spredning av de fleste fordøyelseskanalen kreftceller unntatt kreft i bukspyttkjertelen celler (fig. 2). Videre overekspresjon av LAP2β ikke føre til vesentlig endring i spredning (fig. 2), noe som tyder på regulering av spredning av LAP2β i fordøyelseskanalen kreftceller er ikke så kritisk.
Utbredt overekspresjon av LAP2 i ulike fordøyelseskanalen kreft er beskrevet for første gang i foreliggende studien (fig. 1). Ekspresjon av LAP2β er blitt beskrevet i forskjellige normale vev, inkludert hud, thymus, lunge, testikkel og eggstokk. Men dens uttrykk i normal mage-tarmkanalen ble sjelden oppdaget [47].
