Abstract
Nasofaryngeal karsinom (NPC) er en unik EBV-assosiert epitel malignitet, som viser svært invasiv og metastatisk fenotype. Til tross for økende bevis som viser den viktige rollen av kreft stilk-lignende celler (cscs) i vedlikehold og utviklingen av tumorer i en rekke forskjellige maligniteter, eksistensen og egenskapene av CSC i EBV-assosierte NPC er stort sett ukjent. Vår undersøkelse tar sikte på å belyse nærværet og rollen til cscs i patogenesen av denne ondartet sykdom. Sphere dannende celler ble isolert fra en EBV-positive NPC cellelinje C666-1 og dens tumor initiere egenskaper ble bekreftet av
in vitro Hotell og
in vivo
analyser. I disse kuler, ble opp-regulering av flere stamcellemarkører funnet. Ved strømningscytometri, demonstrerte vi at både CD44 og SOX2 ble overuttrykt i et flertall av kuledannende C666-1-celler. De CD44 + SOX2 + celler ble oppdaget i en mindre befolkning i EBV-positive xenograft og primærsvulster og regnes som potensielle CSC i NPC. Spesielt, den isolerte CD44 + NPC-celler var resistente mot kjemoterapeutiske midler og med høyere celleklump formasjon effektivitet, som viser CSC egenskaper. På den annen side, har microarray analyse avdekket en rekke forskjellig uttrykt gener involvert i transkripsjon regulering (f.eks
FOXN4
,
GLI1
), immunrespons (
CCR7
,
IL8
) og trans transport (f.eks
ABCC3
,
ABCC11
) i kulene. Blant disse genene, økt uttrykk av CCR7 i CD44 + cscs ble bekreftet i NPC xenografter og primære svulster. Viktigere, blokkering av CCR7 avskaffet sfære dannende evne C666-1
in vitro
. Uttrykk for CCR7 var assosiert med tilbakevendende sykdom og fjernmetastaser. Denne studien er definert de spesifikke egenskapene til et CSC subpopulasjon i EBV-assosierte NPC. Våre funn gitt ny innsikt i utviklingen av effektive behandlingsformer målretting på cscs, og dermed potenbehandlingseffekt for NPC pasienter
Citation. Lun SW-M, Cheung ST, Cheung PFY, Til KF, Woo JK-S, Choy KW , et al. (2012) CD44 + Kreft Stilk-lignende celler i EBV-Associated Nasofaryngeal Carcinoma. PLoS ONE 7 (12): e52426. doi: 10,1371 /journal.pone.0052426
Redaktør: David Loeb, Johns Hopkins University, USA
mottatt: 10. juli, 2012; Godkjent: 12 november 2012; Publisert: 21.12.2012
Copyright: © 2012 Lun et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble støttet av stipend~~POS=HEADCOMP Council of Hong Kong (GRF: Grant No. 470321, 471610, 471211, 471709, GRF: Grant No. CUHK8 /CRF /11R, AoE /M-06/08) og stipend Council (GRF776608M; GRF777809M). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Foreløpig medforfattere Kwok-Wai Lo, Siu Tim Cheung, Pierre Busson og Sai Wah Tsao er medlemmer i PLoS ONE redaksjonsrådet. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Ikke-keratiniserende nasopharyngeal karsinom (NPC) er et tydelig epitelial kreft som oppstår fra hodet og nakkeregionen. Det knytter konsekvent med Epstein-Barr virus (EBV) og viser unike klinisk og patologisk funksjon. Ved klonal ekspansjon av en enkelt EBV-infiserte stamcelle, konstitutiv ekspresjon av virale gener latente og akkumulering av flere genetiske endringer bidrar til initiering og progresjon av kreft [1], [2].
NPC demonstrerer sterk geografisk preferanse, som viser høy forekomst i Sørøst-Asia, spesielt i kantonesisk regionen, inkludert Hong Kong med en årlig insidens på 25-50 per 100.000 personer [1]. Bærebjelken behandling for NPC er enten strålebehandling eller kombinert kjemoterapi-strålebehandling som viser over 90% rente kur hos pasienter med tidlig stadium av sykdommen [3]. Men utfallet for pasienter med avansert lokoregionalt sykdommer og fjernmetastaser er utilfredsstillende. Vesentlige priser av fjernt tilbakefall og metastasering oppstår fortsatt hos disse pasientene etter strålebehandling eller cellegift eller strålebehandling. En av de viktigste mekanismer for eksempel post-terapeutisk tilbakefall av NPC er blitt foreslått av «kreft stilk-liknende celle «(CSC) forslag [4].
I henhold til den CSC-modellen, kreft er hierarkisk organisert lik til normalt vev og kreftvekst og progresjon drives av en liten undergruppe av tumorceller med stamcelle-lignende egenskaper, den cscs. Denne sjeldne celle subpopulasjon er ansvarlig for startfasen, vedlikehold og regenerering [4], [5]. Cscs er blitt identifisert i forskjellige humane ondartede sykdommer slik som bryst, prostata, ovarie, lunge og hode og hals-karsinom [5], [6], [7], [8], [9]. Evnene til disse cellene til å initiere tumorvekst, opprettholde selvfornyelse og tilrettelegge stoffet motstand har blitt grundig bevist. Tatt i betraktning de unike egenskapene til cscs, er tilbakefall av svulster foreslått å være på grunn av svikt for å utrydde alle cscs og overlevende cscs deretter rekonstituere svulst i lokale og fjerntliggende områder.
Selv om cscs har vist seg å være avgjørende i utviklingen av de fleste kreftformer, informasjon om deres eksistens i EBV-assosiert NPC er knappe. Enten Forskningen ble gjennomført ved hjelp av EBV-negative cellelinjer eller var ute av stand til å belyse eventuelle funksjonelle cscs [10], [11], [12]. Vår gruppe har tidligere etablert flere EBV-positive tumorlinjer fra NPC pasienter i endemiske områder [13], [14], [15], [16] og ved hjelp av disse innfødte EBV-positive tumorceller, vi forsøkte å identifisere og karakterisere funksjonelle NPC cscs.
I denne studien ble kule dannende celler ( «sfæroider») fra EBV-positive cellelinje C666-1 isolert og deres stamcellelignende egenskaper ble bekreftet. Vi viste at CD44 og SOX2 ble uttrykt i et flertall av disse cscs. Ved microarray analyse, ble abnormt uttrykte cellulære gener i cscs identifisert. Interessant, CCR7, et celleoverflate kjemokinreseptor, ble funnet å være konsistent uttrykt i NPC linjer og primære svulster. Tilfeldigvis, ble det overuttrykt i vår identifisert NPC cscs og nøytraliseringen av denne reseptoren avskaffet sfære-dannende evne til C666-1. Vår nåværende studien gitt første bevis for tilstedeværelse av tumorigen cscs i EBV-positive NPC og CCR7 kan spille en rolle i deres tumorigent funksjon. Ovennevnte funn vil øke vår forståelse av innholdet i NPC cscs, noe som er avgjørende i å utvikle mer effektiv terapeutisk intervensjon mot denne sykdommen.
Resultater
CSC Capabilities av EBV-positive NPC-avledet Spheroids
cscs besatt evnen til å danne forankringsuavhengige tumor kuler når dyrket i spesialiserte serumfritt medium. Som vist i figur 1A, ble fritt-flytende tumor kuler som dannes når de dissosierte C666-1 ble cellene dyrket på ikke-belagte plater i serumfritt medium stamcelle. Non-tilhenger kuler opptrådte på 6-8 dager, og de ble enzymatisk dissosiert til enkeltceller for passasje ukentlig. Distinkte prototypiske kuler ble dannet 28 dager etter plating. Dette selvfornyende flytende kreftkuler kan passeres serielt og dyrket i mer enn 3 måneder. Når enkeltceller fra kulene ble dyrket i adherente plater med komplett medium (RPMI-1640 med 10% FBS), flytende cellene som festet seg til platen, og som dannes systema kolonier, som viser epitelial celle morfologi lik den til foreldremonolags C666-1-celler (Fig . 1A, panel til høyre).
(A) frittflytende kreftkuler ble dannet fra EBV-positive C666-1 celler (venstre panel) og de viste evne til å skille sammenlign til monolayer celler ved å administrere komplett medium ( panel til høyre). (B) Ved QRT-PCR, flere stamcellerelaterte gener (OCT4, Nanog, ALDH1, CKIT, CD44, CD133) ble beriket med kuler i forhold til foreldre C666-1. Transkripsjon av SOX2 ble ikke økt i kulene. (C) SOX2 protein ble ofte uttrykt i C666-1 sfæren dannende celler. Ved flowcytometri, ble SOX2-positive (SOX2 +) celler funnet å være anriket i og utgjorde over 60% av kuledannende cellepopulasjon. (D) Over 80% av kule dannende celler uttrykte markør celleoverflaten CD44 mens CD44 + celler i påvist i foreldre C666-1 og andre NPC xenografter var signifikant lavere (alle
P
0,001). Histograms betegner gjennomsnitt ± SE (n≥3) med statistisk signifikans beregnes ved t-test (*
P
0,05, **
P
0,01, ***
P
0,001)
for å måle tumorigent kapasitet på kulene, ulike antall kule dannende celler og uselekterte foreldre C666-1 celler ble injisert subkutant i flankene av nakne mus.. Vi fant at 10000 kule-dannende celler kan danne tumorer i alle inokulerte mus (tabell 1). Injeksjon av 1000 sfæroide celler iblant dannes en svulst av seks mus. Men minst 500.000 uselekterte C666-1 celler var nødvendig for tumordannelse. De sfæroide celler viste minst 50 ganger høyere karsinogent potensial enn de ikke-valgte celler. For ytterligere å verifisere om de kule-dannende celler som er i stand til serielt som forplanter seg i nakne mus, ble xenografter utviklet fra sfæroider serielt podet inn i nakne mus. Alle av dem viste vellykkede serielle transplantasjoner og svulster var observerbar på 3-4 uker (data ikke vist).
Vi undersøkte uttrykk mønster av flere stamcellemarkører og overflateantigener i disse kulene. Ved QRT-PCR-analyse, fant vi at uttrykket av flere stamcellemarkører (OCT4, Nanog, ALDH1, CD44 og CD133) i kulene var betydelig høyere enn for de monolagsforeldre C666-1 celler (alle
P
0,05, figur 1B).. Økt uttrykk for CKIT, KLF4 og KLF5 i kulene ble også bemerket. Selv om vi ikke oppdage oppregulering av SOX2 transkripsjon i sfære-dannende celler, ble SOX2-uttrykk (SOX2 +) celler vist seg å være sterkt anriket på kulene (70,8 ± 2,16%) ved flowcytometri (all
P
0,001, figur 1C).. Vi har også oppdaget SOX2 uttrykk i 0,77 ± 0,13% av cellene i NPC xenografter. Funnene bekreftet at kulene stammer fra EBV-positive C666-1 celler stille CSC fenotyper.
Sphere-forming cscs Express Cell Surface Protein CD44
Siden transkripsjon av CD44 og CD133 ble betydelig økt i sfæroider, og deretter bekreftet vi hvorvidt ekspresjonen av disse cscs overflatemarkører var spesifikk for NPC kule-dannende celler. Ved strømningscytometri og immunfluorescens farging, har man vist at et flertall av cellene i C666-1 kuler (84,14 ± 1,12%) var CD44 positive (fig. 1D og S1 fig.). CD44 + celler ble også funnet som en undergruppe av foreldrecellene C666-1 (5,28 ± 1,29%) og tre NPC xenotransplantater, xeno-666 (12,31 ± 1,97%), xeno-2117 (9,58 ± 1,80%), og C17 (17,31 ± 1,76%) (fig. 1D). Imidlertid, ble CD133-uttrykkende celler detektert i bare 32,11 ± 2,35% av sfæroider celler, og 1,90 ± 0,84% av foreldre C666-1 celler. Videre CD133 + -celler var helt fraværende i to av de xenotransplantater (xeno-666 og xeno-2117) (fig. S2). Derfor foreslo vi at CD44 er en felles kandidat CSC overflaten markør for EBV-positive NPC.
CD44 + celler Express SOX2 og utstillings Høyere Clone- og Sphere dannende Effektivitet
Uttrykk for stamcelle transkripsjon faktor SOX2 var konsekvent detektert i en tumorcelle sub-populasjon i primær NPC og antas å være en mulig markør for NPC cscs [12]. Derfor vurderte vi co-uttrykk for CD44 og SOX2 i kuler og uselektert monolags C666-1 celler, samt 3 xenografter og 5 primære svulster ved flowcytometri. Som vist i figur 2, over 60% av sfæroide celler (66,57 ± 2,72%) uttrykt både CD44 og SOX2. Tilfeldigvis SOX2 uttrykk sjelden ble påvist i CD44- brøkdel av C666-1 kule dannende celler, noe som tyder på en fortrinnsrett uttrykk for dette stamcelletranskripsjonsfaktor i CD44 + celler. Co-uttrykk for CD44 og SOX2 ble også påvist i 0,1 til 9% av cellene i NPC cellelinje, xenograft og primærsvulster. Funnene underforstått at CD44 + SOX2 + celler er potensielle cscs i NPC. For å bevise denne hypotesen, utførte vi funksjonelle analyser i CD44 + og CD44- celler isolert fra foreldre C666-1 celler. Representative figurer av CD44 ekspresjon i de isolerte CD44 + og CD44- celler er vist i figur S3. Som vist i figur 3A, ble betydelig høyere klon formasjon effektivitet påvist i CD44 + cellefraksjon enn den til CD44- fraksjon (
P
0,01). Videre kan CD44 + -celler generere signifikant høyere antall sfæroider sammenlignet med CD44- celler (
P
. 0,001, 3B figur).
ved strømningscytometri, SOX2 ble funnet å være selektivt uttrykt på CD44 + celler og tilfeldigvis, SOX2 uttrykk sjelden ble påvist i CD44- celler. Celler coexpressing både CD44 og SOX2 ble funnet å bli beriket i kulene. Histograms betegner gjennomsnitt ± SE (n≥3) med statistisk signifikans beregnes ved t-test (*
P
0,05, **
P
0,01, ***
P
. 0,001)
CD44 + cellefraksjon viste en signifikant høyere (A) klone dannelse effektivitet og (B) sfære dannende effektivitet i forhold til CD44- cellefraksjon. I tillegg (C) CD44 + celler oppviste betydelig høyere enn formeringshastigheten CD44- celler. (D) Utviklings hierarki funksjon av CD44 + celler. Prosentandelen av CD44 + celler ble kontinuerlig redusert i den isolerte CD44 + cellefraksjon over tid. (E) CD44 + celler som viste høyere motstand mot 5-FU-behandling sammenlignet med CD44- og paren C666-1 celler. Alle grafer som viser gjennomsnitt ± SE (n≥3) med statistisk signifikans beregnes ved t-test (*
P
0,05, **
P
0,01, ***
P
. 0,001)
spredning av CD44 + celler
etter WST1 spredning analysen, CD44 + celler viste en signifikant høyere spredning rente i forhold til CD44- og foreldre C666-1 celler, mens CD44- celler viste en betydelig lavere spredning rente i forhold til foreldre C666-1 celler. (alle P . 0.01, figur 3C)
hierarkiske forholdet mellom CD44 + og CD44- Cells
i samsvar med CSC egenskaper, vi viste at de sorteres CD44 + C666-1 celler besatt evnen til å gi opphav til både CD44 + og CD44- celler. Som vist på fig. 3D, er en reduksjon i CD44 + cellefraksjon i de sorterte CD44 + celler ble detektert ved strømningscytometri over tid. Det er sannsynlig at sorteres CD44 + celler som gir opphav til en heterogen populasjon gjennom nedregulering av CD44 i en undergruppe av disse cellene etter dyrking
in vitro.
Imidlertid ingen vesentlig endring i prosentandelen av CD44 + cellefraksjon i begge usortert foreldre og sortert CD44- celler ble oppdaget etter 3-6 dager med passering. Resultatene tyder på en hierarkisk relasjon av CD44 + og CD44- celler i EBV-assosiert NPC.
Chemoresistance av CD44 + celler
For å undersøke chemoresistance av CD44 + -celler til anti-kreft kjemoterapeutika, vi utførte celleoverlevelsesanalyser for CD44 + og CD44- cellefraksjoner ble behandlet med fluorouracil (5-FU), cisplatin eller doksorubicin. Den CD44 + celle brøkdel av C666-1 utstilt sterkere chemoresistance til 5-FU i forhold til foreldre uselekterte C666-1 celler og CD44- fraksjonen (alle
P
0,05) (Fig. 3E). Den chemoresistance av CD44 + celler mot cisplatin eller doksorubicin var lik CD44- og foreldre C666-1 celler (data ikke vist).
Forskjellig uttrykte gener i NPC-avledet Spheroids
For å grundig karakterisere egenskapene til NPC cscs, undersøkte vi uttrykket av cellulære og EBV gener i NPC sfære dannende celler ved hjelp olignonucleotide mikromatriser og qPCR analyser. Først vurderte vi EBV kopiantall og uttrykket nivået av EBV gener inkludert EBNA1, LMP1, LMP2A, BARF1, EBER1 og BZLF1 i C666-1 kuler. Sfæren dannende celler viste høyere EBV kopiantall og latent genuttrykk enn foreldre C666-1 celler (fig. 4A). Vi oppdaget betydelig heving av EBER1, BARF1 og lmp1 uttrykk i kulene (alle
P
0,05). Det ble ikke observert noen signifikant forskjell i uttrykket av EBV umiddelbar tidlig lytisk genet BZLF1 mellom kulene og foreldre C666-1 celler.
(A) ved QRT-PCR, flere EBV gener (Eber BARF1, LMP1, LMP2A, EBNA1 og BZLF1) ble funnet å være overuttrykt i kuler i forhold til monolags C666-1 celler. EBV kopiantall i disse celler ble bestemt ved qPCR. (B) Valgte gener abnormt uttrykt i kulene ble bekreftet ved QRT-PCR. De betydelig oppregulert gener inkluderer chemokiner og reseptorer (CCR7, CCI4, CX3CL1 og IL-8), celleadhesjonsmolekyl SELE, signalmolekyler (GLI1, FOXN4) og ABC transportører (ABCC3, ABCC11). (C) celleoverflateuttrykt CCR7 ble funnet å være ofte uttrykkes i sfæren-dannende celler (mer enn 60%) ved strømningscytometri. Den CCR7 + cellepopulasjon ble også påvist i NPC linjer og primære svulster ( 5%). (D) CD44 + CCR7 + celler ble også funnet å være anriket på sfæroidene. Histograms betegner gjennomsnitt ± SE (n≥3) med statistisk signifikans beregnes ved t-test (*
P
0,05, **
P
0,01, ***
P
. 0,001)
De cellulære gener forskjellig uttrykt i kuler og mono C666-1 celler ble identifisert ved microarray analyse. Uttrykk for 830 og 260 gener ble funnet å vise mer enn fem ganger økning og nedgang i sfæren dannende celler henholdsvis. Gene ontology analyse viste at de 5 store molekylære funksjons kataloger anriket i de differensielt uttrykte gener omfatter: regulering av transkripsjon, immunrespons, regulering av apoptose, celleadhesjon, og transmembran-transport, hver med betydelige P-verdier (tabell 2 og tabell S2). Et utvalg av forskjellig uttrykt gener ble oppført i tabell 2. Ved QRT-PCR, validert vi uttrykket av utvalgte gener involvert i å opprettholde stamcelleegenskaper i kulene og foreldre C666-1 (Fig. 4B). Betydelig økt uttrykk (
P
0,05) av kjemokiner og reseptorer (IL8, CCI4, CX3CL1, CCR7), signalveien relaterte gener (FOXN4 og GLI1), og celleadhesjonsmolekyler (Sele) ble bekreftet i sfæroidene (fig. 4b). Spesielt, er to ATP-bindende kassett (ABC) transporter gener (ABCC3 og ABCC11) også sterkt uttrykt i kulene (alle
P
0,01). Overekspresjon av disse genene kan være ansvarlig for kjemoresistent funksjon i NPC cscs (Fig. 4B).
Uttrykk av CCR7 i CD44 + cscs av NPC
Blant de differensielt uttrykte gener, CCR7, en kjemokinreseptor, viste den høyeste ganger endring i uttrykket i kulene av microarray analyse og ble dermed valgt for videre undersøkelser. Ved strømningscytometri, en betydelig anrikning av CCR7 + celler ble detektert i kuler i forhold til parentale celler (alle
P
0,001, figur 4C.). Vi har også oppdaget CCR7 uttrykk i 0,53 ± 0,14% og 2,87 ± 1,53% av cellene i xenografter og primære svulster hhv. Flerfarget flowcytometrisk analyse viste at et flertall av CCR7 + celler ble ko-uttrykt med CD44. CD44 + CCR7 + celler ble beriket med kuler i forhold til de xenografter og primære tumorer (alle
P
0,001, figur 4D.). Dette kandidat CSC fraksjonen ble også påvist i NPC tumorlinjer og primære svulster.
Siden CCR7 ble sterkt uttrykt i NPC sfæren dannende celler og korrelert med lymfeknutemetastaser i ulike kreft hos mennesker, vi da bestemt foreningen av CCR7 uttrykk med de kliniske parametre i 39 primær NPC tilfeller. Representative CCR7 ekspresjonsmønstre i primære tumorer er vist i figur 5. CCR7 ekspresjon er signifikant korrelert med CD44-ekspresjon i disse tilfellene (fig. S4). Blant NPC prøvene, 8 (20,5%) var negative for CCR7 farging. Svak, middels og høy ekspresjon av CCR7 ble påvist i 13, 7 og 11 primær tilfeller respektivt. Viktigere, fant vi at CCR7 uttrykk korrelert med tilstedeværelse av tilbakevendende sykdom og fjernmetastaser (tabell 3). Funnene underforstått at CCR7-uttrykke celler kan bidra til utvikling av sykdommen.
Representative primære NPC tilfeller med høy (A), medium (B), lav (C) uttrykk for CCR7. (D) Primær NPC med fravær av CCR7 uttrykk ble vist. CCR7 farging ble påvist i noen infiltrerende lymfocytter, men ikke i kreftceller. Primære tumorer med høy (E) og medium (F) CD44 ekspresjon ble vist. I (G) og (H), ble svak CD44 uttrykk påvist i kreftceller, mens sterk CD44 flekker i infiltrere lymfocytter ble ofte funnet.
For å undersøke hvilken rolle CCR7 i NPC CSC , benyttet vi en CCR7-blokkerende antistoff for å nøytralisere dets funksjon i sperre, CD44 + og CD44- C666-1 celler. Cellene ble behandlet med 0-250 ng /ml CCR7 blokkerende antistoff i 24 timer og proliferasjonen av celler ble målt ved hjelp av WST1 assay. Observerbar reduksjon i celleformering ble observert i CD44 + cellefraksjon i forhold til CD44- og foreldre C666-1 celler. (Fig. 6A). Redusert klon formasjon effektivitet ble også funnet i C666-1 celler behandlet med CCR7 blokkerende antistoff (
P
0,05, figur 6B.). Viktigere, sfære dannende evne ble betydelig hemmet etter CCR7 blokkering antistoff behandling (
P
. 0,001, figur 6C). Resultatene gitt bevis for involvering av CCR7 i å opprettholde CSC funksjon i NPC.
For å vurdere funksjon av CCR7 i cscs, C666-1 ble behandlet med CCR7 blokkere antistoff og dens spredning, klone dannende og Sphere dannende effektivitet ble undersøkt. (A) spredning av CD44 + celler ble hemmet etter behandling med CCR7 blokkerende antistoff. (B) klon dannelsen effektivitet av C666-1-celler ble svekket etter CCR7 blokkering og (C) den sfæroide dannende egenskaper var signifikant inihibited (
P
0,001) sammenlignet med ubehandlede kontroller. Histograms betegner gjennomsnitt ± SE (n≥3) med statistisk signifikans beregnes ved t-test (*
P
0,05, ***
P
0,001).
Diskusjoner
Denne studien gir det første bevis på eksistensen av høyt tumorigene cscs i EBV-positive NPC. Vi har utviklet en protokoll for å få EBV-positive NPC cscs for videre karakterisering. Dannelsen av sfæroider er en viktig funksjonell egenskap av cscs i humane cancere [17]. I denne studien har vi lyktes i å isolere en potensiell CSC befolkningen i EBV-positive NPC cellelinje C666-1 gjennom høsting kreft sfærer. Stamcelle-lignende egenskaper i sfære dannende C666-1 subpopulasjon oppnådd ble bekreftet ved å vise den opp-regulering av multiple stamcelleassosierte gener og høy tumorgenisitet i nakne mus [9], [18], [19]. Gjennom omfattende karakterisering av NPC kuler, tumorlinjer og primærtumor, har vi avdekket at CD44 og SOX2 er potensielle CSC markører for NPC. Celleoverflatemarkører er avgjørende for å identifisere cscs blant de heterogene tumorceller. CD44 er et hyaluronan reseptor og har vist seg å være markør for cscs i hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) [7]. I denne studien viste vi at CD44 uttrykk ble beriket i NPC cscs. Som dokumentert fra den betydelig høyere sfære dannende evne CD44 + NPC celler, ble CSC undergruppe bekreftet å bli beriket i denne CD44 + fraksjonen. Motstanden av CD44 + celler til 5-FU behandlingen er i samsvar til foreslåtte CSC egenskaper. I tillegg til CD44, vår studie også oppdaget anriking av SOX2-uttrykke celler i kulene, den funksjonelle NPC cscs. Interessant nok var tilsvarende nivå av SOX2 transkripter finnes i begge sfæren dannende og foreldre C666-1 celler. I henhold til vår upubliserte funn, kan den økede SOX2 proteinekspresjon være på grunn av tap av SOX2-undertrykker mirnas (MIR-183 og MIR-203) i kulene. SOX2 er en transkripsjonsfaktor som styrer pluripotency i embryonale og voksen-vev spesifikke stamceller [20]. Den regulerer stamcelleselvfornyelse og differensiering og er ofte funnet å være oppregulert i kreft hos mennesker [21]. Zhang
et al
. (2010) har foreslått at SOX2 + celler har stemness egenskaper [12]. De har vist at SOX2 ble uttrykt og samlokalisert med OCT4 i primær NPC. I samsvar med Zhang funn, våre resultater viste at CD44 + SOX2 + celler er anriket i NPC cscs.
Isolering av kule dannende celler i EBV-positive NPC cellelinje gitt oss en mulighet til å vurdere uttrykk for EBV latent og lytiske gener i CSC. Spesielt ble forhøyet uttrykk av EBV latent genprodukter, EBER1, BARF1 og lmp1 påvist i CSC undergruppe. Vi har tidligere demonstrert at uttrykket Eber gir resistens mot apoptose spenning [22]. Den høye EBER ekspresjon i NPC cscs tyder på at denne celle subpopulasjon kanskje mer resistente mot apoptose. På den annen side kan lmp1 indusere EMT via Twist eller sneglen, som sammenfaller med oppkjøpet av CSC egenskaper [23], [24], [25]. I tillegg Kondo
et al
. har også nylig vist at lmp1 induserer CD44 + CSC i nasofaryngeale epitelceller [26]. Funnene antyder at lmp1 uttrykk kan spille en avgjørende rolle i CSC vedlikehold i denne EBV-assosiert malignitet.
I tillegg til EBV latente gener, vår microarray analyse viste en overekspresjon av CCR7 i NPC-avledet kuler. Anriking av CCR7 + cellepopulasjonen i kule-dannende celler ble bekreftet ved strømningscytometri. CCR7 er en kjemokin reseptor som medierer cellemigrering som reaksjon på dens ligand CCL21 [27]. Det er sannsynlig at høy CCR7 reseptor uttrykk i sfæren dannende celler vil forbedre sin følsomhet for ligander og aktivere sin nedstrøms signalering. Avvikende CCR7 uttrykk i humane kreftformer har vært knyttet til celle overlevelse og metastatiske veier. Den CCL21 /CCR7 sti kan spille en avgjørende rolle i metastasering av CCR7 + cscs til lymfeknuter [28]. Overekspresjon av CCR7 i cscs er sannsynlig å bidra til de hyppige livmorhalslymfeknutemetastaser i NPC pasienter [29]. Den avskaffet sfære dannende evne NPC celler etter CCR7 nøytralisering foreslo CCR7 kan også regulere CSC eiendommer i NPC.
Drug motstand er en viktig egenskap ved cscs, som danner grunnlaget for svulst tilbakefall etter kjemoterapeutiske behandlinger [30 ]. Øket ekspresjon av ATP-bindende kassett (ABC) transportør familie er ansvarlig for utstrømningen av terapeutiske legemidler, og er en vanlig mekanisme for å opprettholde medikament-resistens i cscs [31], [32]. Som vist i vår microarray studie ble betydelig overekspresjon av ABCC3 og ABCC11 funnet i sfæren dannende celler. ABCC3 er et medlem av multiresistens protein (MRP) underfamilien og ble vist å være over-uttrykt i ovarie karsinom og doxorubicin-resistente lungekreft cellelinjen [33], [34]. ABCC3 overekspresjon kan bidra til resistente egenskaper i cisplatin- /doksorubicin-resistente C666-1 cellelinjer (Fig. S5). ABCC11 er en annen MRP familiemedlem oppregulert i NPC-avledet kuler. Det er hovedtransportøren til 5-fluorouracil (5-FU) [35], som er en av de viktigste kjemoterapeutiske medikamenter for NPC [3]. Over-uttrykk for ABCC11 i sfæren dannende celler tyder på at CSC befolkningen i NPC er motstandsdyktig mot kjemoterapeutiske legemidler, og dermed bidra til tumorresidiv.
Hedgehog signalveien er en viktig regulator av CSC vedlikehold og funksjon. I C666-1 kuler, har microarray studien også oppdaget økt uttrykk av GLI1, en stor transkripsjon aktivator av pinnsvin signalveien. I ovariekarsinom, ble GLI1 rapportert å regulere veksten av cscs [36]. Å belyse rollen GLI1 og pinnsvin sti i NPC cscs, vil effekten av å kneble GLI1 uttrykk på dannelse og tumorigene egenskaper kule dannende celler undersøkes. Klarlegging på signale mekanismer som regulerer spredning og apoptose av NPC cscs vil dra terapier rettet på dette undergruppe av legemiddelresistent celler.
I konklusjonen, vi har identifisert svært tumorigene cscs i EBV-positive NPC og denne undergruppe kan være beriket av celleoverflaten CD44 og identifisert sammen med SOX2. Vår undersøkelse har avdekket flere viktige molekyler inkludert CCR7 og ABCC11 involvert i vedlikehold av NPC CSC funksjoner. De foreliggende resultatene gitt grunnlag for utvikling av nye behandlingsformer rettet mot NPC CSC som kan forsterke effekten av nåværende behandlinger.
Materialer og metoder
cellelinjer, xenograft og primære svulster
Et EBV-positive NPC cellelinje (C666-1) og 3 xenotransplantater (xeno-666, xeno-2117 og C17) ble inkludert i denne studien [13], [14], [15]. Foreldre C666-1 ble dyrket i RPMI-1640 (Sigma-Aldrich) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Invitrogen). For tumor sfære kultur ble cellene dyrket i serumfritt DMEM-F12 (Invitrogen) på ultralave festeplatene. Spheroids ble dissosiert og passert hver 6-8 dager. Totalt 1 × 10
6 C666-1 celler ble sådd per brønn og antall kuler dannet ble regnet.
Fem endoskopiske tumor biopsier for FACS analyse ble innhentet fra NPC pasienter med skriftlige samtykke i Institutt for otolaryngologi, Prince of Wales Hospital, CUHK. Alle tilfellene var positive for
EBER Anmeldelser –
in situ
hybridisering og histologisk diagnostisert som udifferensiert eller dårlig differensiert NPC. Vi rekrutterte også 49 arkivformalinfiksert parafin-embedded primære svulster fra vevet bank av Department of Anatomisk Cellular Pathology, CUHK for immunhistokjemisk (IHC) farging. Studien protokollen ble godkjent av Klinisk forskningsetiske komité for det kinesiske universitetet i Hong Kong.
Kvantitativ Reverse Transcription og Polymerase Chain Reaction (QRT-PCR) Analyse
Totalt RNA ble ekstrahert ved hjelp av Qiagen RNeasy-sett (Qiagen) og revers-transkribert til cDNA ved anvendelse av Superscript cDNA Synthesis Kit (Invitrogen) i overensstemmelse med fabrikantens protokoll. Kvantitativ RT-PCR ble deretter utført med spesifikke primere (Invitrogen, primer sekvenser som er oppført i tabell S1) og Power SYBR® Grønn PCR mix (Applied Biosystems). β-aktin-ekspresjon ble brukt for data normalisering. Alle QRT-PCR ble utført i tre paralleller på en ABI 7500 real-time PCR system (Applied Biosystems) som beskrevet av produsenten.
fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) Analyse
Enkelt celle suspensjoner oppnådd fra cellelinjer og tumor vev ble skylt to ganger og resuspendert i PBS (10
5 til 10
6 celler /100 ul). For intracellulær farging ble cellene fiksert i 70% etanol i 24 timer ved -20 ° C før rehydrering med PBS.
