Abstract
UDP-(UGT) familie av enzymer spiller en viktig rolle i avgiftning av kreftfremkallende, så vel som clearance av anti-kreft narkotika. Hos mennesker har 19 UGT-familiemedlemmer er identifisert og er uttrykt i en vevsspesifikk måte i hele kroppen. Imidlertid UGTs har ikke tidligere blitt karakterisert i melanocytter eller melanom. I denne studien ble UGT2B7, UGT2B10, og UGT2B15 identifisert som normalt uttrykt i humane melanocytter. De samme tre UGT familiemedlemmer ble også uttrykt i den primære melanom cellelinje WM115. Ingen UGT ekspresjon ble påvist i et annet primært melanom-cellelinje, WM3211, eller i en hvilken som helst metastatisk melanom cellelinje undersøkt. Disse resultatene tyder på at UGT uttrykk er tapt under melanom progresjon. Behandling av WM3211 eller metastatisk melanom cellelinjer med anti-kreft agenter (herunder vemurafenib) indusert uttrykk for UGT2B7, UGT2B10 og UGT2B15 demonstrere at melanomceller beholde evnen til å re-uttrykke de samme tre UGTs. Den tilsvarende økningen i glukuronidering aktivitet i melanomceller følgende anti-kreft-behandling ble også observert. Videre knockdown av UGT2B7 i WM115 celler sensitivisert disse cellene til behandling av adriamycin og epirubicin indikerer at UGT2B7 er involvert i resistens mot disse stoffene. Imidlertid knockdown av UGT2B7 hadde ingen effekt på temozolomid toksisitet. Samlet utgjør disse resultatene viser tydelig en rolle for UGTs i melanom etiologi. Siden UGTs er legemiddelmetabolisme enzymer, foreslår vi at gjen uttrykk for UGTs utgjør en tidligere uventet mekanisme for intratumoral legemiddelresistens i melanom
Citation. Dellinger RW, Matundan HH, Ahmed AS, Duong PH, Meyskens FL Jr (2012) anti-kreft narkotika Elicit Re-uttrykk for UDP-glukuronosyltransferaser i melanomceller. PLoS ONE 7 (10): e47696. doi: 10,1371 /journal.pone.0047696
Redaktør: Keiran Smalley, The Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 16 juli 2012; Godkjent: 17 september 2012; Publisert: 22 oktober 2012
Copyright: © Dellinger et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av generøs støtte fra Oxnard og Waltmar Foundations samt tilskudd fra National Institutes of Health National Cancer Institute [P30CA62330] til FLM og kreft biologi trening bevilgning [T32CA009054] gitt lønn støtte for RWD for dette arbeidet. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
UGT familie av enzymer katalyserer glukuronidering av et bredt spekter av xenobiotiske og endogene forbindelser. UGTs konjugere en glukuronsyre gruppe til deres substrater, å endre de biologiske egenskapene til underlaget og øke dets utskillelse i urin eller galle [1], [2]. Generelt omformer glukuronidering substrater i mindre bioaktivt, flere vannoppløselige produkter som letter deres fjernelse fra kroppen. På denne måte kan de UGTs er integrert er involvert i den avgiftning av mange kreftfremkallende, clearance av narkotika og metabolismen av en rekke endogene substrater som for eksempel bilirubin, steroidhormoner og bioaktive lipider [1], [2]. Det er 19 funksjonelle humane UGTs klassifiseres i tre subfamilier basert på strukturell og aminosyresekvenshomologi, UGT1A, UGT2A og UGT2B [2].
UGTs er membranbundne enzymer i hovedsak lokalisert til det endoplasmatiske retikulum [1], [3]. Substratspesifisitet varierer mellom familiemedlemmer, med bred overlapping, og deres substrat spesifisitet kan endres ved posttranslational modifikasjoner som fosforylering [4]. Selv UGTs er primært uttrykt i lever, de spiller også viktige roller i andre vev i kroppen. For eksempel er UGT2B15 og UGT2B17 uttrykt i prostata hvor de regulere lokalt androgennivåer gjennom glukuronidering [5] og UGT1A10 og UGT2B7 er uttrykt i bryst hvor det regulerer østrogener [6]. Det er også mange eksempler på at de UGTs spiller viktige roller i aerodigestive veiene, mage-tarmkanalen, lunge, tykktarm, blære, nyrer og hjerne [7], [8], [9], [10], [11]. Men rollen til UGTs i huden, det største organet i kroppen, har ennå ikke undersøkt.
melanom er en av de raskest voksende krefttyper i USA og antall tilfeller på verdensbasis har doblet de siste 30 årene [12]. Melanom, som oppstår fra melanocytter, er en meget aggressiv svulst som invaderer de vaskulære og lymfatiske systemer til å danne svulster andre steder i kroppen [12], [13], [14]. Melanom er en spesielt spenstig kreft, sto for bare 4% av alle tilfeller av hudkreft, men står for 80% av hudkreft dødsfall [15]. Videre bare 14% av pasienter med metastatisk melanom overleve i 5 år [15].
systemisk behandling tilnærminger har oppnådd minimal suksess mot metastatisk melanom som resulterer i bare noen få FDA-godkjente behandlinger [16]. Interferon-α2b, interleukin-2 og temozolomid har alle vist begrenset effekt med responsrate vanligvis under 15% på kort sikt med ingen klar effekt på melanom relatert dødelighet [16]. Men den nylige suksessen til den spesifikke BRAF mutant inhibitor vemurafenib i en fase 1 klinisk stien er svært lovende [17]. En estimert progresjon overlevelse av 7 måneder ble rapportert hos alle pasienter som hadde BRAF V600E mutasjon [17], som er tilstede i omtrent 50% av alle melanomer [18]. Imidlertid har spenning for vemurafenib som monoterapi blitt herdet noe siden ervervet resistens er allerede observert [17]. Dermed forstå mekanismen (e) av resistens mot kjemoterapi som melanomceller ansette er viktig å bekjempe denne dødelige sykdommen.
Målet med denne studien var å karakterisere uttrykk og funksjon UGTs i melanocyttene og melanom og å undersøke potensielle rolle UGTs i legemiddelresistens. Bevis som presenteres her avslører tre UGT familiemedlemmer, UGT2B7, UGT2B10 og UGT2B15, som blir vanligvis uttrykt i humane melanocytter isolert fra neonatal forhud. De samme tre UGTs ble funnet å bli uttrykt i den primære melanomcellelinje WM115. Interessant nok ble det ikke UGT ekspresjon observert i et annet primært melanom-cellelinje, WM3211, eller i en hvilken som helst av de tre metastatiske melanomcellelinjene som ble undersøkt, hvilket antyder at UGT uttrykk er tapt under melanom progresjon. Men behandling av melanom celler med anti-kreft agenter resulterer i gjen uttrykk for de samme tre UGTs. Denne romanen gjen uttrykk for UGTs i melanom er undersøkt nærmere her.
Materialer og metoder
Reagenser og cellekultur
Temozolomide, adriamycin, epirubicin og alamethicin ble oppnådd fra Sigma . Vemurafenib ble kjøpt fra Selleck (Houston, Texas). Normale menneskelige melanocytter ble isolert fra avidentifisert nyfødt forhuden fra omskjæring kirurgi i samsvar med en protokoll godkjent av UC Irvine internrevisjon Review Board. I samsvar med denne protokoll godkjent det ikke er rekrutteringen av fag, er det bare kastes omskårne vev oppsamlet. Ingen identifiserende informasjon samles i forbindelse med denne vev som ellers ville bli forkastet. Melanocytter ble isolert som tidligere beskrevet [19], [20] og dyrket i MCDB153 media supplert med 2% føtalt bovinserum, 10 ng /ml 12-O-tetradecanoylphobol-13-acetat og 0,15% bovint hypofyse-ekstrakt. De melanomcellelinjer WM115, WM3211, Lu1205, SKmel28 og A375 ble dyrket som tidligere beskrevet [21], [22], [23]. Bare WM3211 har WT B-Raf, alle andre havne V600E mutasjoner. Alle cellelinjer testet negativt for mycoplasma.
Total RNA Isolation, Reverse Transcription og PCR
Total RNA ble isolert fra celler ved hjelp av Arum total RNA mini Kit (BioRad) ifølge selskapene følger protokollen. RNA ble kvantifisert ved hjelp av et Nanodrop 1000 (Thermo /Fisher) cDNA ble deretter gjort fra 1,0 ug av RNA ved å bruke revers transkriptase iScript Kit (BioRad) i henhold til standard protokoller. PCR ble deretter utført ved anvendelse av en hurtig belastning Taq (2x) masterblanding (New England Biolabs) og kjørt på en Applied Biosystems GeneAmp System 2700 termosykler ved anvendelse av følgende protokoll: Trinn 1 = 94 ° C i 5 min; Trinn 2 (40 sykluser) = 94 ° C i 30 sek, 55 ° C i 30 sek, 68 ° C i 1 min; Trinn 3 = 68 ° C i 10 min. Tabell S1 i supplerende data viser primere som brukes til å forsterke enkelte UGT familiemedlemmer.
Real-Time PCR
For å analysere UGT mRNA uttrykk nivåer i melanomceller real-time PCR ble utført som tidligere beskrevet [3], [24]. I korthet pre-designede TaqMan genekspresjon Analyser [Applied Biosystems (ID er Hs02383831_s1 for UGT2B4, Hs00426592_m1 for UGT2B7, Hs02556282_s1 for UGT2B10; Hs03008769_g1 for UGT2B15 og Hs99999905_m1 for GAPDH)] ble brukt i henhold til produsentens protokoll. Sanntids-PCR ble utført ved anvendelse av et totalt volum på 20 ul inneholdende 50 ng av cDNA ved anvendelse av GAPDH som normalisering «housekeeping» gen. Real-time PCR ble utført på en CFX96 Real-Time PCR maskin (BioRad). Rapporterte mRNA uttrykk verdier er gjennomsnittet av minst 3 uavhengige eksperimenter med standardavvik.
shRNA
Ready-klonet shRNA målrettet mot UGT2B7 og kontrollere tomme ekspresjonsvektorer ble kjøpt Origene. Hver shRNA vektor ble transfektert inn WM115 celler ved hjelp av Biot transfeksjon middel (Bioland Scientific) i henhold til fabrikantens protokoller og stabil uttrykk ble valgt for ved tilsetning av puromycin (Invivogen).
MTT analysen
Å bestemme effektene av medikamenter på celleproliferasjon vi utførte 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) (Sigma assayer Aldrich). i korthet ble cellene sådd ut over natten ved 2000-4000 celler /brønn (avhengig av celledoblingstidene) i 96-brønners plater, og behandlet med enten adriamycin, epirubicin, eller temozolomid ved serielle fortynninger av medikamentet. Etter den tredje dag etter behandlingen, blir MTT fortynnet i fargestoff-fritt medium tilsatt til hver brønn og inkubert i 3 timer. etter at MTT metaboliseres av aktivt prolifererende celler i vann uoppløselig formazen deretter blir dimetylsulfoksyd (Sigma Aldrich) tilsatt, og kolorimetriske endringer blir analysert og kvantifisert med et spektrofotometer ved 590 nm. Resultater fra MTT ble analysert ved anvendelse av Graphpad Prism hvor doseringen av medikamentet i forhold til sin effekt på proliferasjonen tegnes; en ikke-lineær regresjonskurve hjelp av sigmoidal dose-respons-ligningen ble anbrakt på grafen og den halv-maksimal hemmende konsentrasjon (IC
50) oppnås. Rapporterte IC
50 verdier er gjennomsnittet av minst 3 uavhengige eksperimenter med standardavvik.
UGT Activity Assay
UGT-aktivitet ble undersøkt ved hjelp av UGT-Glo assay (Promega) ifølge produsentens protokoller. Cellehomogenater ble fremstilt ved å re-suspendepelleterte celler i Tris-bufret saltvann (25 mM Tris-base, 138 mM NaCl og 2,7 mM KCl, pH 7,4), og å utsette dem for tre runder med frysing og tining før homogeniseringen ved hjelp av et glass Dounce homogenisator . Cellehomogenater (5-20 mg protein /ml) ble lagret ved -70 ° C i 100 ul aliquoter. Totalt cellehomogenat proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved hjelp av BCA analysen fra Pierce Biotechnology (Rockford, IL) etter protein utvinning ved hjelp av standardprotokoller. Humane levermikrosomer (Xenotech, Lenexa, KS) ble anvendt som en positiv kontroll. Homogenater ble inkubert med alamethicin i 10 minutter på is. Hver reaksjonsblanding besto av 50 ug homogenat, UGT-Glo-buffer, 50 uM UGT Multienzyme substratet og vann til totalt 30 pl. Deretter enten 10 ul vann eller 10 pl 16 mM UDPGA (sluttkonsentrasjon 4 mM) ble tilsatt. Hver av disse reaksjoner ble utført i triplikat (totalt 6 reaksjoner for hvert homogenat). Reaksjoner ble deretter inkubert ved 37 ° C i 90 min. Bare reaksjoner med co-substrat UDPGA lagt kan glucuronidate underlaget. Etter 90 min blir 40 ul Luciferin deteksjonsreagensen i tillegg til D-cystein satt til alle brønnene, og det luminiserende signal tillates å stabilisere ved romtemperatur i 20 min. Platen ble så les videre et luminometer (Turner Biosystems modulus mikro). Som en negativ kontroll ett sett av seks reaksjoner ble utført uten noen UGTs tilstede. Den UGT Multienzyme Underlaget vil generere luminescens, men glukuronidert UGT Multienzyme underlaget vil ikke. Dermed er gjennomsnittet av triplikate reaksjoner med ko-substratet UDPGA subtrahert fra gjennomsnittet av triplikate reaksjoner uten UDPGA for å bestemme UGT aktivitet. Grafer er sammensatt av flere uavhengige eksperimenter med standardavvik.
Resultater
UGT Expression i Human Melanocytter og melanom
Mens UGT uttrykket har tidligere blitt rapportert i huden [25 ], UGT uttrykk i melanocyttene hadde ikke blitt spesielt adressert. I denne studien ble det menneskelige melanocytter isolert fra avidentifiserte neonatal forhud analysert for UGT uttrykk ved RT-PCR. Primersett designet for individuell UGT2B familiemedlemmer ble brukt, samt en felles primer satt til å oppdage eventuelle UGT1A familiemedlem. De UGT2As ble ikke målt som de er stort sett finnes i det olfaktoriske system [26]. Som vist i figur 1A, UGT2B7, ble UGT2B10 og UGT2B15 funnet å bli uttrykt i humane melanocytter. PCR-produktene som er anbefalt av svarte piler (figur 1A) kjørte på de antatte størrelser, ble skåret ut og individuelle UGT sekvenser ble bekreftet. Bandet i UGT2B4 kjørefelt (figur 1A, Lane 1) ble også tatt ut og fast bestemt på å bli UGT2B7 ved sekvensering. Dette er ikke så overraskende som de UGT2B familiemedlemmer dele høy homologi. Faktisk, UGT2B4 og UGT2B7 dele mer enn 90% identitet på DNA-nivå og strategier for spesifikke primere er vanskelig. Som en kontroll, ble RT-PCR utført ved anvendelse av lever RNA for å påvise at UGT primere settene var funksjonell og viser predikerte størrelser for hver UGT fragment (figur 1B). Uttrykk for de samme tre UGT familiemedlemmer ble også observert i humane melanocytter fra en andre avidentifisert neonatal forhud (tabell 1; merk at tallene 322 og 423 bare betegne datoer forhuden ble innhentet fra kaukasiske spedbarn). Deretter ble UGT ekspresjon undersøkt i flere primære og metastatiske melanomcellelinjer ved RT-PCR. I samsvar med den UGT uttrykk mønster observert i melanocytter, den primære melanom cellelinje WM115 utstilt bare UGT2B7, UGT2B10 og UGT2B15 uttrykk (figur 1C). På grunn av den høye homologi av familiemedlemmer, og i likhet med figur 1A, ble «UGT2B4» båndet i figur 1C bestemt til å være UGT2B7 etter DNA-sekvensering. Dessuten ble den øvre bandet i UGT1A kjørefelt skåret ut og sekvensert (selv om det var mindre enn forventet størrelse) og var fast bestemt på ikke å være noen UGT familiemedlem. Ingen UGT ekspresjon ble observert i et annet primært melanom-cellelinje, WM3211 (figur 1D), eller i en hvilken som helst av de tre metastatiske melanomcellelinjene som ble undersøkt (oppsummert i tabell 1, avbildet i fig S1). Disse resultatene antydet at UGT uttrykk er tapt under melanom progresjon.
(A) RT-PCR-analyse av totalt RNA fra humane melanocytter for UGT-familiemedlemmer. Primersett for UGT2Bs ble utformet for å være spesifikk for hver isoform mens en enkelt primer sett rettet mot den felles region av alle UGT1As ble brukt til å påvise UGT1A uttrykk. Total RNA fra human lever ble anvendt som en kontroll med UGT2B7 primere. Pilene viser DNA-bånd av forventet størrelse hvis sekvens ble bekreftet. (B) Kontroll RT-PCR-analyse av totalt RNA fra leveren ved å bruke primere angitte settene. (C) RT-PCR-analyse av totalt RNA fra den humane melanomcellelinje WM115 ved bruk av primere som er angitt sett. Pilene viser band som ble skåret ut og sekvensert. Band i UGT2B4 bane ble funnet å være UGT2B7 ved sekvensering mens UGT2B10 og UGT2B15 båndene ble bekreftet å være forventet UGTs. (D) RT-PCR-analyse av totalt RNA fra den humane melanomcellelinje WM3211. GAPDH ble anvendt som en positiv kontroll for å sikre her cDNA kvalitet. (E) Real-time PCR bruker TaqMan analyser mot indikert UGTs. ND = ikke påvist.
For å bedre sensitivitet og spesifisitet av UGT mRNA deteksjon, TaqMan genekspresjon analyser ble brukt for resten av denne rapporten. Disse analyser har blitt optimalisert for å være spesifikke for de enkelte UGTs ved hjelp av en sonde, så vel som et primersett. For å illustrere dette poenget, og re-bekrefter at UGT2B7 er til stede i melanocyttene i motsetning til UGT2B4, ble real-time PCR utnytte TagMan analyser utført på melanocyte cDNA. Figur 1E viser tydelig at UGT2B7 er faktisk uttrykt i humane melanocytter og UGT2B4 ble ikke oppdaget.
Re-uttrykk for UGT2B7, UGT2B10 og UGT2B15 i melanom i Response til kreftmedisiner
betraktning at de UGTs er fase II-metaboliserende enzymer og en av deres viktigste funksjonene systematisk er å eliminere narkotika, undersøkte vi om UGTs kan spille en rolle i iboende motstand av melanomceller overfor kjemoterapeutiske midler. Således ble det melanoma-cellelinje WM3211 behandlet med forskjellige anti-kreftmidler, og UGT-ekspresjon ble analysert ved sanntids-PCR. WM3211 ble valgt til disse forsøk, siden det ikke har noen påviselig UGT uttrykk som bestemt ved RT-PCR (figur 1D).
Først vi behandlet WM3211 celler med temozolomid, som for tiden er angitt for behandling av metastatisk melanom. En dose på 100 uM ble valgt for dette forsøk siden publiserte rapporter for temozolomid behandling av cellekultur vanligvis bruker et minimum på 100 uM [27], [28]. Som vist i figur 2a, UGT2B7, UGT2B10 og UGT2B15 ble gjen uttrykt i WM3211 cellene i respons til temozolomid. Interessant nok var det ingen andre UGTs indusert (data ikke vist), er det bare tre UGT-familiemedlemmer som vanligvis uttrykkes i melanocytter (tabell 1). Induksjon av UGT ekspresjon som reaksjon på temozolomid oppførte seg på en tidsavhengig måte med maksimal ekspresjon topp på 8 timer etter behandlingen (figur 2A). For alle tre UGTs deres uttrykk avtar etter 8 t, men deres uttrykk er fortsatt forhøyet 24 timer etter behandling (figur 2A).
ferdiglagede TAQMAN genekspresjon analyser ble brukt til å visualisere enkelte UGT uttrykk ved real-time PCR følgende behandling av WM3211 celler med (A) 100 uM temozolomid, (B) 1,0 pM adriamycin eller (C) 0,1 uM epirubicin. I alle tilfeller ble UGT2B7, UGT2B10 og UGT2B15 uttrykk kontrollert for den indikerte anti-cancer middel på 0, 8, 16 og 24 timer etter behandling. * Viser forskjellig skala for y-aksen.
For å belyse om re-uttrykket av disse tre UGT familiemedlemmer var bestemt for temozolomid eller om dette observerte responsen kan være en generell mekanisme for melanom til å forsvare seg mot kjemoterapeutika ble de anti-kreft agenter adriamycin og epirubicin også undersøkt. Disse to forbindelsene ble valgt ettersom de er nært beslektet antracykliner som vanligvis brukes for å behandle forskjellige typer av faste tumorer, selv om melanoma har vist seg å være resistente [29], [30]. Videre er epirubicin kjent for å bli metabolisert i første rekke ved UGT2B7 [31], mens metabolismen av adriamycin er mye mer kompleks og involverer flere forskjellige fase II-enzymer (inkludert UGTs) og ABC-transportører [30]. WM3211 melanomceller var enten ubehandlet eller behandlet med 0,1, 1,0 eller 10 mm adriamycin (figur S2A) eller epirubicin (figur S2B) og UGT uttrykk ble undersøkt ved real-time PCR etter 8 timer. I begge tilfeller UGT2B7, ble UGT2B10 og UGT2B15 observert å bli re-uttrykk. I likhet med temozolomid, ingen andre UGT familiemedlem ble indusert (data ikke vist). Tids kurs i forhold til UGT ekspresjon etter behandling av WM3211 celler med 1,0 pM adriamycin (figur 2B) eller 0,1 uM epirubicin (figur 2C) ble deretter utført. I begge tilfeller UGT2B7 er UGT2B10 og UGT2B15 indusert i en tidsavhengig måte, med det høyeste uttrykk observert ved 24 timer.
Re-uttrykk for UGT2B7, UGT2B10 og UGT2B15 i metastatisk melanomceller som svar på Epirubicin og vemurafenib
for å sikre at den observerte induksjon av UGTs ikke var begrenset til WM3211 celler, ble to metastatisk melanom cellelinjer (SKmel28 og A375) undersøkt for induksjon av UGT2B7, UGT2B10 og UGT2B15 svar på epirubicin. Tids kurs i forhold til UGT ekspresjon etter behandling av SKmel28 (figur 3A), eller A375 (fig S3) med 0,1 uM epirubicin ble deretter utført. Igjen, induksjon av alle 3 UGTs ble observert i begge disse metastatiske melanomcellelinjer med maksimal ekspresjon i 24 timer. Videre, siden motstanden er blitt observert i kliniske studier med lovende nytt legemiddel vemurafenib, undersøkte vi om de UGTs kan bli indusert etter vemurafenib behandling. SKmel28 celler, som er bærere av BRAF V600E mutasjon, ble behandlet med 1 mikrometer vemurafenib, samlet på 0, 8, 16 og 24 timer etter behandling og analysert for UGT uttrykk nivåer. Som vist i figur 3B, ble UGT2B7, UGT2B10 og UGT2B15 alle indusert som reaksjon på vemurafenib.
ferdiglagede TaqMan genekspresjon analyser ble brukt for å visualisere individuelle UGT ekspresjon av sanntids-PCR etter behandling av celler med SKmel28 (A ) epirubicin eller (B) vemurafenib. Tidsforløpet for UGT2B uttrykk følgende epirubicin (100 nM) eller vemurafenib (1 uM) behandling ble undersøkt på 0, 8, 16 og 24 timer. * Angir forskjellig skala for y-aksen. ND = ikke påvist.
Økt Glukuronidering i melanomceller etter behandling med en anti-kreft Agent
Etter viser at UGTs kan gjen uttrykt i melanom celler etter behandling med anti- kreft agenter, det åpenbare spørsmålet var om UGT aktivitet ble restaurert i tillegg. Derfor glukuronisering ble undersøkt ved hjelp av UGT-Glo-analysen i melanomcellelinjer som mangler UGT ekspresjon og i forhold til de samme cellelinjer etter behandlingen med epirubicin. Denne analysen anvender et UGT Multienzyme substrat som reagerer med luciferin deteksjonsreagensen for å gi lys som kan bli kvantifisert på et luminometer. Hvis imidlertid substratet glukuronideres da det ikke lenger vil reagere med luciferin deteksjonsreagensen for å gi lys. Således er to reaksjoner satt opp per prøve, en med ko-substrat UDPGA og den andre uten. Bare omsetningen med UDPGA vil produsere glukuronidert substratet dersom UGTs er tilstede og aktive. På denne måte kan den totale UGT aktivitet for prøven kan kvantifiseres ved forskjellen i emitterte lys mellom de to reaksjoner.
Først den primære melanom WM3211 celler ble kontrollert for UGT aktivitet. Cellene ble enten ubehandlet (FN) eller behandlet med epirubicin ved angitte konsentrasjoner. Cellene ble høstet 24 timer senere og analysert med hensyn på aktivitet UGT. Som vist i figur 4A, ble UGT aktivitet øket respons på epirubicin behandling sammenlignet med ubehandlede celler. Interessant nok var det noen basal glukuronidering aktivitet i de ubehandlede WM3211 celler som indikerer at UGTs er uttrykt i denne cellelinje, men på et nivå under påvisning av vår RT-PCR-eksperiment (figur 1D). Humanlevermikrosomer ble brukt som en positiv kontroll som de har svært høye konsentrasjoner av UGTs og det var ingen homogenat til stede i den negative kontrollen på kontoen for noen bakgrunnssignal. Lignende resultater ble observert når dette forsøk ble gjentatt for to metastatiske melanomcellelinjer, SKmel28 (figur 4B) og A375 (figur 4C). I begge disse cellelinjene UGT-aktiviteten ble økt dramatisk etter behandlingen med epirubicin. I motsetning til WM3211-celler, ei heller metastatisk cellelinjen viste UGT aktivitet i fravær av behandling. Igjen humane levermikrosomer ble anvendt som en positiv kontroll og den negative kontroll manglet cellehomogenat
Glukuronidering aktivitet ble undersøkt ved den UGT-Glo-analysen ved anvendelse av 50 ug av homogenat per reaksjon i tre melanomcellelinjer.; (A) WM3211 (B) SKmel28 og (C) A375 uten behandling og sammenlignet med behandlingen med epirubicin (EPI) ved de angitte konsentrasjoner i 24 timer. (-) Indikerer en negativ kontroll hvor ingen homogenat var til stede. (+) Indikerer bruk av humanlevermikrosomer (kjent for å ha høye konsentrasjoner av nesten alle UGT familiemedlemmer) som en positiv kontroll.
UGT2B7 knockdown sensitizes WM115 melanomceller til kreftmedisiner
for å finne den funksjonelle bidrag glukuronidering til melanom motstand, ble UGT2B7 slått ned i WM115 celler. shRNA rettet mot UGT2B7 ble stabilt transfektert inn WM115 celler. Denne cellelinjen ble kåret WM115-2B7KD. Real-time PCR ble deretter utført for å bekrefte at UGT2B7 mRNA nivåer hadde blitt redusert. Figur 5A viser tydelig at UGT2B7 mRNA-nivåer i WM115-2B7KD cellelinjen var -60% mindre enn den for WM115 celler som er stabilt transfektert med tom vektor (WM115-PRS). Deretter halv maksimal hemming konsentrasjoner (IC
50), som bestemt ved MTT-analyser ble utført for å undersøke om knockdown av UGT2B7 sensibilisert WM115 celler til anti-cancer behandling. IC
50-verdier for WM115-2B7KD ble bestemt og sammenlignet med WM115-pRS (stabil cellelinje laget med tom vektor som kontroll) og den parentale cellelinje mot temozolomid, adriamycin og epirubicin. I overensstemmelse med en rolle for glukuronidering i melanom motstand, ble WM115-2B7KD funnet å ha en signifikant lavere (p 0,01) IC
50 verdi for adriamycin og epirubicin behandling, sammenlignet med både WM115 og WM115-pRS (figur 5B) som indikerer at, ja, knockdown av UGT2B7 sensitizes melanomceller til disse anti-kreft medikamenter. Ingen effekt på IC
50-verdier ble observert for temozolomid eller vemurafenib behandling på WM115-2B7KD cellelinje i forhold til de to kontrollcellelinjer (figur 5B).
(A) Real-time PCR av UGT2B7 mRNA nivåer sammenligne melanomcellelinjer stabilt uttrykker shRNA mot UGT2B7 (WM115-2B7KD) eller tom vektor (WM115-pRS). (B) IC
50 verdiene bestemt fra MTT analyser vurdere bidraget av UGT2B7 til melanom motstand etter behandling av temozolomid, adriamycin, epirubicin eller vemurafeninb. (C) IC
50 verdiene bestemt fra MTT-analyser som vurderer følsomheten melanoma cellelinjer med (WM115) og uten (WM3211) UGT uttrykk for anti-kreft legemidler som metaboliseres via UGTs. Alle data grafene er gjennomsnittet av minst tre uavhengige eksperimenter analysert ved hjelp av GraphPad Prism. Feilfelt representerer standardavvik og * indikerer signifikans p. 0,01 sammenlignet med enten kontroll
Hvis banket ned en UGT av -60% sensibilisert melanomceller til adriamycin og epirubicin så det står til grunn at IC
50 for WM3211 melanom-celler (som mangler ekspresjon UGT) vil være vesentlig mindre enn WM115 parentale celler (som har UGT uttrykk). Dermed sammenlignet vi IC
50s for WM115 og WM3211 direkte for disse stoffene. Som spådd, WM3211 celler var 7 ganger og ni ganger mer følsom for adriamycin og epirubicin, henholdsvis (figur 5C).
Diskusjoner
Rollen UGTs i melanom etiologi ikke hadde blitt undersøkt tidligere til tross for UGTs være en stor klaring mekanisme for anti-kreft agenter. I denne studien UGT2B7, ble UGT2B10 og UGT2B15 identifisert som normalt uttrykt i humane melanocytter. De samme tre UGTs ble funnet å bli uttrykt i den primære melanomcellelinje WM115. Det ble imidlertid ikke UGT ekspresjon detektert i et annet primært melanom-cellelinje, WM3211, eller i en hvilken som helst av de tre metastatiske melanomcellelinjer undersøkt som indikerer at UGT uttrykk er tapt under melanom progresjon. Interessant vi vise at UGT2B7, UGT2B10 og UGT2B15 kan bli re-uttrykkes i melanomceller i respons til anti-kreftmidler. Den tilsvarende økningen i UGT aktivitet ble også påvist etter behandling. Dermed gjen uttrykk for UGTs ville antagelig beskytter kreftcellene mot anti-kreft narkotika gjennom økt metabolisme og påfølgende klarering. Viktigere, disse observasjonene var konsekvent i begge B-Raf vill typen melanom celler (WM3211) og B-Raf mutantcellelinjer (A375 og SKmel28).
Dessverre har ingen kommersielt tilgjengelig antistoff er vist å oppdage endogen UGT2B protein og følgelig våre forsøk på å visualisere endogent UGT2B protein var mislykket. Dette er mest sannsynlig på grunn av det faktum at UGTs er membranbundne, uløselige proteiner. Følgelig har ingen full lengde human UGT blitt renset og /eller krystallisert. Faktisk er den eneste krystallstruktur rapportert for et humant UGT den C-terminale halvdel av UGT2B7 siden den N-terminale halvdel måtte klippes av for å oppløseliggjøre proteinet [32]. De aller fleste av publiserte UGT western er cellelinjer (vanligvis insekt) som er overekspresjon rekombinante UGTs. Videre demonstrerer en nylig rapport klart at en stor andel av disse overuttrykt, rekombinante UGTs er inaktive [33]. Man kan lett forestille seg at de rekombinante UGT proteiner som er synlige på westernfilmer er ikke helt modne, aktive enzymer. Motsatt kan fullt modne, aktive UGTs ikke være synlig på western selv når overexpressed. Således, i samsvar med flere tidligere publikasjoner i UGT felt, den foreliggende studien fokusert på mRNA-ekspresjon av de UGT2B familiemedlemmer kombinert med analyse av UGT aktivitet. Vi utnyttet RNA interferens og glukuronideringsprosessen analyser for å undersøke rollen til UGT2B7 på melanomcelleoverlevelse [1], [3], [24], [34], [35], [36], [37].
for å teste hvilken rolle glukuronidering i melanom resistens direkte, ble UGT2B7 slått ned i WM115 celler, den eneste melanoma cellelinje vi har identifisert med UGT uttrykk så langt. Knockdown av UGT2B7 sensibilisert melanomceller til epirubicin og adriamycin behandling, men hadde ingen effekt på temozolomid eller vemurafenib behandling. Disse resultatene gir bevis på prinsippet om at glukuronidering er involvert i melanom resistens
in vitro
. Den mest logiske forutsetningen er at UGT2B7 glucuronidates epirubicin og adriamycin metabolitter direkte resulterer i sin klarering før disse stoffene kan utøve sin giftighet. Dette er konsistent med tidligere rapporter som epirubicin er primært metaboliseres av UGT2B7 [31] og at glukuronidering er også involvert i adriamycin clearance [30]. Observasjonen at toksisiteten av temozolomid og vemurafenib var uendret etter UGT2B7 knockdown var ikke fullstendig uventet ettersom UGTs aldri har vært implisert i metabolismen av disse stoffene.
Det er viktig å merke seg at disse forsøk ble utført ved anvendelse av en UGT2B7 slå ned cellelinje, og dermed var det fortsatt noen UGT2B7 stede. Videre UGT2B10 og UGT2B15 er fortsatt til stede.
