Abstract
Bakgrunn
microRNAs (mirnas) er korte enkle strandede kodende RNA som undertrykke genekspresjon gjennom enten translasjonsforskning undertrykkelse eller nedbrytning av målet mRNA. Den gløding mellom messenger RNA og 5 «frø region av mirnas antas å være avgjørende for den spesifikke suppresjon av mål-genekspresjon. Man miRNA kan ha flere hundre forskjellige mål i en celle. Raskt akkumulere bevis tyder på at mange mirnas er involvert i cellesyklus regulering og consequentially spiller avgjørende roller i kreftutvikling.
Metodikk /hovedfunnene
Innføring av syntetisk Mir-107 eller MIR-185 trykt vekst menneske ikke-småcellet lungekreft cellelinjer. Flowcytometri analyse avdekket disse mirnas indusere en G1 cellesyklus arrest i H1299 celler og undertrykkelse av cellesyklusprogresjon er sterkere enn at ved å la 7 miRNA. Ved genekspresjon analyser med oligonukleotid-mikromatriser, finner vi hundrevis av gener påvirkes av transfeksjon av disse miRNAs. Ved hjelp av miRNA-target prediksjon analyser og tabelldata, vi listet opp et sett av sannsynlige mål av MIR-107 og MIR-185 for G1 cellesyklus arrest og validere en undergruppe av dem ved hjelp av real-time RT-PCR og immunoblotting for CDK6.
Konklusjon /Betydning
Vi identifiserte ny cellesyklus regulering mirnas, MIR-107 og MIR-185, lokalisert i hyppig endrede kromosom regioner i humane lungekrefttilfellene. Spesielt for MIR-107, er et stort antall nedregulert gener merket med genet ontologi begrepet «cellesyklus». Våre resultater tyder på at disse mirnas kan bidra til å regulere cellesyklus i humane ondartede svulster
Citation. Takahashi Y, Forrest ARR, Maeno E, Hashimoto T, Daub CO, Yasuda J (2009) MiR-107 og MiR -185 kan indusere cellesyklus arrest i human ikke småcellet lungekreft cellelinjer. PLoS ONE 4 (8): e6677. doi: 10,1371 /journal.pone.0006677
Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 24 juni 2009; Godkjent: 17 juli 2009; Publisert: 18 august 2009
Copyright: © 2009 Takahashi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av stipend for Riken omics Science Center fra MEXT til Yoshihide Hayashizaki, Grant for Riken Frontier forskningssystemet, Functional RNA forskningsprogram til YH og Grant-i-aid for Scientific Research til J.Y. ARRF er støttet av en CJ Martin Fellowship fra den australske NHMRC (ID 428261). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
mirnas er 19-23-base lange enkeltrådet RNA som spiller avgjørende roller i biologiske prosesser [1]. Nukleotidsekvensene mirnas ofte evolutionally konservert blant flercellede organismer [2]. De mirnas er uttrykt som hårnål formet dobbeltkjedet pre-mirnas og sekvensiell behandling av forskjellige RNase III enzymer, drosha og dicer, genererer moden miRNA [3] sikret moden miRNA bindes med et sett av proteiner, omfattende Agonaute, for å danne en miRNA indusert stanse kompleks (miRISC). Den miRISC antas å lage et kompleks med mål messenger RNA og post-transkripsjonelt undertrykker ekspresjon av målgener. Virkningsmekanismen av miRISC er fremdeles kontroversiell [4], men det er generell enighet om at flertallet av mål messenger RNA har bindingsseter for mirnas i den 3 «ikke-translaterte regioner. Fra andre til åttende baser av 5 «enden sekvens av miRNA kalles frø sekvens og antas å være avgjørende for anerkjennelse av de mål messenger RNA av mirnas.
Det har blitt tydelig at noen mirnas spiller avgjørende roller i regulering cellesyklus i samarbeid med onkogener eller tumorsuppressorgener (se anmeldelse [5], [6]). Et eksempel på cellesyklus regulering miRNA er
la-7 plakater (for
HSA-la-7a
, MIMAT0000062). Innføringen av syntetisk pre-la-7 får cellesyklus-stans i lungekreftceller [7]. Mange mirnas er kjent for å nedregulere cellesyklusrelaterte gener. Mir-17~92 klynge ble identifisert som nedstrøms for
MYC
onkogen [8] og downregulate E2F transkripsjonsfaktorer som er kjente formidlere av cellecyklusprogresjonen [9] .En annen viktig svulst relatert genet,
TP53
, indusere ekspresjon av MIR-34 familiemedlemmer og overekspresjon av MIR-34 forårsaket cellesyklus arrest i G1 fasen [10] – [16]
Her er vi rapportere. potensiell cellesyklus regulering mirnas under søket av kreftrelaterte miRNAs i humane lungekreftceller. I denne studien gjengir vi et sett av genomiske regioner identifisert av Zhao
et al
. som forsterkes eller slettes i humane lungekrefttilfellene [17]. I løpet av studien, fant vi at
MIR-107 plakater (MIMAT0000104) og
Mir-185
(MIMAT0000455) undertrykke spredning i lunge adenokarsinom cellelinjer og induserer cellesyklus arrest i G1 fasen av cellesyklusen. Vi forsøkte å karakter nedstrøms mål messenger RNA av disse mirnas ved bruk av microarray profilering med genet ontologi analyser og TargetScan spådommer [18].
Resultater
Uttrykk av MIR-31, 107, og 185 i menneskelig vev samling inkludert lungekreft vev og cellelinjer
fra regionene identifisert av Zhao
et al
. [17], fant vi 13 og 26 kommenterte mirnas i homozygously slettede og forsterkede regionene henholdsvis (tilleggs tabell S1). Fordi mange av kreftrelaterte gener bidrar til malign transformasjon i bredt spekter av celletyper, prioriteres vi mirnas som har vært innblandet i andre voksen-angrep kreft hos mennesker. Så vi valgte tre mirnas: Mir-107, MIR-185, og MIR-31 (MIMAT0000089) [19] – [22]. Vi har lagt den la-7a for cellevekst og cellesykluskontroll fordi miRNA kan undertrykke cellevekst i lungekreft cellelinjer [23] og induserer cellesyklus arrest i HepG2 cellelinje [7].
Bruk Taq-Man kvantitativ RT-PCR-teknologi, målte vi uttrykket av de fire mirnas i den humane lungekreft-cellelinjer A549 og H1299 og på tvers av et panel av kommersielt tilgjengelig RNA fra normale vev og lungekreft prøver (fig. 1). De fleste av de mirnas viste relativt allestedsnærværende ekspresjon hos friske vev (Fig. 1). Det er interessant at ekspresjon av de analyserte mirnas (MIR-107, 185, og la-7a) var lavere i lungetumor og cancercellelinjer lunge enn i normal lunge. Mir-31 ble sterkt uttrykt i lungekreftcellelinjer.
miRNA uttrykk nivåer ble målt ved miRNA TaqMan QRT-PCR i normal lunge, hjerne, hypofyse, lever og eggstokk vev, en lunge svulst prøve og også i lungetumorcellelinjer, H1299 og A549. Den vertikale aksen viser den relative uttrykk for hver miRNA normalisert med at av RNU44.
Vekst undertrykkelse og cellesyklus arrest av over-uttrykk for kandidat miRNAs i menneskelig lungekreftcellelinjer
effekten av disse mirnas på proliferasjon ble undersøkt ved MTT-analyse med forhånds miRNA transfektert H1299 og A549-celler. Transfeksjon av HSA-MIR-107 og HSA-MIR-185 dramatisk redusert celleproliferasjon i begge cellelinjer (Fig. 2). I tilfelle av H1299-celler, viste de la-7a miRNA betydelig redusert proliferasjon mens effekten var mindre tydelig i A549-celler. Graden av veksthemming av A549 ved la-7a er lik den som er rapportert av [7]. Mir-31 viste svak undertrykkelse av cellevekst, men undertrykkelsen nivåene var ikke statistisk signifikant på mange tidspunkter for begge cellene (fig. 2).
Vekst undertrykkelse effekten av miRNA kandidat transfections på H1299 (venstre panel) og A549 (høyre panel) som målt ved MTT-analyse. Den vertikale aksen viser den relative forholdet mellom A450 nm: som dag 0 i hver celle som 1. Merk MIR-107 og MIR-185 undertrykker spredning i begge cellelinjene
DNA innholdsanalyse av. strømningscytometri viste transfeksjon av hSA-MIR-107 og hSA-MIR-185 induserte en signifikant økning i prosentandelen av celler i G1 fasen av cellesyklusen, til samme nivå som en la-7a kontroll, mens en kodet negativ kontroll ikke gjorde (fig. 3). Vi observerte ikke heller noen tilsynelatende økning av under G1 befolkningen i flowcytometri eller eventuelle apoptose-relaterte morfologiske endringer, slik som kjernefysiske blebbing og kondensasjon, under fasekontrastmikroskop (data ikke vist). Dette tyder på at veksthemming indusert av HSA-MIR-107 og HSA-MIR-185 transfeksjon ble forårsaket av induksjon av G1 arrest i stedet for apoptose.
Histograms av DNA-innholdet oppnådd ved FACS analysen er vist. Prosentandelene av hver cellesyklusstadier er vist i den innfelte av histogrammene. Det var ingen gate brukes til begivenhetene, slik at det var ingen åpen akkumulering av sub-G1 populasjoner i alle forsøkene.
Identifikasjon av kandidat målet mRNA av mirnas av genet profilering analyse
Den microarray profilering ble gjort for å bestemme de globale endringer i mRNA uttrykk nivåer i H1299 celler transfektert med vekst undertrykkende mirnas sammenlignet med en negativ kontroll. I HSA-MIR-107, HSA-MIR-185 og HSA-la-7A transfekterte celler var det 561, 646 og 812 transkripsjoner nedregulert og 608, 698 og 949 oppregulert med 1,5 ganger eller større, henholdsvis. Gene ontologi analyse ble utført på genene nedregulert i transfectans. Tabell 1 viser de mest betydelig beriket GO vilkår for nedregulert gener med hvert miRNA. De fem beste betingelsene i genene nedregulert av HSA-MIR-107 var alle cellesyklusen relaterte (tabell 1). Nedregulert gener med la-7a var hovedsakelig involvert i rRNA metabolisme, ribosom biogenese, og den M-fasen av cellesyklusen. Endelig nedregulert gener med HSA-MIR-185 viste ingen berikelse for cellesyklus beslektede begreper, i stedet for vilkår knyttet til utvikling og differensiering var fremtredende. I tillegg er de 127 og 33 gener som vanligvis ned-regulert og oppregulert på henholdsvis av begge mirnas viste ingen gen ontologispråk anrikninger, noe som tyder på at disse mirnas induserer cellesyklusrest med forskjellige signalveier (tabeller 2, 3 og data ikke vist).
Vi sammenlignet miRNA målet spådommer med TargetScan programvare [18] for disse mirnas til genene nedregulert i vår uttrykk profilering datasett. For både bevart og ikke-konserverte områder, fant vi median ganger endring av predikerte mål var gjennomgående lavere enn for alle gener påvist i arrays (Fig. 4). Det er en trend for sterkere spådd mål å være mer down-regulert enn svake spådd mål. Tilsvarende konserverte mål pleier å være flere nedregulert enn alle spådd mål (Fig. 4).
Target skanne spådommer ble hentet for mirnas 185, 107 og let7a. Median uttrykk signal vises bare for gener anses som registreres av Agilent programvare. Y-aksen viser medianen ganger endring for sett med predikerte mikroRNA målgener ved forskjellige terskler, sammenlignet med alle gener på microarray (vist i sort). I alle tilfeller var median signal av forutsagte mål er lavere enn det som ble observert når alle probene anvendes. Når forsøket er utvidet til tre dager, ser vi mindre av en effekt, noe som tyder på direkte mål er mer berørt i løpet av første dagen.
Vi matchet så disse data spådd mål å genene ned- regulert mer enn 0,75 ganger på RNA nivå for å innskrenke potensielle mål for disse miRNAs. Vi fant mange av disse potensielle mål ble merket med begrepene «cellesyklus» i Entrez Gene kommentarer (tabell 2) som tyder på at disse tre mirnas kan direkte regulere cellesyklus progresjon gjennom disse genene. Interessant, i vårt side, la-7 ikke undertrykke ekspresjonen av CDK6 (NM_001145306) mRNA, som undertrykkes ved overekspresjon av la-7 i den tidligere studie [7]. Tabell 3 viser at forskjellige sett med kjente onkogener er nedregulert av disse mirnas.
Fra disse listene og annen liste som beskriver kandidatens miRNA mål kommenterte med begrepene cellesyklusen, lungekreft, onkogen eller tumor suppressor i Entrez Gene kommentarer ( supplerende tabell S2), valgte vi en undergruppe av transkripsjoner for validering av QRT-PCR ved sammenligning med de aktuelle listene som tilbys av TargetScan [18] og PicTar [24] programvare (fig. 5A). For MIR-107, bekreftet vi mRNA nedregulering av
CCNE1 plakater (NM_001238),
CDK6
,
CDCA4 plakater (NM_017955.3),
RAB1B
(NM_030981.2) og
CRKL plakater (NM_005207.3), og for MIR-185, bekreftet vi nedregulering av
CCNE1
,
CDK6
,
akt1 product: (NM_001014431.1),
HMGA2 plakater (NM_003483.4) og
CORO2B plakater (NM_006091.3) (fig. 5B). Vi merker oss at både MIR-107 og MIR-185 transfeksjon skyldes nedregulering av cyclin E1 (CCNE1) og cyklinavhengig kinase 6 (CDK6) mRNA-nivåer, selv om undertrykkelse nivået av CDK6 ved mir-185 er beskjeden (fig. 5B). Vi deretter bekreftet av western blotting som CDK6 protein nivåer er også nedregulert av MIR-107, mens CDK6 uttrykk var relativt uendret ved MIR-185 (Fig. 5C). På grunn av at undertrykkelse nivået av CDK6 mRNA ekspresjon ved MIR-185 er meget beskjedne, kan den etterfølgende reduksjon av CDK6 protein ekspresjon ved observasjonspunktet (24 timer etter transfeksjon) være for lite til å bli observert de konvensjonelle immunoblottings.
A) representant nukleotidsekvens kamper mellom mulige målgener og miRNAs. Tallene i parentes indikerer posisjonene til mål-nukleotider fra stoppkodonet. Bare matchet nukleotider med miRNA frø sekvenser er angitt med de vertikale linjene. B) Den kvantitative RT-PCR-analyser av potensielle mål av MIR-107 (CCNE1, CDK6, CDCA4, RAB1B og CRKL) og Mir-185 (CCNE1, CDK6, akt1, HMGA2, CORO2B) vises. Den vertikale aksen viser den relative uttrykk forholdet av hvert gen normalisert med det av GAPDH. C) Western Blot viser nedregulering av CDK6 protein av MIR-107.
Diskusjoner
Vi har skjedd for å finne at MIR-107 og MIR-185 kan undertrykke celleproliferasjon i to lungecancercellelinjer og induserte en G1 arrest av cellesyklusen. Graden av veksthemming av disse mirnas er lik den som er av svulsten undertrykkende miRNA, la-7. Genuttrykk profilering analyse med transfeksjon av disse miRNAs indikerte at bare MIR-107 viste betydelig berikelse av cellesyklus regulatorer for nedstrøms effektorer. På den annen side, MIR-185 ikke i vesentlig grad undertrykke cellesyklusregulator samt la-7, en kjent cellesyklusregulerende miRNA [6]. Mir-185, men kan undertrykke mRNA uttrykk av cellesyklusen regulere gener som CDK6 og akt1.
De vanligvis regulert gensettene av alle tre vekst undertrykkende mirnas er ikke så mange og ikke så sterkt knyttet til cellesyklusregulering (tabell 2). Disse resultatene antydet at de tre mirnas regulere forskjellige cellulære signalveier. Siden miRNA har et bredt spekter av mål i en celle (dvs. mindre spesifikk), og siden graden av undertrykkelse av målet ekspresjon ved miRNA er vanligvis moderat, bør funksjonen av mirnas betraktes som «fininnstilling» av genekspresjon i mammalsk celler [25]. Akkumuleringen av disse små regulerende effekter kan føre til betydelige biologiske reaksjoner i cellene [5] .På den annen side, et par mulige mål-molekyler som CCNE1 og CDK6, kan være avgjørende for cellesyklusregulering av disse mirnas. For eksempel reduksjon av CCNE1 med siRNA forårsaker cellesyklus arrest i leverkreft cellelinjer [26]. I tilfelle av CDK6, reduksjon av CDK6 ved siRNA som skyldes langvarig S-fase i humane embryonale stamceller [27]. Generelt betydningen av miRNA i cellesyklusregulering er ganske rimelig fordi mirnas er ment å være viktige molekyler for induksjon av celledifferensiering, som følger med cellesyklus arrest i mange tilfeller.
Når det gjelder MIR-107 støtter andre bevis en rolle for denne miRNA i G1 arrest og veksthemming. MIR-107 aksjer 7 av de 8 baser av sine frø sekvens med MIR-16 familien av miRNAs, som induserer G1 arrest ved å målrette flere cykliner og cellesyklus regulatorer, inkludert CDK6 som vi bekreftet som en MIR-107 mål [28]. Videre, en tidligere studie fant at syntetiske hemmere for MIR-107 økning spredning av A549 celler, men ikke påvirke HeLa-celler [29] tyder på MIR-107 kan faktisk spille en bestemt rolle lunge i å redusere spredning. Interessant, MIR-107 viste overexpressions i bukspyttkjertel kreft tyder dette miRNA har noen positiv rolle i bukspyttkjertelen kreftutvikling [21]. På den annen side, under fremstillingen av dette manuskriptet, Lee et al. rapportert at demetylering og deacetylering behandlinger til menneskebukspyttkjertelkreft cellelinjer indusert overekspresjon av MIR-107 og overekspresjon av MIR-107 trykt cellevekst og uttrykk for CDK6 i den menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer [30]. Den sistnevnte studien er kompatibel våre data i form av CDK6 som en kandidat nedstrøms mål av MIR-107. Det er interessant om dette miRNA har noen spesifikke cellulære funksjoner i cellene i stedet for cellesyklusregulering. Safdar
et al
. antydet at MIR-107 har blitt indusert i utøvd mus quadriceps muskler [31]. Ifølge gjennomgangen av Wilfred et al., Mir-107 og dens paralog, MIR-103, kan fungere i reguleringen av cellenes stoffskifte [32]. Det kan være interessant mulighet for at disse mirnas regulere de grunnleggende cellulære funksjoner slik som metabolisme eller cellesyklusprogresjon i stedet for spesifisering av celledifferensiering.
Mekanismen av cellesyklus-stans ved MIR-185 er ikke klart. Antallet cellesyklus regulatorer i nedstrøms undertrykte genene er mye lavere ved MIR-185 enn ved MIR-107. En gruppe forskere foreslått at denne miRNA er overuttrykt i blærekreft [20]. I den andre papir, Choong rapportert at MIR-185 har sterk positiv korrelasjon til utseendet erytroid overflateantigener (CD71, CD36, og CD235a) i menneskelige navlestreng blod celler stimulert med vekstfaktorer og indusert erytropoide differensiering [33]. Generelt sett, induksjon av celledifferensiering vanligvis par med undertrykkelse av cellesyklusprogresjon. Tatt i betraktning de miRNA funksjoner i andre metazoans, mange av miRNAs induserbare med celledifferensiering kan ha noen cellesyklus undertrykkende funksjoner. Den miRNA bør ha andre biologiske funksjoner i ulike celletyper. Det er derfor interessant å undersøke om MIR-185 har noen differensierende funksjoner i lungekreftceller. Et annet viktig spørsmål er at MIR-185 viste vekst undertrykkende funksjoner (figurene 2, 3), og reduksjon av ekspresjon i lungekreftceller (figur 1), selv om den miRNA er lokalisert i en kromosomal region forsterkes i to lungecancercellelinjer ([17 ] og supplerende tabell S1). Disse resultatene er intuitiv. Det er imidlertid mulig at tumor-suppressorer kan lokaliseres i en region som viser kromosomal amplifikasjon i tumorceller. Et eksempel er en potensiell svulst undertrykkende gen,
GSDMA plakater (NM_178171.4) [34], er lokalisert i en kromosomal region forsterkes i magekreftceller [35]. Dette genet er nedregulert i de humane gastriske cancere, selv om genet viste forsterkning i tumorceller [35]. I tilfellet med den MIR-185, kan epigenetisk stanse av miRNA skje før den genamplifikasjon av kromosom 22q21.1 regionen. Videre undersøkelser klart behov for å ta opp disse spørsmålene grundig.
Til slutt, rapporterer vi at nye kandidat mirnas som kan regulere cellesyklusprogresjon i humane ikke-småcellet lungekreft cellelinjer. Det er fremdeles et åpent spørsmål hvorvidt noen som somatiske genetiske forandringer kan føre til undertrykkelse av disse mirnas i human lunge-kreft eller andre ondartede svulster. Ytterligere karakterisering av genomisk loci av disse miRNAs er nødvendig for å gjøre saken klar.
Metoder
Utvinning av miRNA posisjon
Annotated miRNA loci ble hentet fra områder av kromosom gevinst og tap identifisert av Zhao
et al
. [17] i et stort panel av humane lungekarsinomer ved hjelp av SNP matriser. De Hg16 koordinater ble konvertert til sin Hg18 hjelp ekvivalenter ved hjelp av UCSC Lift-over-verktøyet (https://genome.ucsc.edu).
Cellelinjer
humane lungekreftcellelinjer , H1299 og A549, ble kjøpt fra ATCC. Cellelinjene ble dyrket i DMEM inneholdende 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum, 100 ig /ml penicillin /streptomycin og 292 pg /ml L-glutamin (Invitrogen, Carlesbad, CA, USA).
RNA forberedelser og kvantifisering av RNA ved hjelp av real-time PCR
Hele sanntids PCR ble utført med StepOnePlus real~~POS=TRUNC PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) i fire eksemplarer. Total RNA ble ekstrahert fra H1299 og A549 celler med
mir
Vana miRNA isolasjon kit (Ambion, Austin, TX, USA). Totalt RNA av menneskelig vev ble kjøpt fra BioChain Institute, Inc. (Hayward, CA, USA; Katalog nummer: R1234152-50, R1235152-50, R1234035-50, R1234068-10, R1234149-50, R1234183-50). For kvantifisering av miRNAs, ble 100 ng av total RNA analysert med TaqMan mikroRNA Reverse Transcription (RT) Kit (Applied Biosystems) med RNU44 som lasting kontroll. For kvantifisering av mRNA, ble 500 ng av total RNA revers-transkribert ved hjelp av PrimeScript II RT Enzyme (Takara Bio, Inc., Shiga, Japan) og PCR ble utført med SYBR premix Ex Taq (Perfect Real Time: Takara Bio, Inc. ) med GAPDH som lasting kontroll. All the real-time PCR-analyse ble gjort i tre eksemplarer.
miRNA transfeksjon
Syntetisk pre-mirnas og uspesifikke negativ kontroll (miRIDIAN mikroRNA Mimic negativ kontroll # 1) ble kjøpt fra Dharmacon, Inc. (Lafayette, CO, USA). Pre-mirnas ble transfektert ved en sluttkonsentrasjon på 10 nM med Lipofectamine2000 (Invitrogen), og mediet forandret 24 timer etter transfeksjon.
Cellevekst måling
Celler ble sådd ut i 96-brønners plater og inkubert ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator. Cellelevedyktigheten ble bedømt ved MTT-assay ved å bruke Celletelling kit-8 (DOJINDO, Kumamoto, Japan), i henhold til produsentens protokoll. Etter 1 times inkubering med media inneholdende tetrazolium-forbindelse, ble absorbansen ved 450 nm registrert etter 0,1 sek med Arvo MX 1420 (Perkin Eimer, Waltham, MA, USA).
cellesyklusanalyse
Cellene ble høstet etter 72 timer og fiksert i 70% iskald etanol, og etterfulgt av RNase A behandling, farget med 50 ug /mL propidium jodid for DNA-analysering av innholdet av strømningscytometri-analyse på en FACS Calibur system (Becton Dickinson, Franklin, NJ, USA). Dataene ble samlet inn og behandlet ved hjelp av FlowJo FACS analyseprogramvare (Tre Star, Inc., Ashland, OR, USA).
Expression profilering ved hjelp av Agilent Gene uttrykk rekke
cRNA sonde ble generert fra total RNA (500 ng) med lav RNA Input lineær forsterkning Merking kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Cy3-merket cRNA (1,65 mikrogram) var så fragmentert og relative uttrykk ble målt ved hybridisering til 4 × 44K hele menneske oligo mikromatriser (Agilent). Feature Extraction ver. 9.1 programvare (Agilent) ble brukt til å analysere bildet av microarray. Microarray analyser ble utført i duplikat. Alle microarray data rapportert i manuskriptet er beskrevet i samsvar med MIAME retningslinjer og dataene har blitt deponert i CIBEX (senter for informasjonsteknologi Biology genekspresjon) database [36] ved senter for informasjonsteknologi biologi og DNA data Bank of Japan (DDBJ), National Institute of Genetics (Mishima, Japan). Sjonsnummer for datasettet er CBX79.
microarray og Gene ontologi analyse
Microarray data ble visualisert og normalisert ved hjelp Genespring GX 7.3 programvare (Agilent). Verdier under 0,01 ble satt til 0,01. For hver brikke hver måling ble delt på 50-persentilen av alle målinger for at chip. Da for hver probe ble målingene normalisert til de negative kontrollmålinger. På grunn av begrensning av ressursene, statistikken
p
-verdi kan ikke være gjeldende kriterier for genet utvalg av våre datasett. Derfor, for genet ontology analyse, ble differensielt uttrykte gener er definert som ≥1.5 brette opp eller ned i forhold til den negative kontroll på den tilsvarende dag. Gene ontologi sikt berikelse i opp og ned regulert gensettene vurdert ved hjelp av GOstat web verktøy [37]. Den GOstat web verktøyet gir en p-verdi på om genet listen som er betydelig anriket for gener merket med en bestemt Gene ontologi. Dette beregnes basert på hvor mange gener i genet settet er merket med den gitte ontologi, og hvor mange gener på hele microarray (bakgrunnen) er merket med samme ontologi. Vi definert bakgrunnen som sett av gener påvist i minst én av de array-forsøkene.
Antistoffer og immunblotting analyse
Antistoffer mot α-tubulin (Sigma) og CDK6 (i Santa Cruz- Bioteknologi, Santa-Cruz, CA) ble brukt. Dyrkede celler (5,0 x 105 celler /brønn) ble dyrket på seks-brønns plate brønner og transfektert med miRNAs. 24 timer etter transfeksjon ble cellene lysert og underkastet SDS-polyakrylamid gelelektroforese. De separerte proteinene ble overført til Immobilon membran (Millipore, Billerica, MA) ved elektro. Immunkomplekser ble oppdaget av forsterket kjemiluminescens (Perkin Elmer) og visualisert med LAS 3000 image analysator (Fuji film, Tokyo, Japan).
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
doi: 10,1371 /journal.pone.0006677.s001 plakater (0,03 MB XLS)
Tabell S2.
doi: 10,1371 /journal.pone.0006677.s002 plakater (0,27 MB XLS)
Takk
Vi takker Mses. Satomi Fujiwara, Asami Hirakiyama, og Kana Nakamura for deres teknisk assistanse.
