Abstract
Bakgrunn
Omfattende prostata spesifikt antigen screening for prostatakreft genererer et høyt antall av unødvendige biopsier og overbehandling på grunn av utilstrekkelig differensiering mellom lat og aggressive svulster. Vi antok at sædvæske er en robust kilde til romanen prostatakreft (PCA) biomarkører med potensial til å forbedre primærdiagnose på og å skille avansert fra indolent sykdom.
metodikk /hovedfunnene
I en åpen sak /kontroll studie 125 pasienter (70 PCA 21 benign prostata hyperplasi, 25 kronisk prostatitt, 9 friske kontroller) ble innrullert i 3 sentre. Biomarkør paneler a) For PCa diagnose (sammenligning av PCA pasienter versus godartede kontroller) og b) ved avansert sykdom (sammenligning av pasienter med post kirurgi Gleason score 7 versus Gleason score 7) ble søkt. Uavhengige kohorter ble brukt for proteomikk biomarkør oppdagelse og teste ytelsen til de identifiserte biomarkør profiler. Sædvæske ble profilert bruker kapillær elektroforese massespektrometri. Pre-analytisk stabilitet og analytisk presisjon av proteomet analysen ble bestemt. Support vektor maskin læring ble brukt for klassifisering. Trinnvis anvendelse av to biomarkør signaturer med 21 og 5 biomarkører gitt 83% sensitivitet og 67% spesifisitet for PCa deteksjon i en test sett av prøver. Et panel av 11 biomarkører for avansert sykdom diskriminert mellom pasienter med Gleason score 7 og orgel-begrenset ( pT3a) eller avansert (≥pT3a) sykdom med 80% sensitivitet og 82% spesifisitet i en foreløpig validering setting. Nyskapende profiler viste utmerket pre-analytisk stabilitet. Åtte biomarkører ble identifisert som fragmenter av N-acetyllactosaminide beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase, prostata syre fosfatase, stabilin-2, GTPase IMAP familiemedlem 6, semenogelin-1 og -2. Begrenset utvalgsstørrelsen var stor begrensning av studien.
Konklusjon /Betydning
Seminal plasma representerer en robust kilde til potensielle peptid stakere for primær PCa diagnose. Våre funn tilsier ytterligere potensiell validering for å bekrefte den diagnostiske potensialet identifisert bryt biomarkør kandidater
Citation. Neuhaus J, Schiffer E, von Wilcke P, Bauer HW, Leung H, Siwy J et al. (2013) sædvæske som en kilde til prostatakreft Peptide biomarkør Kandidater for deteksjon av Indolent og avansert sykdom. PLoS ONE 8 (6): e67514. doi: 10,1371 /journal.pone.0067514
Redaktør: Antonia Vlahou, Biomedical Research Foundation, Academy of Athens, Hellas
mottatt: 24 september 2012; Godkjent: 23 mai 2013; Publisert: 24 juni 2013
Copyright: © 2013 Neuhaus et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble finansiert delvis av det tyske departementet for økonomi og Technolgy BMWi med stipend No. KF0362802MD8 til JUS, JN, PW, ES, JS og gi No. EP110141 til ES og JS. Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. ES og JS er ansatte i Mosaiques Diagnostics GmbH. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den andre hyppigst diagnostisert cancer og den sjette ledende årsak til død kreft hos menn over hele verden [1]. Innføringen av serum prostata spesifikt antigen (PSA) screening førte til en betydelig økning i antall diagnostiserte tilfeller [2], men kunne ikke demonstrere en statistisk signifikant prostatakreft dødelighet nytte [3]. Ninety-fem prosent av menn med PSA-påvist kreft som blir fulgt i 12 år ikke dø fra PCA selv i fravær av bestemt behandling, for eksempel radikal prostatektomi, strålebehandling eller hormonbehandling [3].
Dette har betydelig overdrevet vår nåværende manglende evne til å gjøre kunnskapsbaserte anbefalinger om behandling valg i henhold til tumor atferd, nemlig klinisk ubetydelig, eller lat sykdom og klinisk signifikant, eller avansert sykdom [4]. Derfor er nye screening modaliteter sterkt behov for å redusere antallet menn som krever biopsi og å forbedre diskriminerende nøyaktighet mellom lat svulst som har en gunstig klinisk prognose selv uten innblanding, og sykdom som er sannsynlig å ha allerede klinisk avansert, for å redusere over-diagnose og overbehandling.
proteomikk biomarkør screening har blitt populært i løpet av det siste tiåret. Blod, urin, prostata- fluider, og prostatisk vev er blitt evaluert som biomarkør kilde. En rekke kandidat biomarkører som finnes i disse studiene ble innført som biomarkører i et forsøk på å løse de kliniske behov for diskriminering av lat og fremskreden sykdom [5] – [7]. Men alle enkelt biomarkører for tiden tilgjengelig, mangler diagnostisk nøyaktighet for rutinemessig klinisk anvendelse. Den høye biologiske variasjoner av prostatakreft antyder at en tydelig klart definert sett av biomarkører, snarere enn en enkelt biomarkør, kan det være mer effektivt å nøyaktig vurdere sykdommen. Nye tekniske fremskritt, spesielt i massespektrometri og beregning, tillate bruk av proteomikk profilering for oppdagelsen av flere protein biomarkør.
Nylig har vi identifisert og validert en proteomikk mønster av 12 naturlig forekommende, urin peptid biomarkører ved kapillær elektroforese masse spektrometri (CE-MS), i stand til å påvise ved hjelp av PCa første strøm urinen med 90% sensitivitet og 61% spesifisitet [8], [9]. Disse eksperimenter antyder at prostata- væsker kan tjene som kilde av biomarkører [10]. På basis av disse funnene, hypotese vi at sædvæske kan tilby en robust kilde for å identifisere nye PCA protein maker profiler. Denne studien tar sikte på en systematisk vurdering av pre-analytiske sædvæske stabilitet og dets egnethet for utvikling av PCA biomarkør paneler.
Resultater
Pasient klinisk utfall
I totalt 70 pasienter med PCA ble 21 pasienter med benign prostata hyperplasi (BPH), 25 pasienter med kronisk prostatitt (CP) og ni friske kontrollgruppen (HC) inkludert i studien (tabell 1 og figur 1). CP og HC gruppene var betydelig yngre enn pasientene i PCA og benign prostatahyperplasi (BPH) grupper (tabell 1). Som forventet PSA-nivåene var signifikant lavere i CP og HC i forhold til BPH (0,98 til 6,70 ng /ml) eller PCa (2,0 til 20 ng /ml) i begge, trening og testsett (p 0,05, Mann-Whitney-test, to- tailed, tabell 1). Den TNM-klassifikasjon avslørte 60 organ begrenset (≤pT2c) og 10 avansert (≥pT3a) PCa. Fordelingen av pasienter til lave og høye risikogruppene varierte betydelig mellom klassifiseringssystemer (tabell 1).
For biomarkører i totalt 125 brytende plasmaprøver ble brukt fra 70 pasienter med PCA 21 pasienter med benign prostata hyperplasi ( BPH), 25 pasienter med kronisk prostatitt (CP) og 9 frisk kontroll (HC). Dette bassenget av tilgjengelige prøver ble anvendt i varierende sammensetning i tre studiearmer. I studie A «diagnostiske markører» 50/125 pasienter med og uten prostatakreft (22 PCA 14 CP, 9 BPH og 5 HC) ble brukt for biomarkører og de resterende 75/125 pasienter (48 PCA, 12 BPH, 11 CP og 4HC) ble anvendt for diagnostiske ytelsestester. I studie B «Advanced Disease Markers» tilgjengelige PCA prøver (n = 70) ble stratifisert etter Gleason score. For biomarkører pasienter med Gleason score 7 (n = 21) og Gleason score 7 (n = 16) ble sammenlignet. De resterende 33/70 pasienter med Gleason score 7 (28 lat sykdom pT3a og 5 ≥pT3a avansert sykdom i henhold EUA retningslinjer) ble brukt for å teste klinisk ytelse. Videre i studien C foreløpig vurdering av stabilitet og presisjon av innflygingen ble utført.
proteomikk profiler
CE-MS analyse overgitt høyoppløselige profiler (figur 2, tabell S1). For foreløpige profilen kalibrering vi brukte syntetiske isotopen merket peptider som referanse. Denne pre-kalibrering tillatt definisjon av 287 «hus-holde peptider» som referanse masse og migrasjon tidsdatapunkter. Som ion signalintensitet (amplitude) viste signifikant variabilitet, ble signalene fra 46 meget tallrike peptider anvendt som intern standard peptider for signal normalisering (tabell S2). Disse peptidene var tilstede i 97% av analyserte prøver og viste lavest signal variabilitet. Fremgangsmåten for å bruke «intern standard» for amplitude normalisering, viste seg å være en enkel og pålitelig metode for å håndtere både analytiske og utvannings avvik i en enkelt kalibreringstrinn [11]. Tandem massespektrometri [12] – [14] identifisert 141 innfødte nyskapende peptider som representerer 47 ulike foreldre proteiner (Tabell S3). Åtti-åtte identifiserte peptider (83/141, 59%) var fragmenter av semenogelin-1 eller -2, langt den mest tallrike peptider av lav molekylvekt bryt proteomet.
Capillary elektroforese koblet til massespektrometri profilering av human sædvæske avdekket totalt 1784 peptider. De syntetiske peptider delte, til prøvene for pre-kalibreringsformål er merket med hvite piler. Normalisert molekylvekt (700 til 25,000 Da) i logaritmisk skala er plottet mot normalisert migrasjon tid (15-45 min). Den midlere signalintensiteten av polypeptidet topp er gitt i 3D-avbildning. Kompilerte datasett av PCa (case) kombinert alle kontroller og også separat CP (kontroll), BPH (kontroll) og HC (kontroll) fra treningssettet vises.
biomarkører
Studier A:. diagnostiske markører
For diagnostiske biomarkører vi delt de tilgjengelige 125 prøvene til et funn satt med 22 PCA 14 CP; 9 BPH og 5 HC prøver og de resterende 48 PCa, 12 BPH, 11 CP, og 4HC prøver inn i et uavhengig testsettet (figur 1). Multiple teststatistikk resulterte i 21 diskriminerende polypeptider signifikant endret mellom pasienter med og uten prostatakreft (tabell 2 og figur 3). Seks av de 21 polypeptider ble identifisert som fragmenter av N-acetyllactosaminide beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase, prostatisk sur fosfatase, semenogelin-1 og -2 (tabell 3). . For å definere biomarkør kandidater pålitelig skille PCa og BPH, sammenlignet vi BPH
vs
PCA, BPH
vs
CP . HC, og BPH
vs
PCa CP HC ved hjelp av egnede flere teststatistikken. Fem polypeptider var signifikant i alle tre testene tyder på egnetheten av disse kandidatene for å spesifikt identifisere BPH og dermed å utelukke nærværet av PCa (tabell 2, figur 3). En av dem var et fragment av GTPase IMAP familiemedlem 6 (tabell 3).
Normalisert molekylvekt (700 til 25,000 Da) i logaritmisk skala er plottet mot normalisert migrasjon tid (15-45 min). Den midlere signalintensiteten av polypeptidet topp er gitt i 3D-avbildning. Gjennomsnitt datasett av treningssettet vises
Vi brukte et to-trinns tilnærming. (I) en første panel (21 polypeptider, 21PP) for å skjelne PCa og BPH fra inflammatorisk og sunn prostata; (Ii) et andre panel (5-polypeptider, 5PP) for å skille PCa og BPH. Begge signaturer ble opplært i oppdagelsen kohort (figur 1) med støtte vektor maskin algoritmer (SVM) og nådde AUC på 100% (95% KI 93% -100%) for 21PP og 99% (95% KI 90% -99 %) for 5PP.
for bekreftelse av klassifisering utførelsen av biomarkør underskrifter vi brukt en kombinasjon av 21PP og 5PP til en uavhengig test sett 48 PCA 12 BPH, 11 CP, og 4HC (figur 1). Prøver positive for 21PP (over klassifiserings avskåret) ble omklassifisert bruker 5PP å spesifikt identifisere BPH unntatt PCa. Derfor, ble prøver som var positive for 21PP og negative for 5PP betraktes som PCa ble prøvene positive i begge paneler betraktes som BPH og prøver negative for 21PP (under klassifiseringen avskåret) ble betraktet som CP eller HC kontrollprøver. Denne tilnærmingen korrekt identifisert 40 av 48 PCA prøver [83% sensitivitet (95% KI 70% -93%)], 6 av 12 BPH og 12 av 15 kontroller [67% spesifisitet (95% KI 46% -83%)] . AUC-verdien var 75% (95% KI 64% -83%,
P
= 0,0001). Den observerte diagnostisk ytelse var så høyt som resultatene av PSA som referanse, som viste 87% sensitivitet (95% KI 75% -97%) og 59% spesifisitet (95% KI 40% -80%).
Study B: avanserte sykdoms biomarkører
For avansert sykdom biomarkører vi delt de tilgjengelige 70 PCA prøver i et treningssett med 37 PCA prøver (21 post-kirurgi Gleason scorer 7, 16 post-kirurgi Gleason scorer 7). De resterende 33 prøver med post-kirurgi Gleason score 7 ble brukt som testsett. Sammenligning av 21 GS 7 pasienter ( pT3a) til 16 GS 7 pasienter (11 pT3a, 5 pT3a) ved hjelp av statistikk korrigert for multippel testing resulterte i 11 biomarkør kandidater med et fragment av stabilin-2 blant dem (tabellene 2 og 3). Disse som mønster (11pp) ble funnet å klassifisere kohorten med en AUC på 99% (95% KI 87% -100%, figur 1).
For å teste resultatene av biomarkører forbundet med avansert sykdom, 11pp ble påført på testsett av pasienter med post-kirurgi Gleason ballen 7 som ikke er benyttet for biomarkører. Av de 33 prøvene, 9 scoret så avansert (over klassifiserings avskåret) og 24 som lat tumor (under klassifiseringen avskåret).
I klinisk praksis ulike klassifiseringssystemer benyttes for å estimere risiko for prostatakreft progresjon . Derfor har vi sammenlignet resultatene av våre biomarkører til fem brukte systemer (tabell S4): 11pp resultater ble signifikant korrelert til TNM stadier [rho 0,423 (95% KI 0,093 til 0,669), P = 0,0142], EAU poengsum [rho 0,408 ( 95% KI 0,076 til 0,659), P = 0,0183], og NCCN poengsum [rho 0,365 (95% KI 0,024 til 0,629), P = 0,0370] (figur 4A-C), mens CAPRA, RTOG og D’Amico scorer ikke var korrelert (data ikke vist). Bruke EAU klassifisering som referansestandard, 11pp korrekt identifisert 4/5 avansert (≥pT3a) og 23/28 organ-begrenset ( pT3a) svulster, noe som resulterer i en AUC på 83% (95% KI 66% -94%,
P
= 0,0055, tosidig effekt β = 0,84, figur 5D). Følsomhet var 80% (95% KI 29% -97%) og spesifisitet var 82% (95% KI 63% -94%)].
(A) .Box og whisker plott av oppnådde 11pp resultater i testen kohort av PCA pasienter med GS 7 stratifisert etter TNM, (B) EAU, og (C) NCCN klassifiseringssystemer. Svarte firkantene viser median og værhår 1,5-ganger interkvartilt områder. Rang korrelasjonskoeffisienter som rho, respektive 95% CI og P-verdier er gitt ovenfor. (D) ROC-kurven (svarte linjer) for 11pp klassifisering av uavhengig validering kohort av PCA pasienter med GS 7 med enten lat (N = 28) eller avansert (N = 5) sykdom i henhold til EAU klassifisering som referansestandard. 95% konfidensintervall er plottet som stiplede linjer. Diagonal linje representerer tipper sannsynlighet med et areal under kurven på 0,5. 95% konfidensintervall (KI) vises som stiplede linjer.
(A) Et gjennomsnitt på 1887 ± 202 polypeptider ble påvist i hver av de 14 målingene som er lagret for ulike tider på RT. Gjennomsnittet er merket med en fet linje; Standardavviket er markert i grått. (B) Utover dette kvalitative vurderingen biomarkør underskrifter ble brukt på 14 stabilitet replikerer å innhente kvantitative data av tidsavhengig stabilitet sædvæske. For 21PP rangert korrelasjonsanalyse viste en signifikant reduksjon av SVM score over tid med Spearmans rho av -0,576 (95% KI -0,854 til -0,07, p = 0,0379). Regresjonsanalyse avduket en nedgang frekvensen av -0,05 a.u. (Mindre enn 2%) per time. 5PP og 11pp vises ingen signifikant tidsavhengighet. (C) Analytisk presisjon av de etablerte SVM classifiers ble bedømt ved å påføre den til 15 CE-MS datasett innhentet fra uavhengige replikater av en prøve av en 57 år gammel pasient med sterk BPH. Mener klasse score var 0,619 ± 0,07, 2,290 ± 0,81, og -1,239 ± 0,18 for 21PP, 5PP, og 11pp hhv. Variasjonskoeffisienter ble beregnet ved å dividere standardavvik av den observerte totale spekter av SVM score [uthevet i grått, 21PP fra -1,50 til 1,50 (3,0 AU), 5PP 4,50 til 3,0 (7,5 AU), og 11pp fra -1,50 til 1,50 (3,0 aU)]. Variasjonskoeffisienter var 2,2%, 10,8% og 6,1%, respektivt. Klassifisering cut offs er representert ved horisontale linjer. Boksene skildre middel og standardavvik som værhår
Study C:.. Vurdering av biomarkør stabilitet og reproduserbarhet
Seminal plasma demonstrert robust pre-analytisk stabilitet ved romtemperatur. De oppnådde profiler var svært lik uten massiv forsvinningen eller dannelse av degradert fragmenter. Et gjennomsnitt på 1887 ± 202 peptider (figur 5A) ble påvist i 14 replikater. Undersøkelse av 21PP i disse 14 replikat for å kvantifisere tidsavhengighet av stabilitet viste en signifikant reduksjon av SVM score over tid med Spearmans rho av -0,576 (95% CI -0,854 til -0,07, p = 0,0379, figur 5B). Regresjonsanalyse avduket en nedgang frekvensen av -0,05 a.u. (Mindre enn 2%) per time. 5PP og 11pp vises ingen signifikant tidsavhengighet. Analytisk presisjon av de etablerte SVM classifiers ble undersøkt i 15 uavhengige replikater. Mener klasse score var 0,619 ± 0,07, 2,290 ± 0,81, og -1,239 ± 0,18 resulterer i koeffisientene varianter av 2,2%, 10,8% og 6,1% for 21PP, 5PP, og 11pp, henholdsvis (figur 5C).
diskusjon
Vi antok at sædvæske er en robust kilde til nye PCA peptid maker profiler med potensial til å forbedre primærdiagnose av prostatakreft og å skille avansert fra indolent sykdom.
i kontrast til tidligere rapporter om proteomikk profilering av sædvæske hjelp tryptisk fordøyelse [15], brukte vi innfødte sædvæske for biomarkør proteomikk analyse. De viktigste fordelene med denne top-down tilnærming på naturlig forekommende peptider inkluderer muligheten til å direkte oppdage kombinasjoner av posttranslasjonelle modifikasjoner, sekvensvarianter, og nedbrytningsprodukter. Vi oppdaget nesten 2000 forskjellige nyskapende peptider ≤20 kDa. De var fragmenter av større foreldre proteiner, som ble delvis også oppdaget tidligere bruker tryptiske fordøyer. Men vår tilnærming også identifisere ennå ukjente nyskapende bestanddeler (tabell S3).
generasjon av disse naturlig forekommende peptider avhenger av proteolytiske flytendegjøring av ejakulere og resultater i flere proteolytiske fragmenter av banebrytende proteiner. Sykdom knyttet endringer i denne proteolytisk LNG-prosessen kan stå for vår observasjon at noen naturlig forekommende fragmenter viser signifikant endret nyskapende nivåer og andre av samme foreldre protein ikke. Derfor pre-analytisk stabilitet og analytisk reproduserbarhet er av største betydning for vellykket biomarkører og klinisk validering. En første milepæl i denne studien var å utvikle en enkel og reproduserbar prøvetakingsprosedyre i samsvar med den kliniske rutinemessig innstilling. Vi lot flytendegjøring for å nå en endelig stabil tilstand, dokumenteres med et konstant antall detekterbare polypeptider over tid (figur 5A), men kontrollert tid til å smake lagring ved -80 ° C for å være under 60 min for å unngå interferens med tidsavhengig biomarkør ustabilitet ved romtemperatur (figur 5B).
prøver av prostatavevet, blod, sædvæske, og urin med og uten prostata massasje for tiden intensivt analysert for potensielle biomarkører PCA [5], [6]. Mens vev er forventet å være proksimalt til opprinnelsen av sykdommen og å korrelere med høyest biomarkør konsentrasjoner, prøvetaking av vev er relatert til invasiv inngrep med alle risikoer og begrensninger. I motsetning til dette, særlig sædvæske og urin er lett tilgjengelige. Imidlertid er proteolytisk prosessering av økende betydning for utnyttelsen av markører fra bodyfluids. Våre foreløpige data på sædvæske stabilitet (figur 5A /B) ikke gi bevis for massiv post-sampling nedbrytning som i motsetning ble observert for blodserum [16] eller plasma [17]. Derfor sædvæske kan kombinere høy nærhet til prostatakjertelen som stedet der kreften bare overgås av direkte prostatavevet prøvetaking med utmerket stabilitet og tilgjengelighet av urin [18] – [21], noe som gjør det til en svært lovende kilde til potensielle PCA biomarkører.
Vi var i stand til å definere og validere robuste biomarkør signaturer for diagnostisering av PCa. Sensitiviteten av 83% (95% CI 70% -93%) for å diagnostisere PCa var meget sammenlignbare med de som er rapportert tidligere for CE-MS baserte urin biomarkør signaturer (sensitivitet 86% til 90%). Spesifisitet på 67% (95% KI 46% -83%) var litt bedre enn sine urin kolleger av 59% og 61%, henholdsvis [8], [9].
I tillegg oppdaget vi en banebrytende biomarkør signatur, som utmerker seg (
P
= 0,0055) hos pasienter med post-kirurgi Gleason score 7 med indolent ( pT3a) eller avansert (≥pT3a) sykdom med høy sensitivitet og spesifisitet på 80% og 82% hhv. Nåværende klinisk rutine å bruke serum PSA nivå og pre-kirurgi Gleason sum score for å identifisere avansert sykdom er fortsatt utilstrekkelig, som de fleste av screening oppdaget PCa har PSA nivåer mellom 4-10 ng /ml og moderate Gleason sum score til 6 og 7. Derfor disse biomarkører, som er basert på post-kirurgi utfallet data som referansestandard, kan representere en fremtidig mulighet for en ikke-invasiv pre-kirurgi differensiering av orgel begrenset og avanserte kreft stadier. I tillegg svulst evaluering av pre-kirurgi Gleason score gradering krever invasive prosedyrer for å skaffe vevsprøver, og er hemmet av betydelig inter-operatør variasjon og avvik mellom pre- og postoperative score i så mange som 35% av tilfellene [22] . Videre, blant pasienter med klinisk lokalisert sykdom (tumorstadier T1 og T2) er omtrent 30% funnet å ha lokalt avanserte tumorer følgende radikal kirurgi. Derfor er det en reell fare for underbehandling i denne gruppen av pasienter, hvis administrert av overvåking. I fremtiden vil det biomarkør profilen kan bidra til å unngå under-behandling i disse pasientene med klinisk uklare presentasjon.
En av de differensielt uttrykte proteiner ble seminale prostata sure fosfatase (ACPP), som er en negativ regulator av cellevekst i LNCaP celler [23]. Nedregulering av celle ACPP er forbundet med androgen-uavhengig tumorvekst og tumorigenisitet høy avanserte PCA karakterer [23].
Vi observerte semenogelin-1-fragment 316-344 (ID18990) som en av de 21 differensielt regulert polypeptider (tabell 2 og tabell 3). Selv om dette fragmentet kan direkte tilordnes KLK3 (= PSA) cleavage på stedet 315 (SSIY-SQTE), har dette ikke gjelder for andre observerte semenogelin fragmenter. Disse kan ikke forklares ut fra KLK3 spaltning alene, impliserer tilstedeværelse av et mer komplekst proteaseaktivitet nettverk med flere nedstrøms-spaltningsseter hendelser etter innledende KLK3 spaltning Det er velkjent at det er gjensidig aktivering og hemming mekanismer i den flytende kaskade [24], som kan føre til ulike «nedstrøms» cleavage mønstre. Rollen til de potensielle peptidaser som er involvert i dannelsen av de spesifikke peptidfragmenter kan ikke bli bedømt i dag. I videre eksperimentelle studier mulige involvering av eksopeptidaser bør tas opp, som kan viderebehandle de første fragmenter. Imidlertid er dagens litteratur utilstrekkelig til å tildele de spesielle kutteseter innen semenogelin til forskjellige eksopeptidaser [25].
Vår studie står overfor flere begrensninger. Donasjon av sædvæske for diagnostiske formål er knyttet til flere praktiske problemer. Fra denne studien fant vi ut at mellom 30-50% av pasientene er villige og i stand til å donere sæd før radikal prostatakirurgi. Vi mener imidlertid at aksept vil forbedre ved å kommunisere de lovende resultatene fra vår foreløpige studien.
Vi kan delvis kompensere manglende overholdelse av inkluderingen av friske frivillige og pasienter med kronisk prostatitt. Selv om disse kohortene mulig for oss å bekrefte våre innledende hypoteser som sædvæske tilbyr en robust kilde av biomarkører, kan de også har innført en viss grad av skjevhet relatert til deres alder avvik i forhold til PCA og BPH grupper. I tillegg er våre tverrsnittstestkullene er relativt små og skjev. Derfor bør fremtidige bekreftende studier tankene godt drevet, balanserte, og alderstilpassede kontroll kohorter med klinisk utfall data om PCA subtyper i oppfølgingen. Basert på småskala testdata som presenteres her, sample size beregninger for en slik type studie anslag en total utvalgsstørrelse på 200 pasienter med avansert eller aggressiv PCa og 302 pasienter med lokaliserte indolente sykdom å demonstrere en minimal sensitivitet og spesifisitet på 70% og 80% for avansert PCA hhv.
Selv om bruk av state-of-the-art tandem massespektrometri, vi klarte ikke å sekvensere alle biomarkør kandidater. I motsetning til identifisering av foreldre proteiner ved tryptisk peptid mass fingerprinting, er innfødt Peptidsekvensering begrenset av posttranslasjonelle modifikasjoner, kompliserer ikke bare peptid fragmentering, men også påfølgende databasesøk.
Konklusjoner
var i stand til å bekrefte vår første hypotese at sædvæske er et robust kilde for identifisering av PCA protein maker profiler for primær diagnose av prostatakreft. Vår studie innebærer en to-trinns eksperimentell tilnærming med uavhengige funn og test sett av prøver i forhold til post-kirurgi klinisk referansestandard. Denne utformingen er i tråd med gjeldende retningslinjer for klinisk proteom analyse [26]. Selv om våre kullene er relativt små og valgt, de var hensiktsmessig å vurdere muligheten for banebrytende profilering og å anslå potensialet for nyskapende peptider som diagnostiske biomarkører. Derfor bør denne studien forstås som et første skritt inn i feltet av banebrytende biomarkører. Våre funn tilsier ytterligere bekreftende studier med forstørrede uselekterte potensielle validerings kohorter for å bekrefte og presise diagnostiske potensialet i de forutgående biomarkør kandidatene og deres (Patho) fysiologisk relevans.
Materialer, Pasienter og metoder
etikk Uttalelse
studiet ble godkjent av etikkomiteen ved Universitetet i Leipzig (Reg.nr. 084-2009-20042009) og ble gjennomført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter.
Studiedesign og sædvæske prøvetaking
utnyttes nyskapende plasmaprøver ble tatt fra 70 pasienter med PCA 21 pasienter med benign prostata hyperplasi (BPH), 25 pasienter med kronisk prostatitt (CP) og 9 friske kontroller (HC). Som klinisk referansestandard vi brukte en kombinasjon av histologisk opparbeiding av radikal prostatektomi prøver for post-kirurgi svulst gradering og iscenesettelse i PCA pasienter og negative 10-12 nål prostata biopsi kjerner og /eller negative prostata reseksjon prøvene i BPH pasienter. Alle pasienter ble spurt om å donere forutgående væske før radikal kirurgisk reseksjon av prostata, i løpet av ufruktbarhet eller urologiske diagnostikk. For biomarkører de tilgjengelige 125 prøvene ble delt opp i tre studiearmene, en for diagnostiske biomarkører (studie A), et sekund for avansert sykdom biomarkører med ulik opplæring og testsett (studie B), og biomarkør stabilitet og reproduserbarhet (studie C, figur 1). I studier A og B, ble prøvene enten brukt for oppdagelse eller for ytelsestester, men ikke begge deler. Femti prøver (22 PCA, 9 BPH, 14 CP, 5 HC) ble anvendt som treningssett for diagnostisk biomarkører (tabell 1A), ble 75 prøver inkludert i testsettet for testing av diagnostisk ytelse (48 PCa, 12 BPH, 11 CP 4 HC, Tabell 1B). For avansert sykdom biomarkører delt vi tilgjengelige 70 PCA prøver i et treningssett med 37 PCA prøver (21 GS 7, 16 GS 7). De resterende 33 prøvene med GS = 7 ble brukt som testsett (28 pT3a «lat», 5 ≥pT3a «avanserte»)
Vi har sammenlignet fem ulike tilnærminger for vurdering av risiko for klinisk PCa progresjon. : basert på retningslinjene i AUA [27] som sluttet seg til D’Amico kriterier [28], National Comprehensive Cancer Network (NCCN) kriterier [29], den strålebehandling Oncology Group (RTOG) kriterier [30], den europeiske Association of Urology (EAU) retningslinjer [31], og Kreft i prostata Risk Assessment Score (CAPRA) scorer [32] (tabell S4). Nyskapende plasmaprøver ble internt kodet og analysert blindt (testsett) etter å etablere biomarkør profil (treningssett).
For å analysere pre-analytisk stabilitet i sædvæske oppnås ved denne prøvetaking protokollen, en enkelt prøve fra en pasient huse PCa ble tint og fremstilt i to uavhengige replikat (studie C). Resten av prøven ble inkubert ved romtemperatur. For seks timer, hver time to replikater var forberedt. Alle 14 preparerte replikater ble lyofilisert kort tid etter forberedelse og re-suspendert umiddelbart før CE-MS analyse.
Analytisk presisjon av de etablerte SVM classifiers ble vurdert ved å bruke den til 15 CE-MS datasett hentet fra uavhengige replikater av en prøve av en 57 år gammel pasient med betydelig BPH. Prostatavolum var 120 cc og total serum PSA 4,3 ng /ml. Resultatene ble uttrykt som middelverdi og standardavvik. Variasjonskoeffisienter ble beregnet ved å dividere standardavvik av den observerte totale spekter av SVM score [21PP fra -1,50 til 1,50 (3,0 AU), 5PP fra -4,50 til 3,0 (7,5 AU), og 11pp fra -1,50 til 1,50 (3,0 aU)].
Prøve innkjøp og proteomikk analyse
Ejaculate ble samlet og lov naturlig kondense å skje ved proteolyse i romtemperatur i 15-30 min. Deretter ble prøvene ble sentrifugert ved 4000 rpm i 10 minutter for å separere sædceller fra sædvæske. Supernatanten ble deretter alikvotert i 50 mL alikvoter og dypfryst ved -80 ° C inntil videre behandling.
Prøvepreparering
Umiddelbart før bearbeiding, ble seminale plasmaprøver tint og proteinkonsentrasjonen ble justert til 2 mg /ml. 10 ul-replikater ble lyofilisert, lagret ved 4 ° C.
