Abstract
Bakgrunn
epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) aktivering spiller en rolle i kolorektal kreft (CRC) av kreft, og anti-EGFR legemidler brukes i behandling av avansert CRC. En av EGFR-ligander er tumor-assosiert trypsinogen hemmer TATI, også kalt serin protease inhibitor Kazal type1 (Spink 1), som vi nylig viste seg å være en uavhengig prognostisk markør i CRC.
Metoder
Vi studerte den prognostiske verdien av immunhistokjemiske uttrykk av EGFR og samtidig uttrykk av EGFR og TATI /SPINK1 i en serie av 619 pasienter med kolorektal kreft.
Resultater
av de prøvene var positive 92% for EGFR. EGFR + /+ TATI ble sett på 62,8%, EGFR + /TATI- på 29,5%, EGFR /TATI + på 4,9%, og EGFR /TATI- i 2,7% av pasientene. EGFR uttrykk korrelert med WHO grad (p = 0,040). I univariat analyse, EGFR-ekspresjon korrelerte med gunstig overlevelse (p = 0,006). EGFR + /TATI + pasientene viste bedre overlevelse enn gjorde de med andre kombinasjoner (p 0,001). I multivariat analyse, EGFR + /TATI + var en uavhengig prognostisk faktor på gunstig prognose (p 0,001)..
Konklusjon
Samtidig positivitet av EGFR og TATI /SPINK1 spår gunstig prognose i CRC
Citation: Koskensalo S, Louhimo J, Hagström J, Lundin M, Stenman UH, Haglund C (2013) Samtidig Tumor uttrykk av EGFR og TATI /SPINK1 Associates med bedre prognose ved kolorektalkreft. PLoS ONE 8 (10): e76906. doi: 10,1371 /journal.pone.0076906
Redaktør: Ichiro Aoki, Yokohama City University School of Medicine, Japan
mottatt: 31. mai 2013; Godkjent: 29 august 2013; Publisert: 25 oktober 2013
Copyright: © 2013 Koskensalo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Finska Läkaresällskapet, Medicinska Understösföreningen Liv och Hälsa og Sigrid Juselius Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er verdens tredje vanligste kreftformen [1], [2]. I Finland er forekomsten 30/100 000 /år [3]. Den viktigste prognostiske faktoren i CRC er tumorstadium.
Prognose av pasienter med lokal CRC er god, 5-års overlevelse er 80-90%, for node-positive svulster det er 60-70%, mens for tumorer med fjernmetastaser det er mindre enn 10%) [4] – [6]. Pasienter med stadium III-IV (Dukes «C og D) sykdom vanligvis mottar adjuvant kjemoterapi. I fase II (Dukes «B) sykdom, kjemoterapi ikke rutinemessig brukt selv om noen av disse pasientene åpenbart ville ha nytte av adjuvant terapi. For å identifisere pasienter med høy risiko krever ytterligere prognostiske faktorer som biomarkører.
epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), et mål for behandling av fremskreden kolorektal kreft, hører til et transmembran-glykoprotein av ErbB-reseptor tyrosin-kinase familien. Ligand-reseptor-interaksjon og dimerisering av reseptoren fører til autofosforylering tyrosin, aktivering av et intracellulært signal svei som fremmer celledeling og migrering, inhibering av apoptose, og angiogenese [7]. De monoklonale antistoffer cetuximab og panitumumab binder til EGFR og deaktivere aktivering av tyrosin-kinase og nedstrøms signalveier.
mutasjoner i molekylære stier aktivert via EGFR kan bidra til kreftutvikling. I CRC, de hyppigste mutasjoner bekymring KRAS-genet forekommer i ca 40% av CRC tilfellene [8], [9]. Mutasjonene deaktivere guanosin triphosphatase (GTPase) aktivitet, som fører til opphopning av aktiverte KRAS. Disse KRAS mutasjonene fører til manglende respons til anti-EGFR-terapi [10], [11].
Sammen med EGF, amfiregulin, transformerende vekstfaktor (TGF) α, epiregulin, betacellulin, heparin-bindende EGF, og epigen aktiverer EGFR [12]. Nylig i bukspyttkjertelen adenokarsinomer, serin protease inhibitor Kazal type1 (Spink 1), også kalt bukspyttkjertel sekretorisk trypsin inhibitor (PstI) og tumor-assosiert trypsinogen inhibitor (TATI), ble vist for å aktivere EGFR [13]. TATI /SPINK1 uttrykkes sammen med EGFR i bukspyttkjertelen adenokarsinomer. EGF og TATI /SPINK1 dele omtrent 50% aminosyrehomologi [14], og bindingsaffiniteten TATI /SPINK1 til EGFR er omtrent halvparten av den for EGF [13].
Vi har nylig vist at vev uttrykk for TATI /SPINK1 er en indikator på gunstig prognose i pasienter med kolorektal kreft [15]. I den foreliggende studien evaluerte vi forholdet mellom EGFR og TATI Uttrykket og mulig prognostisk verdi i tykk- og endetarmskreft.
Materialer og metoder
Pasient
Kliniske data var tilgjengelig fra 643 påfølgende pasienter som gjennomgikk kirurgi for histologisk bekreftet kolorektal kreft ved Kirurgisk avdeling, Meilahti Hospital, Helsinki University Central Hospital, mellom 1982 og 1998. Komplett kliniske data og prøver arkiv vev var tilgjengelig fra 623 saker, 333 av dem til mann. Median alder var 65,9 år (spredning 22,7 til 90,3), og median oppfølgingstid 4,81 år (range 0 til 25,8). Overlevelse og dødsårsak data til mars 2011 er hentet fra folkeregisteret Centre of Finland, og Statistisk Finland. Diagnostisering og iscenesettelse ble utført i henhold til den modifiserte Dukes «klassifiseringen [16]. Studien er godkjent av lokale etikkutvalg og er i samsvar med Helsinkideklarasjonen (Dnro HUS 226 /E6 /06) og nasjonale tilsynsmyndighet for velferd og helse. Clinicopathological kjennetegn ved pasientene er beskrevet i Tabell 1.
Vevsprøver og utarbeidelse av TMA blokker
Formalin-fiksert og parafininnstøpte kirurgiske vevsprøver ble samlet fra arkivene Department for patologi, Universitetet i Helsinki. Histopathologically representative områder av vevsprøver ble definert og merket på H E lysbilder. Tre kjerner fra hver svulst blokk ble samplet med 1,0 mm punchers ved bruk av en halvautomatisk vev microarrayer (Tissue Arrayer 1, Beecher Instruments Inc., Silver Spring, MD, USA). Tre parallelle serielle blokker ble konstruert, alt inkludert en prøve fra hver pasient. Fra hver blokk, ble 4 mikrometer tykke seksjoner kuttet for immunhistokjemi.
Immunohistochemistry
The Lab Vision Autostainer TM 480 (LabVision, Fremont, CA, USA) ble brukt til farging. Vevssnitt ble deparaffinized i xylen og rehydrert gjennom graderte alkohol serien. For å hente antigener, ble prøvene oppvarmet i forbehandlingen modul av Autostainer i forvarmet TRIS-EDTA-buffer pH 9,0 i 20 minutter ved 98 ° C. Prøvene ble inkubert i 5 minutter i DAKO REAL Peroxidase-Blocking Solution (DAKO, Glostrup, Danmark) for inaktivering av endogene peroksidaser. Seksjonene ble inkubert i 60 minutter med primært monoklonalt NCL-EGFR-antistoff (klon 113) mot det ekstracellulære domene, som flekker både membranen og cytoplasma (Novo Castra, Newcastle, Storbritannia, fortynning 1:10). Seksjonene ble omsatt i 30 minutter med HRP koblingen og i 30 minutter med HRP enzym (anti-muse-anti-kanin-merkede polymer) (DAKO, Carpinteria, CA, USA). Mellom hvert av trinnene ble seksjonene renset med Tween 20-PBS (fosfat-bufret natrium-klorid-buffer, pH 9,0). Deretter ble prøvene inkubert i 10 min i DAB + EnVision System (DAKO, Glostrup, Danmark), og farget med hematoksylin i 1 minutt. Til slutt ble prøvene skylt i rennende vann fra springen. Farging av TATI ble utført som beskrevet (Koskensalo 2011).
Scoring
EGFR cytoplasma immunopositivity i tumorceller ble scoret av to uavhengige etterforskere (S.K. og J.H.) uten kjennskap til klinisk utfall. Cytoplasmatisk EGFR immunopositivity ble evaluert ved prosentandel av positivt fargede celler. Positivitet i over 50% av cellene ble merket som tre, 10-50% som 2, og mindre enn 10% som en (figur 1). Fravær av positivitet ble scoret som 0. Tissue flekker uten tumorceller ble ekskludert. Den høyeste poengsum ble benyttet for hver enkelt pasient. For statistisk analyse, ble pasientene delt inn i to grupper:. EGFR (0 poeng) og EGFR + (score 1-3)
A. EGFR positiv, B. EGFR negativ, C. TATI /SPINK1 positiv, D. TATI /SPINK1 negativ immunoexpression
TATI /SPINK1 immunoexpression scoring var analogt med EGFR (Koskensalo 2011).; for statistisk analyse pasientene ble delt inn i to grupper:. TATI- (0 poeng) og TATI + (score 1-3)
Statistisk analyse
Vi analyseres separat EGFR flekker alene og sammen med TATI /SPINK1 farging (EGFR +/-, TATI +/- eller EGFR-TATI +/-). Sammenhengen mellom immunoexpression og clinicopathological variabler ble vurdert av χ
2 test eller Fishers eksakte test i tilfelle lave forventede frekvenser. Overlevelse ble analysert ved hjelp av Kaplan-Meier-metoden. Statistisk signifikante kovariater i univariat analyse ble analysert i multivariat overlevelse analyse av Cox modell. En p 0,05 ble betraktet som signifikant. Statistiske analyser ble utført med IBM SPSS statistikk 20,0 programvare.
Resultater
farging for EGFR
Pålitelig evalueringen av farging var mulig i 520 av de 623 prøvene. I 69 (13,3%), ble det cytoplasmatiske EGFR immunopositivity mottok så høy (3), 172 (33,1%) som moderat (2), og i 236 (45,4%) som svak (1), mens 43 (8,3%) viste no EGFR immunopositivity (fig. 1). Vi evaluerte bare cytoplasma flekker, fordi hvis cytoplasma er positiv, er uegnet for pålitelig evaluering membranfarging
EGFR immunoreaktivitets forbundet med svulst klasse.; positivitet ble påvist oftere i høyt og moderat differensiert enn i udifferensierte svulster (p = 0,040). EGFR-ekspresjon viste ingen assosiasjon med Dukes fase, men positivitet var mer ofte til stede i lokale (Dukes A-B) enn i metastasized tumorer (Dukes «C-D) (94,4% mot 88,8%, p = 0,021) (tabell 1 ).
Samtidig farging for EGFR og TATI /SPINK1
Evaluering av farging for både EGFR og TATI /SPINK1 var mulig i 511 av de 623 prøvene. Kombinasjonen EGFR + /TATI + var til stede på 321 (62,8%), EGFR + /TATI- i 151 (29,5%), EGFR-TATI + in 25 (4,9%), og EGFR /TATI- på 14 (2,7%) av pasientene.
EGFR + /TATI + korrelert med histologi som forekommer oftere i adenokarsinomer enn i andre histologiske tumortyper (p = 0,005), og varieres ved WHO grad, blir som oftest til stede i svært og moderat differensierte svulster (p 0,001) ( Tabell 2)
prognostisk verdi av EGFR
i univariat analyse, EGFR immunoexpression (p = 0,006), pasientens alder (p = 0,009), WHO grad (p. 0,001) og Dukes fase (p 0,001) i forbindelse med prognosen. Fem års overlevelse var 59,9% i EGFR + pasienter og 40,5% i EGFR pasienter (Tabell 3)
I multivariat overlevelsesanalyse, EGFR (p = 0,023), pasientenes alder (p. 0,001 ), Dukes «stadium (p 0,001), tumor plassering (p = 0,001), og WHO grad (p = 0,033) var uavhengige prognostiske faktorer (Tabell 4)
Prognostic rolle kombinasjonen. av EGFR og TATI /SPINK1
Samtidig uttrykk av EGFR og TATI /SPINK1 korrelert med prognose, 5-års overlevelse er 65,0% i EGFR + /TATI + pasienter, 47,7% i EGFR + /TATI-, 43,2% i EGFR /TATI +, og 42,4% i EGFR /TATI- pasienter (p 0,001) (tabell 4, figur 2). Høy alder (p = 0,009), avansert Dukes fase (p 0,001), og avanserte WHO grad (p 0,001). Korrelert med dårlig prognose (tabell 5)
I multivariat overlevelsesanalyse, EGFR /TATI uttrykk (p 0,001), alder (p 0,001), Dukes fase (p 0,001), og plassering (p = 0,003) var uavhengige prognostiske faktorer (Tabell 6)
Diskusjoner
Vi har nylig viste at TATI er en uavhengig prognostisk faktor i kolorektal kreft, høyt uttrykk vev bli assosiert med gunstig prognose. Her viser vi at samtidig immunoexpression av EGFR og TATI er en uavhengig prognostisk faktor for gunstig å overleve i tykktarmskreft, og det er en sterkere prognostisk faktor enn EGFR eller TATI /SPINK1 alene.
I samsvar med tidligere funn, vi observerte EGFR overekspresjon i kolorektal kreftprøver, [17], [18]. EGFR immunoexpression korrelerte signifikant med svulst klasse, blir oftere positive i høy og moderat differensierte svulster, som rapportert tidligere [19]. Omvendt, har EGFR-ekspresjon også blitt vist å korrelere med dårlig differensiering [18]. Som i andre studier, har vi funnet korrelasjon med histologi [20], [21], men ingen sammenheng mellom EGFR immunoexpression og Dukes fase. Dette er i samsvar med studiet av Giralt [20], mens Spano et al. rapportert sterkere EGFR overekspresjon i T3 enn i T4 tykktarmssvulster [17]. Deng et al. funnet i 94 pasienter med kolorektal kreft, en sammenheng mellom høy uttrykk og høy tumorstadium [22].
Her viser vi at EGFR immunoexpression er en uavhengig markør for gunstig prognose i pasienter med kolorektal kreft. Våre resultater avvike fra disse andres; EGFR uttrykk korrelerte ikke med å overleve i en studie av 249 [19] og 132 CRC pasienter [17] eller i 87 Dukes «C CRC pasienter, [6]. Men i enkelte studier spesifikt for tykktarmskreft, EGFR uttrykk korrelert med dårlig prognose. I en studie av 149 pasienter, EGFR-ekspresjon var et uavhengig markør for ugunstig prognose, men EGFR-ekspresjon ble observert i bare 35,6% av prøvene, som er mindre enn vanligvis rapportert [23]. Resnick et al. viste også en sammenheng mellom sterk EGFR uttrykk og dårlig prognose i tykktarm kreft [24]. I en subgruppeanalyse med bare tykktarmskreft, vår studie viste en sammenheng mellom EGFR uttrykk og bedre overlevelse, men forskjellen var ikke signifikant (data ikke vist).
I en subgruppeanalyse av endetarmskreft, fant vi betydelig bedre overlevelse (p = 0,001) hos pasienter med EGFR positivitet (data ikke vist). I 87 endetarmskreftpasienter som hadde fått preoperativ strålebehandling, Giralt et al rapporterte EGFR uttrykk i pre-behandling biopsies- men ikke i kirurgisk samples- å assosiere med negativ prognose [20]. I en studie av Fernebro et al. på 269 endetarmskreftpasienter, ble ingen sammenheng observert med metastaser overlevelse [25]. I en studie av 40 endetarmskreftpasienter, Yasuda et al. funnet avtagende EGFR nivåer etter kjemoradioterapi, men EGFR uttrykk var ikke en prognostisk markør [26]. Strålebehandling kan både redusere og øke EGFR uttrykk [27], [20]. Vi gjorde ikke analysere EGFR uttrykk i pre-behandling biopsier, men ingen forskjell i EGFR uttrykk dukket opp mellom endetarmskreftpasienter som får eller ikke får preoperativ strålebehandling (data ikke vist).
EGFR-målrettede behandlinger har vært brukt til spredning kolorektal kreft, men verdien av EGFR immunoexpression å forutsi effektiviteten av adjuvant behandling er kontroversielt. Interessant nok har den EGFR-antagonist cetuximab vist seg effektiv selv mot EGFR-negative tumorer [28]. En forklaring på dette kan være at anti-EGFR behandling er rettet mot metastasized svulster, og sammenhengen mellom EGFR immunoexpression i primærtumor og metastatisk lesjon er uklart og varierer mellom studier [19], [29], [22]. I tillegg trenger EGFR-positive svulster ikke alltid svare på cetuximab behandling [30]. Videre tumorer med KRAS mutasjoner er blitt funnet å reagere dårlig til anti-EGFR-terapi [10], [11], og er anbefalt analyse av KRAS mutasjons status for alle metastatiske CRC [31]. KRAS mutasjoner i kodon 12 korrelerer med ugunstig prognose [31], [32]. BRAF er det andre trinnet av EGFR-mediert reaksjonsvei. Mutert BRAF korrelerer med negativ prognose [33], men pasienter med BRAF mutasjon kan ha nytte av EGFR-målrettede behandlinger [31]. En ny metode som ser ut til å være bedre enn analyse av KRAS-mutasjoner til å velge pasienter for anti-EGFR terapi er kombinert analyse av KRAS-mutasjoner og EGFR genkopitallet [34].
PIK3CA (den fosfatidylinositol-4, 5-bisfosfonat 3-kinase, er katalytisk subenhet alfa-polypeptid-genet) reaksjonsvei nedstrøms en annen vei av EGFR-signalisering. Mutasjoner av PIK3CA genet kan fremme malign transformasjon [35]. Anvendelse av aspirin blokkerer PIK3CA vei, og korrelerer med bedre prognose blant pasienter med et mutert gen [36]. Dessverre data på aspirin bruk var ikke tilgjengelig i våre pasientjournaler.
Ozaki et al. viste at EGFR og TATI /SPINK1 er co-uttrykt i kreft i bukspyttkjertelen, og at SPINK1 stimulerer spredning av kreft i bukspyttkjertelen celler gjennom EGFR aktivering [13]. Her viser vi at i omtrent to av tre kolorektal karsinom prøver EGFR og TATI /SPINK1 er co-uttrykt. Vi har vist tidligere at høy TATI /SPINK1 vev uttrykk korrelerer med bedre prognose i CRC; her viser vi at samtidig uttrykk av EGFR og TATI /SPINK1 er en enda bedre markør for økt overlevelse. Det er kjent at det finnes positive og negative tilbakekoblingssløyfer innenfor EGFR-medierte baner avhengig av celletype, og en grunn for bedre prognose i kolorektal kreft kan være at binding av TATI fører til hemming av kaskader som leder til malign transformasjon. Også TATI binding til EGFR kan hemme bindingen av sterkere aktivering av ligander.
Det er derfor sannsynlig at TATI /SPINK1 og samspillet mellom TATI /SPINK1 og EGFR spille forskjellige roller i CRC enn i bukspyttkjertelen cancer.Interestingly, ekspresjon av TATI /SPINK1 i kreftvevet er også forbundet med god prognose i magekreft [37] og tap av TATI /SPINK1 uttrykk korrelerer med aggressiv sykdom i blærekreft [38]. Dette indikerer at TATI /SPINK1 utøver forskjellige funksjoner i ulike sykdommer. TATI /SPINK1 er ikke bare en aktivator av EGFR, men også en effektiv trypsininhibitor og trypsin er uttrykt av flere tumorer [38]. Det er derfor ikke overraskende om det også utøver forskjellige funksjoner i ulike svulster. Så langt er EGFR immunhistokjemi ikke et verktøy for prediksjon av hvilke pasienter som er sannsynlig å dra nytte av EGFR-målrettet adjuvant behandling. Det ville være interessant å undersøke om du legger TATI /SPINK1 vev analyse pluss KRAS mutasjonsanalyse og EGFR genkopitallet vurderingen ytterligere kan forbedre de lovende resultatene fra Ålgars et al. [34].
I konklusjonen, etter beste overbevisning, viser vi for første gang at samtidig immunoexpression av EGFR og TATI /SPINK1 er en uavhengig prognostisk markør for gunstig prognose i pasienter med kolorektal kreft. Kombinasjonen er en sterkere prognostisk verktøy enn enten TATI /SPINK1 eller EGFR alene. Videre studier er nødvendig for å bedre forstå sammenhengen mellom TATI /SPINK1 og EGFR i tykktarmskreft og for å vurdere den potensielle bruken av denne markøren kombinasjon for å forutsi behandlingsrespons.
Takk
Vi takker Päivi Peltokangas , Tuire Koski, og Elina Aspiala for utmerket teknisk assistanse.
