Abstract
Doble minutt kromosomene cytogenetiske manifestasjoner av genamplifisering ofte sett i kreftceller. Gener forsterket på dobbel minutt kromosomer inkluderer onkogener og multiresistent gener. Disse gener koder for proteiner som bidrar til kreft dannelse, kreft progresjon, og utvikling av resistens mot legemidler som brukes i behandling av kreft. Eliminering av dobbelt minutt kromosomer, og dermed gener forsterket på dem, er en effektiv måte å redusere malignitet av kreftceller. Vi undersøkte effektiviteten av en kreft legemiddel, gemcitabin, ved tap av dobbelt liten kromosomer fra eggstokk-kreft cellelinje UACC-1598. Gemcitabin er i stand til å redusere antall dobbelt liten kromosomer i celler ved en 7500X lavere konsentrasjon enn den som vanligvis anvendes kreft legemiddel hydroksyurea. Amplifiserte gener som er tilstede på de doble liten kromosomene er redusert på DNA-nivå ved gemcitabin behandling. Gemcitabin, selv ved en lav nanomolar konsentrasjon, er i stand til å forårsake DNA-skade. Den selektive inkorporering av doble minutter kromatin og γ-H2AX signaler til mikrokjerner gir en sterk sammenheng mellom DNA skade og tap av doble minutt kromosomer fra gemcitabin behandlede celler. Celler behandlet med gemcitabin viste også redusert cellevekst, kolonidannelsen, og invasjon. Sammen våre resultater tyder på at gemcitabin er effektiv i å redusere dobbelt minutt kromosomer og dette påvirker biologien til eggstokkreft celler
Citation. Yu L, Zhao Y, Quan C, Ji W, Zhu J, Huang Y, et al. (2013) Gemcitabine Eliminerer Doble liten kromosomer fra menneskelig eggstokkreft celler. PLoS ONE åtte (8): e71988. doi: 10,1371 /journal.pone.0071988
Redaktør: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., USA
mottatt: 17 mars 2013; Godkjent: 05.07.2013; Publisert: 22 august 2013
Copyright: © 2013 Yu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av International Science Technology Cooperation Program of China (2013DFA31610 til SF), Program for Changjiang Scholars og Innovativ Research Team i University (IRT1230 til YJ), National Natural Science Foundation of China (31000626 og 31271347 til WS, 81201761 til LY), og den nye Century Support Program for utmerket Scholar, Ministry of Education of China (NCET-10-0149 til WS, NCET-11-0954 til YY). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Geneamplifikasjon er en form for genomisk ustabilitet som er ofte sett i kreft, og det kan manifestere cytogenetisk som homogent flekker regioner (HSRs) eller doble minutt kromosomer (DMS) [1], [2], [3 ], [4]. DMS blir autonomt replikerende, asentrisk, og atelometric sirkulært DNA i området fra flere hundre til noen få kilobaser i størrelse megabases [5], [6], [7], [8], [9], [10]. I metafase sprer farget med et DNA-bindende fargestoff, kan DMS sees under mikroskopet som enkelt eller sammenkoblet liten i kromatin mye mindre enn de kromosomer.
Som et ekstrakromosomalt kjøretøy for amplifikasjoner av genomiske DNA-sekvenser, DMS bidra til kreft formasjon og progresjon fordi onkogener og multimedikamentresistens-gener er ofte til stede i de amplifiserte sekvensene og proteinene de koder ofte er overuttrykt [11]. Eksempler på gener forsterket på DMs inkluderer
MYCN
i neuroblastom [12],
C-MYC
i tykktarm kreft celler [13],
EGFR
i hjernesvulst [14], og
EIF-5A2
i eggstokkreft celler [15], og som alle når tapt via DMs bidrar til reversering av kreft fenotype [12], [13], [14], [16]. Eliminering av amplifikasjoner av onkogener i DMS har også blitt vist å indusere apoptotisk celledød, celledifferensiering, og cellulær begynnende alderdom [13], [17], [18].
Mange studier har bidratt til vår forståelse av mekanismen for tapet av DMS fra kreftceller. Tapet av DMS har blitt vist i mange cancercellelinjer [12], [13], [17], [19], [20], [21], [22]. Ikke-dødelige lave konsentrasjoner av hydroksyurea (HU) først har blitt funnet å øke tapet av DMS fra museceller inneholdende amplifiserte DHFR [23], og ble senere funnet å ha den samme virkning i pattedyrcancerceller [13], [24] . Tapet av DMS ved lave konsentrasjoner av HU kan øke medikamentsensitivitet [24] og redusere tumorigenisitet av cancercellelinjer [13]. Viktigst var tapet av DMS bidratt til deres inneslutning i mikrokjerner (MN) [13], og denne innesperring kan også bli forsterket ved lave konsentrasjoner av HU [25], [26].
Det er to modeller av MN-formasjon spirende /kjernedannelse i interfase og post-mitotisk formasjon [27]. Begrenset bevis eksisterer for bidraget fra HU til MN dannelsen av spirende /kjerne [25]. En detaljert studie indikerer HU kan indusere MN formasjonen gjennom post-mitotisk modell [28]. I denne modellen, induserer HU løsgjøring av DMS fra mitotiske kromosomer slik at aggregater av DMS dannes etter mitose ved neste G1-fasen av cellesyklusen. Etter celler inn i S-fasen, blir DMS aggregatene omgitt av lamin-protein for å fremstille en replikerbar cytoplasmisk MN [28]. Den molekylære mekanismen for HU på MN-formasjonen har vært intensivt undersøkt i tykktarm kreft celler som inneholder DMs [26]. Lave konsentrasjoner av HU forårsaker DNA-skade i cellekjernen i S-fasen, kan påvises som γ-H2AX brennpunkter, men de signaler som ikke i vesentlig grad overlapper med DMS kromatin. Som skaden er reparert og cellene komme seg gjennom cellesyklusen, er de fleste γ-H2AX signaler tapt ved meta mens noen signal som forblir overlapper med DMs kromatin. DMs med γ-H2AX signal ble funnet å løsne fra anaphase kromosomer og danne MN i neste G1 fase [26].
HU er en hemmer som spesifikt hemmer ribonukleotidreduktase (RNR). RNR er et viktig enzym som er nødvendig for
de novo
syntese av deoksyribonukleosidtrifosfater (dNTP) i cellene ved å konvertere ribonukleotider til deoksyribonukleotider [29], [30], [31]. Ribonukleotidreduktase kodes av to gener
RRM1
og
RRM2
, svarende til den store R1 og R2 liten subenhet av enzymet henholdsvis. HU er en viktig hemmer av dette enzymet, spesielt inhibere R2 subenheten. RNR er ikke bare viktig for å opprettholde dNTP forsyninger som trengs for DNA replikasjon, men spiller også en viktig rolle i å opprettholde genomet integritet [32].
gemcitabin (2 «, 2»-difluorodeoxycytidine, GEM) er en nyere kreft narkotika og det hemmer R1 subenheten av RNR. Den har to funksjonelle egenskaper. Den ene er den direkte interaksjon med R1 subenheten av RNR som reduserer RNR funksjon og derved senker dNTPs nivå i cellene. Mange studier har indikert at
RRM1
ekspresjonsnivået bestemmer GEM sensitivitet eller resistens [33], [34], [35], [36], [37]. Siden GEM er et deoksycytidin analog, den andre egenskapen av GEM er at det kan bli modifisert ved cellulære enzymer for å fremstille dFdCTP (2 «, 2′-difluorodeoxycytidine-5»-triphsophate), som kan innlemmes i de nylig replikerte DNA resulterer i kjedeterminering [38]. GEM brukes til å behandle forskjellige cancerformer så som ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), bukspyttkjertelkreft, blærekreft, brystkreft, og eggstokk-kreft [39], [40], [41], [42], [43] .
Eggstokkreft er en av de ledende gynekologiske kreftformer. Til tross for nylige fremskritt i behandlingen av denne kreftformen, mer enn halvparten av avanserte sykdom pasienter utvikler resistens mot behandlingen, erfaring tilbakefall av sykdom, og til slutt dø på grunn av disse egenskapene [44]. Standarden behandling av eggstokkreft er kirurgi etterfulgt av carboplatin pluss paklitakselbehandling, men mange pasienter utvikler tilbakevendende sykdom med motstand til platina terapi [45]. Ved godkjenning av bruk av GEM i behandling av eggstokkreft i Europa, USA og andre land de siste årene, er GEM bli et lovende nytt legemiddel i behandling av eggstokkreft. Nylig GEM har vist seg å være effektiv ved behandling av ovariekreft spesielt i platina resistente underklassen, enten brukt alene eller i kombinasjon med andre medikamenter [1], [40], [44], [45], [46].
DMs ble funnet å være til stede i primær ovarialcancer prøver og ascites fra ovarian kreftpasienter, og i etablerte eggstokkreft cellelinjer [15], [47], [48], [49], [50] . En studie har funnet at pasienter hyppigheten av ovarialcancer med DMs er så høy som 88% [51]. En studie har funnet at for ovarian cancer pasienter behandlet med lave konsentrasjoner av HU, antall DMS ble redusert i kreftceller fra disse pasientene [52]. Selv om HU kan tas oralt eller injiseres intravenøst, er det en svak hemmer av RNR med en halveringstid på bare 3,4 timer før den ble elimineres via nyrene [53]. I denne studien fant vi ut om GEM kan selektivt redusere visse genet presiseringer via DMs, mekanismene for DMs nedgang, og hvilken verdi det har i behandling av eggstokkreft. GEM kan redusere antall DMs i eggstokkreft celler samt gener forsterket på de spesifikke DMs i en konsentrasjon 7500X lavere enn HU. Med tillegg av GEM, antallet MN økt, og gener båret på DMS er selektivt innarbeidet i disse MN. Selv lave konsentrasjoner av GEM kan føre til DNA-skade i celler, og disse skadet DNA blir også selektivt innarbeidet i MN. Vi foreslår at GEM kan føre til DNA-skader på DMs, som da ikke reparert, selektivt innlemmet i MN og tapt fra cellene. Dette i sin tur påvirker biologi av kreft celler, slik at cellene vise redusert vekst, redusert kolonidannelse og redusert invasjon.
Materialer og metoder
1. Cellelinjer og kultur betingelser
eggstokkreft cellelinje UACC-1598 var en slags gave fra Dr. Xin Yuan Guan (University of Hong Kong) [15]. Den UACC-1598-4 cellelinjen var en klon av UACC-1598 er valgt for den stabile opprettholdelse av et høyt antall DMS. Det ble gjort ved seriefortynning metoden. Alle cellelinjer ble holdt i Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) media (GIBCO, Carlsbad, CA, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS). Cellene ble dyrket ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 og passert hver 2 til 3 dager da de vokste konfluent.
2. Drug Treatment og vekst Analyse
HU og GEM ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (Saint Louis, MI, USA) og henholdsvis Lilly France (Frankrike) og forberedt i henhold til produsentens anbefalinger. HU stamoppløsning ble laget i dimetylsulfoksyd (DMSO) og GEM stamoppløsning ble laget i 0,9% NaCl. Konsentrasjonene av HU benyttet i forsøkene var 100 og 150 uM følgende publiserte konsentrasjonen [23], [24], [26]. Konsentrasjonene av GEM som ble anvendt var 10 og 20 nM, som var forskjellige fortynninger av dens halvparten av maksimal hemmende konsentrasjon (IC
50) i de cellelinjene som ble brukt i denne studien. Konsentrasjonen av gemcitabin anvendt i denne studien var 3-6 ganger lavere enn den standard
in vivo
dosen som gis til pasienter (Lilly France). Konsentrasjonene 10 og 20 nM av GEM tilsvarer 0,01 IC
50 og 0,02 IC
50 av GEM i UACC-1598-4 cellelinje. De samme konsentrasjonene tilsvarer 0,032 og 0,064 IC
50 av GEM i UACC-1598 cellelinje. Celler ble passert hver 2 til 3 dager, og frisk forbindelser ble tilsatt. IC
50 av GEM ble beregnet ved hjelp CellTiter 96 AQ
ueous En løsning Cell Proliferation Assay Kit fra Promega (Madison, WI, USA) etter produsentens protokoll.
3. MTS, kolonidannelse, og bølgen Assays
I korthet celle biologiske analysene ble utført som følger. For MTS-analysen, ble 2000-celler sådd i hver brønn i 96-brønners plater. Celler ble enten tillatt å vokse i medium alene eller medium inneholdende 150 uM HU eller 20 nM GEM. OD av hver brønn ble lest hver dag etter CellTiter 96 AQ
ueous En løsning Cell Proliferation Assay kit protokoller og plottet. For kolonidannelse, ble 2000-celler sådd i hver brønn i en 6-brønns plate enten i nærvær eller fravær av forbindelser. Celler ble tillatt å vokse i 14 dager før den ble vasket med fosfatbufret saltvann (PBS), etanol fiksering, og Giemsa-farging. Bildene ble tatt for hver brønn, og koloniene ble tellet manuelt med ImageJ programvare. Tre replikater ble gjort for hver tilstand. For celle invasjon, ble seksti tusen celler sådd i BD BioCoat Matrigel invasjonen Chambers (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA), og lov til å invadere gjennom en matrigel membran. Etter 72 timer ble antall celler som invaderte gjennom membranen telles. Tre replikater ble utført for hver forbindelse tilstand.
4. Meta Spre
Celler ble behandlet med Colcemid (Sigma) for 1,5 timer, trypsinert og vasket i PBS før forbereder metafase sprer seg. Cellene ble først svellet i 9 ml forvarmet 0,075 M KCl i 14 min, ved 37 ° C. Etter svelling, cellene ble pre-fiksert med 1 ml rykende fiksativ oppløsning (blanding av 3 metanol: 1 eddiksyre) og straks sentrifugert. Celler ble deretter fiksert og sentrifugert to ganger med 10 ml av fikserløsningen. Cellepellets fra den siste sentrifugering ble resuspendert i 0,5 ml fiksativ, og en liten mengde ble tatt i en Pasteur-pipette og slippes ned på rene glassplater. Mitotiske kromosomer ble observert ved farging av glassplatene med Giemsa og fotografert med Olympus BX41 mikroskop (Olympus America Inc., Melville, NY, USA) koblet til en JVC TK-C75U fargevideokameraet (JVC, Japan) ved 1000x forstørrelse. Antallet DMS tilstede i hver celle ble tellet manuelt. Antall celler telles områder 60 og 100 for hver prøve.
5. Isolering av genomisk DNA og Real-time PCR
Celler ble pelletert og genomisk DNA ble utarbeidet med QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Tyskland) som beskrevet av produsenten. Real-time PCR ble utført ved hjelp av SYBR Premiks Ex Taq II mix (Takara Bioteknologi (Dalian) Co., Ltd., Kina) i LightCycler 480 (Roche Applied Science, Tyskland) Real-Time PCR deteksjon system. Forsterkingsnivået for
MYCN
,
EIF5A2
, og
MCL1
ble oppdaget, og
ACTB
fungerte som den interne kontrollen. Gjennomsnitt ± standard avvik (SD) av tre replikater ble plottet for hvert sett av sammenligninger mellom behandlings- og kontrollcellene. Primerne som ble brukt var som følger:
EIF5A2
, 5′-TACTTGGCAGAGATTAAACAGG-3 «(F), 5′-CAAAGTATTTGCACCTTGAAG-3» (R);
MYCN
, 5′-ACCACAAGGCCCTCAGTAC-3 «(F), 5′-GCAACGGCATTCTCTCAG-3» (R);
MCL1
, 5′-CTGGAGATTATCTCTCGGTAC-3 «(F), 5′-CTGACTCGTTTCGGTTTC-3» (R);
ACTB
, 5′-CTTCTACAATGAGCTGCGTG-3 «(F), 5′-AAGCAAATAGAACCTGCAGAG-3» (R).
6. Fluorescent
in situ
Hybridisering (FISH)
meta oppslag ble først fremstilt som beskrevet ovenfor, og fisken ble deretter utført med følgende protokoll. Bakteriell kunstig kromosom (BAC) klone RP11-654K19 for
EIF5A2
, BAC klone RP11-355H10 for
MYCN
, og BAC klone RP11-54A4 for
MCL1
ble valgt for FISH prober merket med cyanin 3 (Cy3), fluoresceinisotiocyanat (FITC), eller cyanin 5 (Cy5). Glassene ble deretter motfarget med 4, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) og fotografier ble tatt med en Leica DM5000B mikroskop (Leica Micro, Tyskland) ved 1000x forstørrelse. Antall celler analysert i området fra 180 til 280 for hver prøve.
fullt signal av cellekjernen vi observerte er satt til 100%. Cellene ble gruppert i 3 kategorier for analyse av signalet fordeling: Gruppe 1 omfatter celler med 30% signal, Gruppe 2 omfatter celler med 30-60% signal, og Gruppe 3 omfatter celler med 60% signal. Graden av signalet er kvantifisert ved å bruke MetaMorph software (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) for å analysere den relative arealet av signalet til området av cellekjernen. En mikrokjerne (MN) er definert som en hvilken som helst DAPI farget region mindre lys enn den DAPI farget kjerne og med et areal på mindre enn en tredjedel av cellekjernen. Celler med to eller flere mikrokjerner ble ikke regnet for å eliminere artefakter. Celler ble også gruppert basert på MN status: Gruppe A inneholder celler uten MN, Gruppe B omfatter celler med MN men MN inneholder ikke signal, og Gruppe C omfatter celler med signalholdig MN
7.. Immunfluorescens
Cellene ble sådd på dekkglass i seks-brønns plater og behandlet med forskjellige forbindelser i de angitte tidsrom før utfører immunfluorescens. Kort sagt ble celler på objektglassene vasket 3 x 10 minutter i PBS, fiksert med 4% paraformaldehyd i 20 minutter ved romtemperatur, og rehydrert 3 x 10 minutter med PBS. Cellene ble permeabilisert og blokkert i KCM-buffer (120 mM KCl, 20 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 2% bovint serumalbumin, og 10% skummet melkepulver) i 6 timer ved 4 ° C og inkubert med anti-fosfor-H2AX (Ser139) antistoff (klone JBW301, Millipore, Billerica, MA, USA) fortynnet i KCM buffer (1:500) over natten ved 4 ° C. Cellene ble deretter vasket 3 x 10 minutter i PBS, inkubert med CF555 geit-anti-mus IgG (H + L) (Biotium, Hayward, CA, USA) fortynnet i KCM buffer (1:1000) i 1,5 timer ved romtemperatur, og igjen vasket tre ganger i 10 minutter hver med PBS. DNA ble visualisert ved hjelp av kontra cellene med DAPI og montert på objektglass. Bilder ble innhentet ved hjelp av en Leica DM5000B mikroskop. For å analysere omfanget av DNA-skade i cellene, ble cellene gruppert i henhold til deres γ-H2AX signaler uavhengig av MN-status. Celler ble gruppert i fem kategorier, inkludert noe signal, 30% signal, 30-60% signal, 60% signal, og full signal av MetaMorph programvare. For scoring av MN i celler løslatt fra forbindelser, ble cellene gruppert i fire kategorier: Gruppe 1 inneholder celler uten MN, Gruppe 2 inneholder celler med MN og MN inneholder ikke signal, Gruppe 3 omfatter celler med signalholdig MN, gruppe 4 omfatter celler med 1 eller 2 sterke signal flekker i cellekjernen nær periferien av kjernen.
8. Statistisk analyse
statistisk signifikans i DMs data og real-time PCR data ble analysert ved hjelp av uparet t-test med unntak av DMs data i UACC-1598-4, som ble beregnet med variansanalyse (
ANOVA
), etterfulgt av Dunnetfs multiple sammenligningstest stolpe. Den statistiske betydningen av FISH, γ-H2AX signal vs. ingen signaldata og MN data ble analysert med
Fishers eksakte test
. Betydningen av MTS og kolonidannelse data ble beregnet med
ANOVA
. Den statistiske betydningen av celle invasjon ble beregnet med
Chi-squared test
. Statistisk signifikans i alle data er angitt som følger: * angir en
P
verdi på 0,01 til 0.05, ** angir en
P
verdi på 0,001 til 0,01 og *** angir en
P
verdi. 0,001
Resultater
1. GEM reduserer antall DMs i Ovarian Cancer Cell linje UACC-1598 og Clone UACC-1598-4
UACC-1598 er en eggstokkreft cellelinje som består av genet forsterkning i form av DMS. UACC-1598-4 ble skapt av serie fortynning metoden ved såing og isolere enkeltceller fra foreldrenes cellelinje UACC-1598 og forbereder metafase sprer å bestemme antall DMs en klone inneholder. Denne klon ble funnet å ha en økning i antallet DMS sammenlignet med den parentale cellelinje (figur 1A). Mens UACC-1598 cellelinje inneholdt et gjennomsnitt på 34.61 DMs per celle, UACC-1598-4 hadde et gjennomsnitt på 76.16 DMs per celle som er mer enn det dobbelte av verdien for foreldrecellelinje. Forskjellen mellom antall DMs i UACC-1598 og klone UACC-1598-4 ble funnet å være statistisk signifikant med en
P
verdi. 0,001
A. Representative bilder av metafase spredning av UACC-1598 og UACC-1598-4 celler. Pilene viser DMs. Antallet DMS i hver metafase-celle ble tellet og plottes. *** Indikerer
P
0,001. B. metafase sprer ble fremstilt for celler dyrket i nærvær av lave konsentrasjoner av enten HU eller GEM i 1 uke eller 2 uker. Antallet DMS i hvert metafase celle ble tellet. De røde linjene representerer gjennomsnittet og de svarte linjene representerer SEM. * Angir en
P
verdi på 0,01 til 0,05 og ** angir en
P
verdi på 0,001 til 0,01.
Vi testet først om forskjellen i antall DMs mellom UACC-1598 og UACC-1598-4 påvirker følsomheten til GEM. Vi utnyttet MTS metode for å beregne IC
50 av GEM i de to cellelinjer og fant ut at det var en forskjell. IC
50 av GEM var 310 nM i UACC-1598 og 970 nM i UACC1598-4 (data ikke vist), og forskjellen skyldes sannsynligvis flere DMs å være målrettet og eliminert fra UACC1598-4. Siden UACC1598-4 klon ble utvalgt for sin generering og opprettholdelse av et stort antall av DMS, vi først brukte denne cellelinje for å bestemme om GEM kan føre til et tap av DMS fordi vi en hypotese at det kan være lettere å detektere en forskjell i antall DMs. Celler ble tillatt å vokse i medium som inneholdt 10 nM (0,01 x IC
50) av GEM i to uker før metafase sprer fremstilt. Våre forsøk indikerer at tilsetning av lave konsentrasjoner av GEM kan redusere antall DMS i UACC-1598-4 eggstokkreft celler, i likhet med tilsetningen av HU (figur S1A). Gjennomsnittlig antall DMs falt 76,16 til 25,23 i 150 mikrometer av HU. I tillegg er gjennomsnittlig antall DMs falt til 48,99 i 10 nM av GEM.
Vi så bestemt om GEM kan redusere antall DMs i foreldre UACC-1598 cellelinje. Celler ble tillatt å vokse i medium som inneholdt 10 nM (0,032 x IC
50) og 20 nM (0,064 x IC
50) av GEM før metafase sprer fremstilt. Vi fant at GEM ved 10 nM var ikke effektive i denne cellelinje. Etter inkubering UACC-1598-celler i 20 nM av GEM, vi har observert en statistisk signifikant reduksjon i antallet DMS i både en uke og 2 uker etter at cellene ble kontinuerlig dyrket i media inneholdende GEM (figur 1B). Gjennomsnittlig antall DMs redusert 37,00 til 24,83 etter en uke vekst i nærvær av GEM, og det gikk ned 31,84 til 21,59 etter 2 uker med vekst i GEM. Siden HU ble oppløst i DMSO, fjernet vi effekten av DMSO i våre forsøk, ved å sammenligne HU behandlede celler til DMSO-behandlede celler. Det gjennomsnittlige antall DMS ble redusert fra 29,37 i celler dyrket i medium inneholdende DMSO til 20,77 i celler dyrket i medium inneholdende 150 uM HU i 2 uker. Vi har også i forhold til kontrollceller DMSO-behandlede celler, og at forskjellen mellom de to var ikke statistisk signifikant (data ikke vist), noe som indikerer at DMSO ved en konsentrasjon vi anvendt som bærer for HU ikke signifikant påvirker våre eksperimentelle resultater. I tillegg fant vi også at GEM er effektiv i å redusere DMs fra andre cellelinjer så vel (data ikke vist). Vi har derfor brukt HU ved en konsentrasjon på 150 uM og GEM ved en konsentrasjon på 20 nM for alle følgende eksperimenter.
2. GEM formidler Tap av DMs Amplified Gener
EIF5A2 Hotell og
MCL1
Når vi har funnet at GEM kan redusere antall DMs i både UACC-1598 og UACC-1598- 4, er det neste spørsmålet vi spurte om gener forsterket på DMs er også redusert. Det er kjent at onkogener
EIF5A2 Hotell og
MYCN
er to gener forsterket i UACC-1598 [15], [16], og
MCL1
ble også funnet å bli forsterket i denne cellelinjen (upubliserte data). Vi først bekreftet at disse tre genene vi analysert er tilstede på DMs med fisk eksperimenter (figur 2A). Vi deretter separert celler dyrket i HU eller GEM inn i 3 grupper i henhold til nivået av
EIF5A2, MYCN, etter og
MCL1
signaler (figur 2B). Gruppe 1 omfatter celler med 30% signal, noe som tilsvarer celler med mindre signaler fra
EIF5A2
,
MYCN
, og
MCL1
, og er en indikator på celler med mindre antall DMs; gruppe 2 omfatter celler med 30-60% signal; og gruppe 3 omfatter celler med 60% signal, som er en indikator på celler med flere DMS. Prosentandelen av celler i hver gruppe ble plottet. Prosentandelen av celler i gruppe 3, som inneholder celler med større enn 60% signaler, redusert i nærvær av enten HU (fra 11% til 6%), eller GEM (fra 16% til 7%). I tillegg er prosentandelen av celler i gruppe 2 ble redusert fra 33% til 24% for HU behandlede celler og 37% til 25% i GEM behandlede celler. I motsetning til den reduksjon i prosentandelen av celler i gruppe 2 og 3, er prosentandelen av celler i gruppe 1 økte med 14 til 21% i celler behandlet med HU (fra 56% til 70%) eller GEM (fra 47% til 68% ). Økningen i andelen av celler i gruppe 1 i HU eller GEM behandlede celler indikerer cellene har begynt å miste sine DMs. I tillegg er konsolidert vi grupper 2 og 3 inn i en stor gruppe, og statistiske analyser viste at forskjellene observert mellom DMSO og HU eller kontroll og GEM behandlede celler er statistisk signifikant (figur 2B). Disse resultatene indikerer at signalet fra de forsterkede gener
MYCN
,
EIF5A2
, og
MCL1
på DMs i UACC-1598 celler ble redusert i nærvær av både HU og GEM . Et lignende resultat ble sett for GEM når analysere
MYCN Hotell og
EIF5A2
i UACC-1598-4 celler (figur S1B).
A. Gener
EIF5A2
,
MYCN
, og
MCL1
er tilstede på DMs i UACC-1598 celler. Metafase spredning av UACC-1598 celler oppdages med DNA-probe for
EIF5A2
,
MYCN
, og
MCL1.
For de overlappende bilder,
EIF5A2 Hotell og
MCL1
signaler er vist i rødt, og
MYCN
signal vises i grønt. Overlappet
EIF5A2 Twitter /
MYCN Hotell og
MCL1 Twitter /
MYCN
er vist i gult. B. Representative bilder av
EIF5A2 Twitter /
MYCN Hotell og
MCL1 Twitter /
MYCN
FISH signaler i interfase celler UACC-1598 og hvordan enkelte celler er delt inn i forskjellige grupper.
MYCN
signal vises i grønt,
EIF5A2 Hotell og
MCL1
vises i rødt, og overlappingen er vist i gult. Prosentandelen av celler i grupper 1, 2 og 3 er basert på
EIF5A2 Twitter /
MYCN Hotell og
MCL1 Twitter /
MYCN
FISH signaler. Den statistiske analysen viste forskjeller i cellene i gruppe 1 og gruppe 2/3 sammenlignet med kontrollceller. * Angir en
P
verdi på 0,01 til 0,05 og ** angir en
P
verdi på 0,001 til 0,01.
Videre har vi også bekreftet våre resultater etter utføre real-time PCR for å analysere forsterkning av
EIF5A2, MYCN, etter og
MCL1
i celler dyrket i nærvær av HU eller GEM (figur 3). Vi så en statistisk signifikant reduksjon i forsterkningen av
EIF5A2 Hotell og
MCL1
gener når cellene ble dyrket i nærvær av enten HU eller GEM. For celler behandlet med HU, en reduksjon i relativ DNA-amplifikasjon nivå av 1,151 ± 0,213 til 0,658 ± 0,092 ble observert for
EIF5A2
, og en reduksjon i nivået av amplifisering 0,860 ± 0,122 til 0,422 ± 0,106 ble observert for
MCL1
. For celler behandlet med GEM ble det observert en nedgang i forsterkingsnivået for 0,930 ± 0,094 til 0,383 ± 0,005 for
EIF5A2
, og en nedgang i forsterkingsnivået for 1,242 ± 0,343 til 0,388 ± 0,048 ble observert for
MCL1
. Vi har imidlertid ikke påvise en statistisk signifikant reduksjon i forsterkningen av
MYCN
i enten HU eller GEM behandlede celler. Lignende resultater ble også kjøpt for UACC-1598-4 celler, selv med obskure endring av
MCL1 plakater (figur S1C).
forsterkning nivå av gener
EIF5A2
,
MCL1
, og
MYCN
ble analysert ved real-time PCR. Forsterkingsnivået for hvert gen i sammensatte behandlede celler sammenlignet med kontrollceller (DMSO for HU behandles, og Ctrl. For GEM behandlet), og den midlere relative forsterkning nivå ± SD fremstilles grafisk. * Angir en
P
verdi på 0,01 til 0,05 og ** angir en
P
verdi av 0,001 til 0,01, *** betegner
P
. 0,001
3. Entrapment av DMs Amplified Gener i Mikrokjerner
En måte som DMs antas å bli eliminert fra celler er ved inkorporering i mikrokjerner. Med forsterkede gener som prober, ble det observert noen celler med MN inneholdende prober, mens andre har MN ikke inneholdende probene (figur 4). Vi er fast bestemt prosentandel av MN dannelse i celler behandlet med HU eller GEM, og også observert om disse mikrokjerner inneholdt
EIF5A2, MYCN Hotell og
MCL1
signaler (tabell 1). Vehicle DMSO behandlede celler har en MN dannelsen frekvens på 13,87 × 10
-2 mens HU behandlet celler har en MN dannelsen frekvens på 30,61 × 10
-2, noe som indikerer HU er effektiv på å indusere MN formasjon. I tillegg er GEM også effektiv ved indusering av MN formasjonen. Celler behandlet med 20 nM GEM har en MN dannelsen frekvens på 21,82 × 10
-2 sammenlignet med 13,98 × 10
-2 i kontrollceller. Ved å undersøke
EIF5A2, MYCN, etter og
MCL
signaler i MN, vi også merket en økning i hyppigheten av MN som inneholder
EIF5A2, MYCN, etter og
MCL
signaler, betegnet MN (
EIF5A2
+
MYCN
+
MCL +
) eller Minnesota (+) for kort, for cellene i HU og GEM behandling grupper. En 2,57 og 1,81 ganger økning i MN (+) frekvens ble observert for HU og GEM behandlede celler henholdsvis. Sammen vår fisk resultater tyder på at DMs forsterket gener
EIF5A2, MYCN, etter og
MCL
er tapt fra celler behandlet med enten HU eller GEM ved å være selektivt oppfanget i MN. Lignende resultater ble oppnådd med UACC-1598-4 celler (tabell S1).
De forlot to panelene er representative bilder av celler som viser MN uten signal og riktige to panelene er representative bilder av celler som viser MN med
EIF5A2 Twitter /
MYCN
eller
MCL1 Twitter /
MYCN
signal.
MYCN
signal vises i grønt,
EIF5A2 Hotell og
MCL1
vises i rødt, og overlappingen er vist i gult. Pilene viser MN.
4. Lave konsentrasjoner av GEM forårsaker DNA Damage i Cells likhet med lave konsentrasjoner av HU
Lave konsentrasjoner av HU har blitt funnet å forårsake skade på DNA påvises som γ-H2AX foci i celler. Vi avgjort om GEM kan også føre til DNA-skader. Vi behandlet UACC-1598 celler med HU eller GEM i 24 timer og utført immunfluorescens å bestemme mengden av γ-H2AX foci i enkeltceller.
