Abstract
Mål
For å vurdere påliteligheten av magnetic resonance imaging (MRI ) for påvisning av esophageal kreft i Levrat modell av ende-til-side esophagojejunostomy.
Bakgrunn
Levrat modellen har vist seg nytte i form av dens evne til å replikere Barretts kreftutvikling ved å fremkalle gastroduodenoesophageal reflux (GDER). På grunn av manglende data om nytten av ikke-invasive metoder for påvisning av spiserørskreft, har behandling effektstudier vært begrenset, som adenokarsinom histologi har bare blitt validert post-mortem. Det vil derfor være av stor verdi hvis gyldigheten og påliteligheten av MRI kan bli etablert i denne innstillingen.
Metoder
Kronisk GDER reflux ble indusert i 19 Sprague-Dawley rotter ved hjelp av den modifiserte Levrat modell. På 40 uker etter operasjonen, alle dyr gikk endoskopi, MR-røntgen, og post-mortem histologisk analyse av spiserør og anastomose. Med post-mortem histologi tjener som gullstandarden ble vurdering av tilstedeværelsen av spiserørskreft laget av fem esophageal spesialister og fem radiologer på endoskopi og MR, henholdsvis.
Resultater
Nøyaktigheten av MR og endoskopisk analyse for å korrekt identifisere kreft vs. ingen kreft var 85,3% og 50,5%, henholdsvis. ROC-kurver vist at MR vurdering hadde en AUC på 0,966 (
p
0,001) og endoskopi vurdering hadde en AUC på 0,534 (
p =
0,804). Sensitiviteten og spesifisiteten av MRI for å identifisere kreft vs. ikke-kreft var henholdsvis 89,1% og 80%, sammenlignet med 45,5% og 57,5% for endoskopi. Falske positive tallene for MRI og endoskopi var 20% og 42,5%, henholdsvis.
Konklusjoner
MR er en mer pålitelig diagnostisk metode enn endoskopi i Levrat modell. Den ikke-invasivitet av verktøyet og dets potensial til volumetrisk kvantifisere størrelsen og antall svulster sannsynlig gjør det enda mer nyttig for å vurdere nye agenter og deres effekt i behandlingsstudier av spiserørskreft
Citation. Kosovec JE, Zaidi AH, Komatsu Y, Kasi PM, Cothron K, Thompson DV, et al. (2014) Etablering av Magnetic Resonance Imaging som en nøyaktig og pålitelig verktøy for å diagnostisere og Monitor Esophageal kreft i en rottemodell. PLoS ONE 9 (4): e93694. doi: 10,1371 /journal.pone.0093694
Redaktør: Helge Bruns, Universitetssykehuset Heidelberg, Tyskland
mottatt: 06.12.2013; Godkjent: 08.03.2014; Publisert: 04.04.2014
Copyright: © 2014 Kosovec et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av David Gold og Irene Blumenkranz. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Behandlingstilbud for pasienter med spiserørs adenokarsinom (EAC) er i dag begrenset og komplisert ved det faktum at de fleste pasienter til stede med avansert stadium sykdommen [1] – [3]. Videre er utbredelsen av esophageal adenokarsinom fortsetter å øke i USA, og de fem-års overlevelse er bare 15% [4]. Det har derfor blitt stadig mer aktuelt å teste nye teknikker og nye midler for å forebygge og behandle EAC gjennom implementering av omfattende translasjonsstyrker modeller. Den kirurgiske modell av ende-til-side anastomose esophagojejunal i rotter (modifisert Levrat modell) induserer kronisk gastroduodenoesophageal tilbakeløp (GDER) og eksponerer spiserøret til magesyre og galle å initiere sykdomsprogresjon [5] – [10]. Den Levrat modellen har blitt validert for effektivt å gjenskape den samme langsgående progresjon fra gastroøsofageal reflukssykdom (GERD) til Barretts øsofagus (BE) for å EAC som er observert hos mennesker [11], [12]. I tillegg er svært effektiv modellen, som det har vist seg at omtrent 70% av rottene utvikle EAC etter 28 uker etter kirurgi [13].
Tidligere studier har vist nytten av denne modellen for å bestemme effekten forebyggende midler mot sykdomsutvikling, men muligheten for anvendelse som et behandlingsmodell har vært begrenset av en manglende evne til på en pålitelig måte diagnostisere patologi antemortem [13], [14]. Visual endoskopisk analyse har vært brukt som et verktøy for å overvåke naturhistorie av sykdom [15], med biopsi som åpner for analyse av molekylære markører og samtidig unngå dyreoffer [16] – [18]; imidlertid, på grunn av den iboende begrensning modell av det ekstra-luminal presentasjon av flertallet av tumorer, så vel som den lave nøyaktigheten av endoskopiske biopsier, adenocarcinom histologi har bare blitt validert post-mortem [15].
Alternative imaging teknikker som mikro-PET-skanning har blitt utforsket i et forsøk på å løse dette problemet; imidlertid har ingen av disse teknikker blitt påvist vesentlig sensitiv og spesifikk i forhold til gullstandarden for histologi [19]. Nylig har magnetisk resonansavbildning (MRI) blitt anvendt som en ikke-invasiv avbildning Fremgangsmåte i bryst og leverkreft dyremodeller [20] – [22]. Med post-mortem histologisk analyse å være gullstandarden for EAC, vårt mål var å undersøke om MR skulle vise seg å være et gyldig verktøy for å oppdage tilstedeværelsen av esophageal kreft i Levrat modellen i forhold til visuell inspeksjon med endoskopi.
Materialer og metoder
Levrat Modell
den institusjonelle Animal Care og bruk komité ved University of Pittsburgh godkjent en protokoll for utvikling av denne studien (protokoll nr. 1104373). Alle dyr fikk human behandling i samsvar med «Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr.» End-til-side esophagojejunal anastomose (Fig. 1) ble utført på 300 g 6-8 ukers gamle Sprague-Dawley rotter ( Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) i henhold til den kirurgiske prosedyren og overvåking som tidligere beskrevet [13]. Vekten og helsetilstanden til dyrene ble overvåket på en daglig basis. Dyrene ble avlivet før endepunktet i studien dersom de opplevde mer enn 45% vekttap eller akutte helseproblemer og mottatt supplerende diett av mushed pellet eller gel diett (Nutra-Gel S5769, BioServ) hvis vekttap nådd mer enn 25%. Rotter ble avlivet 40 uker etter operasjonen gjennom karbondioksid innånding for histologisk evaluering. Dyrene ble planlagt å motta MRI og endoskopi på 32, 36 og 40 uker postoperativt.
Gross bilde av esophageal tumor (dyr nr. 13) indusert av modifisert Levrat modell.
endoskopisk Assessment
Mat og vann ble begrenset fra dyr i 2-6 timer før endoskopisk evaluering og i 2-4 timer etter inngrepet. Rotter ble bedøvet med isofluorane ved 5% og 2% induksjon og vedlikehold, respektivt. Dyrene ble intubert ved hjelp av en justert 16-gauge venekateter, for å opprettholde luftveiene under endoskopi, men ble ikke ventilert. Rotter ble plassert liggende på en vann-oppvarmet kirurgisk sengen for å opprettholde kroppstemperaturen under evaluering og en nese kjegle ble sikret ved hjelp av maskeringstape over intubasjon tube. Visual endoskopisk Evalueringen ble utført av hele spiserøret ved hjelp av en mini-rigid, fiberoptisk lyskilde Hopkins II Fremtids Oblique Telescope 30 ° (diameter 1,9 /2,1 mm, lengde 19 cm), og biopsiprøver ble oppnådd ved hjelp av en mm klype miniatyr biopsitang med dobbel-action kjever (Karl Storz, Tuttlingen, Tyskland). Luft ble innført gjennom sideporten til endoskop for å hjelpe til visualisering av distal spiserøret. Fire biopsier ble oppnådd i løpet av hver evaluering, to for histologisk evaluering og to for molekylær korrelerer analyse. Alle endoskopiske evalueringer ble registrert ved hjelp av en digital videoopptaker (AIDA HD Connect DVD, Karl Storz, Tuttlingen, Tyskland). Etter endoskopisk evaluering, ble dyrene injisert intramuskulært for dag 0 til 3 med ketoprofen (3 mg /kg) og Enrofloxacin (5 mg /kg) i et forsøk på å redusere ubehag og hindre luftveisinfeksjon fra aspirasjon. Dyrene ble også plassert på en tre dagers endret kosthold progresjon fra gel diett for å mushed pellet kosthold til vanlig pellet kosthold, henholdsvis.
MR Analyse
Alle MRI evalueringene ble utført innen 24 timer etter endoskopisk analyse . Dyrene ble bedøvet med isofluorane ved 5% induksjon og 2% vedlikehold gjennom nesepartiet. Rotter ble plassert liggende på MR bordet og sikret. En liten trykk ballong ble plassert under brysthule å overvåke respirasjonsfrekvens og 2-lead EKG elektroder ble plassert på venstre foran og høyre bak potene for å overvåke puls (MR-kompatibel Modell 1030 Overvåking og gating System, Small Animal Instruments, Inc., Stony-Brook, New York). MR med en T2-vektet luftstyrte turbo spin-ekko (TSE) sekvens med et ekko tid (TE) av 27 millisekunder og repetisjon tid (TR) på ca. 1200-1800 msek ble utført ved hjelp av et lite dyr 7 T ClinScan MR (Bruker) benytter Siemens MR-grensesnitt (versjon VB15A). MR-bilder ble kjøpt i både aksiale og koronale fly. Anskaffelsestiden var 9-10 min per fly.
Histologisk Bearbeiding og Patologisk Evaluering
Snitt oppnådd for histologiske formål og for å evaluere molekylære korrelater ble hurtigfrosset i oktober forbindelse (Tissue-Tek) og i RLT-buffer (Qiagen), respektivt. Dyrene ble avlivet umiddelbart etter ferdigstillelse av endelig endoskopisk og MRI evalueringene. Ved obduksjon ble hele spiserøret og jejunum omtrent 1 cm distalt til anastomose oppsamlet og åpnet i lengderetningen for visuell inspeksjon og fjerning av gjenstanden før prøvene ble innleiret i oktober og hurtigfrosset. Vevssnitt ble kuttet (5 mm) fra OCT blokker og farget i hematoxylin og eosin (fig. 2). To uavhengige erfarne patologi eksperter utføres histologisk analyse. Prøver der enighet ikke ble nådd, samt svulster som ikke er synlige på brutto undersøkelse (ikke-utstående; 1 mm diameter) ble ekskludert
A, Hemotoxylin og eosin farging (forstørrelse × 10) viser histologisk bekreftelse. av EAC. B, Endoskopisk evaluering av den samme rotte. Arrow betegner mistenkte området av svulst identifisert av endoskopiske deltagerne. C, Axial MR vurdering. Pilen viser en unormal masse på esophageal veggen valgt av MRI deltagerne. D, koronal MR bilde. Pilen angir tilsvarende tverrsnitt av mistenkte tumor i anastomotisk område av interesse. MR; magnetic resonance imaging, EAC; esophageal adenokarsinom.
Design av Blindet Tolkning Study
Endoskopi.
endoskopisk videoene ble redigert ved hjelp av QuickTime Player (versjon 10.1, Apple Inc.) til å omfatte fullstendig visualisering av distal spiserøret (fig. 2). Videoer ble kuttet for å utelukke biopsi scener, for ikke å skjevhet observatøren til potensielle områder av interesse. Alle videoer ble importert til en lysbildeserie i tre eksemplarer, randomisert og avidentifisert (PowerPoint 2010, Microsoft). Umiddelbart før undersøkelsen ble esophageal kirurgiske endoscopists og gastroenterologer presentert med en tutorial som beskriver den kirurgiske modell, mål av studien, og klassifisering av overflateslimhinne mønstre. Endoskopiske egenskaper ble beskrevet som følgende:
normal Anmeldelser – preget av glatt overflate og selv farge;
øsofagitt Anmeldelser – karakterisert ved forhøyede plaketter og rygger og ugjennomsiktig farge med sårvæske;
Barrett’s-like-tarm-metaplasi Anmeldelser – preget av selv-dukket laksefargede flekker;
kreft Anmeldelser – preget av uregelmessige forhøyede masser og /eller sårdannelse. Observatører ble instruert til grad hver video som positiv eller negativ for kreft. I tillegg observatører ble bedt om å manuelt sirkel mistenkt områder av positiv tumor i videoen for første tre eksemplarer undergruppe ved hjelp av PowerPoint Ink Tools. Alle lysbildeserier ble registrert for å bevare merknader.
MR.
Alle MR DICOM-bilder ble overført til OsiriX (versjon 4.1, Pixmeo Sari) i tre eksemplarer, randomisert og avidentifisert for blindet studie evaluering. Deltakerne i studien ble presentert med en tutorial som beskriver den kirurgiske modell, mål av studien, og klassifisering av patologi som følger:
normal Anmeldelser – selv tykkelse på esophageal veggen fra proksimale til distal spiserøret;
benign striktur Anmeldelser – økning i tykkelsen på esophageal veggen i distal spiserøret med glatte grenser; – Ujevn økning i esophageal veggen som resulterer i uregelmessig masse. Radiolog eksperter ble bedt om å tolke MR-bilder korrelerte i aksiale og koronale fly og posten positiv eller negativ for kreft (fig. 2). I tillegg ble deltakerne bedt om å sirkle mistenkte områder av svulst på de aksiale bildene for første tre eksemplarer undergruppe. Alle bilder med merknader ble reddet.
Statistical Analysis
Prosent avtalen ble beregnet som totalt antall ganger rater avtalt med histologi delt på totalt antall målinger gjennomført. Cohen kappa ble brukt som et mål på avtale mellom et individ rater og histologiske diagnoser (f.eks positiv eller negativ kreft). Kappa verdier ble vurdert som følger: 0 representerer ingen enighet; mellom 0,01 til 0,20 representerer liten enighet; mellom 0,21 til 0,40, rettferdig avtale; mellom 0,41 til 0,60, moderat enighet; mellom 0,61 til 0,80 betydelig enighet; og mellom 0,81 til 0,99 utmerket avtalen [23]. Den intra korrelasjonskoeffisient (ICC) ble brukt til å beregne inter- og intra-rater reliabilitet for svulst nærvær /fravær laget av esophageal kirurgiske endoscopists og gastroenterologer visning endoskopi videoer og av radiologer lese MR. ICC kan variere fra 0 (ingen avtale) til 1 (helt enig). Økende ICC for både inter- og intra-rater reliabilitet indikerer økende enighet. Fem individuelle raters lese hver rotte tre ganger for MR. Fem forskjellige raters lese hver rotte tre ganger for endoskopi. En konsensus lesing (≥2 /3) ble bestemt for hver rater og hver rotte. Et gjennomsnitt av alle konsensus ratings for alle raters ble bestemt for hver modalitet. Følsomhet, spesifisitet, og falske negative og falske positive verdier ble beregnet ved hjelp histologi som referansestandard. En mottaker drift karakteristikk (ROC) kurve ble laget for MRI og endoskopi ved hjelp av gjennomsnittlig konsensus vurdering som testvariabel og histologi som tilstandsvariabel. En p-verdi 0,05 ble ansett for å indikere statistisk signifikans. Data ble analysert ved hjelp av PASW Statistics, versjon 18.0 (IBM-SPSS, Inc., Chicago).
Resultater
Rotter og histologi
En kohort av 38 dyr, som har gjennomgått den modifiserte Levrat kirurgi, ble valgt til å motta endoskopisk og MR-evaluering ved 32, 36 og 40 uker etter operasjonen. Ti dyr ble fjernet fra undersøkelsen på grunn av foreløpige død (26,3%). Obduksjon ble dannet på alle dyr og dødsårsaker inkludert: vekttap (n = 5), akutt luftveisinfeksjon (n = 2), og ukjent (n = 3). Den rapporterte dødelighet og tilhørende dødsårsaker var i samsvar med tidligere rapporterte studier utnytte Levrat modell [13].
Histologisk evaluering ble utført på alle resterende 28 studieprøver og verifisert av en uavhengig observatør. Prøvene hvor konsensus ikke kan nås på histologi (n = 5) og mikroskopiske tumorer (n = 4) ble fjernet fra studiekohorten, noe som resulterer i en endelig studie prøve av 19 dyr. Av de 19 dyr, ble 57,9% rapportert å ha EAC (n = 11). Det var ingen signifikant sammenheng mellom endoskopiske biopsier og post-mortem histologi (data ikke vist), som de fleste prøvene var vanskelige leser grunn til å knuse gjenstand, utilstrekkelig dybde eller ubestemt orientering.
Endoskopisk Analyse
av de 5 blindet deltagerne, prosentavtale med histologi varierte mellom 42,1% -57,9%, med et gjennomsnitt avtale på 50,5% (fig. 3). Kappa verdier for enkelte raters falt mellom -0.044-0.165, og ingen evalueringer nådde statistisk signifikans (p-verdi 0,05) (tabell 1). 47,37% av søkene kunne leses med minst 80% nøyaktighet (9/19) (Fig. 3). Intra-rater reliabilitet ICC’er varierte mellom 0,667 til 0,873 blant tredoble skanner; mens inter-rater ICC var 0,608. ROC-kurve analyse produsert et område under kurven (AUC) på 0,534 (SE = 0,138; asymptotisk betydning = 0,804; 95% konfidensintervall, 0,263 til 0,805) (Fig. 4). Følsomhet for endoskopi var 0,455 (95% konfidensintervall, 0,323 til 0,586), spesifisitet var 0,575 (95% konfidensintervall, 0,422 til 0,728) og diagnostisk nøyaktighet (effektivitet) var 0,505 (95% konfidensintervall, 0,405 til 0,606). Gjennomsnittlig falske positive og gjennomsnittlige falske negative priser var 0,425 (95% konfidensintervall, 0,272 til 0,578) og 0,546 (95% konfidensintervall, 0.0.414-0.679), henholdsvis. Selv når 5/5 endoskopi evaluatorer vurdert en svulst som positiv, var det en 40% falsk positiv rate
En viser Grafen prosent nøyaktighet av enkelt skanner når vurderes av hver teknikk. Visuell endoskopi og MR. B, sammen Grafen gjennomsnittlige nøyaktigheten av hver teknikk som vurderes av blindet studie. MR; magnetic resonance imaging
A, ROC kurve av gjennomsnittlig endoskopisk lesing. (AUC = 0,534; SE = 0,138; asymptotic betydning = 0,80; 95% konfidensintervall, 0,263 til 0,805). B, ROC kurve av gjennomsnittlig MR lesing. (AUC = 0,966; SE = 0,036; asymptotic betydning 0,001; 95% konfidensintervall, 0-1,0). ROC; mottaker drift karakteristikk, AUC; Arealet under kurven, SE; standard feil.
MR Evaluering
Prosent avtale med histologi MR deltakerne varierte mellom 78,95% -94,7% med et gjennomsnitt avtale på 85,3% (Fig. 3) og kappa verdier av individuelle priser mellom 0,553 til 0,890. Alle raters nådde statistisk signifikans (p-verdi 0,05) (tabell 1). 78,95% av søkene kunne leses med minst 80% nøyaktighet (15/19) (fig. 3). Intra-rater reliabilitet ICC’er blant tredoble skanner falt mellom 0,315 til 0,785 og inter-rater ICC var 0,624. ROC kurven analyse bestemmes en AUC på 0,966 (SE = 0,035; asymptotic betydning 0,001; 95% konfidensintervall, 0 til 1,00) med følsomhet på 0,891 (95% konfidensintervall, 0,809 til 0,973), spesifisitet av 0,800 (95% konfidensintervall intervall, 0,676 til 0,924), og effektiviteten av 0,853 (95% konfidensintervall, 0,781 til 0,924) (fig. 4). Gjennomsnittlig falske positive og falske negative priser var 0.200 (95% konfidensintervall, 0,076 til 0,324) og 0,109 (95% konfidensintervall, 0,027 til 0,208), henholdsvis. Med en gjennomsnittlig MR rating på 0,80 eller høyere (4/5 eller 5/5 karakterer positive for svulst), ble MR gjennomsnittlig rangering kjent for å være forutsigbare for svulst uten falske positiver.
Diskusjoner
Letingen etter nye behandlingsmetoder for EAC har blitt svært viktig i de senere år med økning av pasienter med spiserørskreft. [24], [25]. Siden MRI hadde nylig blitt benyttet med hell i små dyr translasjonelle modeller for andre typer kreft [20] – [22], forsøkte vi å teste evnen av MRI til effektivt å diagnostisere esophageal tumor i Levrat modellen i forhold til endoskopi. Som nevnt, har vi funnet MR for å være en meget holdbar og pålitelig metode for påvisning av esophageal tumorer i forhold til endoskopi. Selv endoskopisk evaluering har sine egne fordeler, i vår studie, biopsier kunne ikke gi pålitelig histologi grunn av den lille størrelsen på utvalget og komplisert orientering.
Når sammenlignet med endoskopisk evaluering, ble MRI kjent for å være overlegen i deteksjon av adenokarsinom på alle nivåer, inkludert nøyaktighet, følsomhet, spesifisitet og effektivitet. Inter-observatør konsensus var også høyere for MRI indikerer fremtidige evalueringer vil trolig produsere lignende resultater. Intra-observatør enighet blant tredoble målinger var den eneste variabelen hvor endoskopiske verdier representerte en høyere rekkevidde, noe som indikerer økt konsensus blant endoskopiske målinger. Likevel, MR med de laveste nivåene av intra-observatør enighet var i samsvar med skanner produsere laveste nøyaktighetsnivåer, noe som indikerer variasjon var stort sett begrenset til vanskelige skanninger. Det var fire tilfeller hvor gjennomsnittlig nøyaktighet på MR ble nevnt å være under 80%. I tre av tilfellene, tolkningen var vanskelig på grunn av tilstedeværelsen av en byll på anastomosestedet eller magen; mens det i det fjerde tilfelle var det betydelig bevegelseseffekt.
Den ikke-invasive karakter av MRI, dens evne til å nøyaktig identifisere kreft, og inkorporering i Levrat modellen gjør det modaliteten enda mer anvendelig for å vurdere nye agenter og deres effekt på behandlingsstudier. Den høye nøyaktighet og lav falske positive indikere MR ville være en pålitelig metode for å skille kreft vs. ingen kreftbehandling armer med minimal feil. I tillegg vil den lave falsk negativ rente også bidra til å maksimere effektiviteten og minimere mengden dyr som trengs for en bestemt protokoll. På den annen side, endoskopi ga en 40% falske positive, selv når alle endoskopiske eksperter enige svulst var til stede. Derfor ville visuell endoskopi være en dårlig discriminator av tumorstatus for en slik studie.
Begrensninger av vår studie omfatter den lille utvalgsstørrelsen. I tillegg, selv om den spesifikke sekvens anvendt i denne studien var i stand til nøyaktig å detektere nærværet av svulsten, hele volumet av mistenkelige masser er ikke kvantifisert på grunn av den iboende to-dimensjonal karakter av TSE skanningen. Fremtidige studier kan ha nytte av en 3-dimensjonal skanning. En 3-D MR-sekvens integrerer den aksiale, koronale og sagittale plan for å muliggjøre nøyaktig volumetrisk kvantifisering av anatomiske trekk. I den skisserte modell, kan en 3-D MR bli anvendt for å analysere effekten i en behandlingsmodell ved å gi tumorvolumet før og etter behandling. Utnyttelse av kontrastmidler for å forbedre den anastomotic område av interesse og skille svulst vil ytterligere øke nøyaktigheten av denne modalitet.
Takk
Forfatterne vil også gjerne takke University of Pittsburgh Cancer Institute, spesielt Erik Weiner, Paul Schornack, og Michael K. Gibson for deres støtte i vårt arbeid.
