Abstract
En funksjonell rs4245739 A C enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) å finne i
MDM4
3′-uoversatt (3′-UTR) region skaper en MIR-191-5p eller MIR-887-3p målretting nettsteder. Denne endringen fører til redusert uttrykk av onkogen
MDM4
. Derfor undersøkte vi sammenhengen mellom denne SNP og småcellet lungekreft (SCLC) risiko så vel som dens regulerende funksjon i SCLC celler. Genotypene ble bestemt i to uavhengige case-control sett besto av 520SCLC saker og 1040 kontroller fra to regioner i Kina. Odds ratio (ORS) og 95% konfidensintervall (CIS) ble beregnet ved logistisk regresjon. Virkningen av rs4245739 SNP på MIR-191-5p /MIR-887-3p mediert
MDM4
uttrykk forskriften ble undersøkt ved hjelp av luciferasereportergenet analyser. Vi fant at
MDM4
rs4245739AC og CC genotyper var signifikant assosiert med redusert SCLC følsomhet sammenlignet med AA genotype i begge kasus-kontrollsett (Shandong satt: OR = 0,53, 95% CI = 0,32 til 0,89,
P
= 0,014, Jiangsu sett: OR = 0,47, 95% CI = 0,26 til 0,879,
P
= 0,017). Stratifiserte analyser indikerte at det var en betydelig multiplikativ samspill mellom rs4245739 og røyking (
P
interactioin = 0,048). Etter co-transfeksjon av miRNAs og annen allelic-
MDM4
reporter konstruerer inn SCLC celler, fant vi at både MIR-191-5p og MIR-887-3p kan føre til betydelig redusert
MDM4
uttrykk aktiviteter i konstruksjonen med C-allel 3′-UTR men ikke A-allel 3′-UTR, noe som tyder på en konsistent genotype-fenotype korrelasjon. Våre data belyse at
MDM4
rs4245739SNP bidrar til SCLC risiko og støtte tanken om at genet 3′-UTR genetiske varianter, påvirker miRNA-binding, kan modifisere SCLC mottakelighet
Citation. Gao F Xiong X, Pan W, Yang X, Zhou C, Yuan Q, et al. (2015) En Regulatory
MDM4
genetisk variant Finne i Binding Sekvens av flere microRNAs Bidrar til Følsomhet av småcellet lungekreft. PLoS ONE 10 (8): e0135647. doi: 10,1371 /journal.pone.0135647
Redaktør: Yifeng Zhou, Medical College of Suzhouuniversitetet, KINA
mottatt: 18 mars 2015; Godkjent: 24 juli 2015; Publisert: 14. august 2015
Copyright: © 2015 Gao et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering: studien ble støttet med tilskudd fra National Natural Science Foundation i Kina. (tilskudd nummer: 31271382 81201586; URL: https://www.nsfc.gov.cn/) ; National High-Tech Research and Development Program of China (tilskudds tall: 2015AA020950; URL: https://www.most.gov.cn/); de grunnleggende forskning Midler til de sentrale universiteter (stipend nummer: YS1407; URL: https://www.moe.edu.cn/); Beijing Higher Education Young Elite Lærer Project (tilskudds tall: YETP0521; URL: https://www.bjedu.gov.cn/); og Program for Changjiang Scholars og Innovativ Research Team i University (tilskudds tall: IRT13045; URL: https://www.moe.edu.cn/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er de viktigste årsakene til kreft dødsfall i verden, med flere than1,000,000 dødsfall per år [1]. Lunge cancer blir vanligvis klassifisert som små-celle lungecancer (SCLC) og ikke-små-celle lungekreft (NSCLC). Selv sto for bare rundt tjue prosent av alle lungekreft tilfeller er SCLC mye mer aggressiv i forhold til NSCLC [2,3]. Som en malignitet med dårlig prognose viser SCLC høy vekst brøkdel, rask dobling tid, og tidlig utvikling av utbredt metastaser [2,3]. Når diagnosen, de fleste SCLC pasienter har metastaser og dårlig prognose hvis den forblir ubehandlet [3]. Akkumulerte epidemiologiske bevis tyder på at tung tobakksrøyking er en hoved miljørisiko-faktor på denne sykdommen [2,3]. Siste utvikler på genomassosiasjonsstudier (GWAS) har avdekket at flere nye genetiske variasjoner er assosiert med lungekreft mottakelighet [4-12]. Men de fleste studiene undersøkte både lungekreft undergrupper eller bare fokusert på NSCLC. Interessant, de fleste av identifiserte risiko loci ikke signifikant påvirker risikoen for lungekreft forskjellig ved histologi, noe som indikerer at det kan være forskjellig genetisk sminke påvirker risikoen for SCLC eller NSCLC [4-12]. Derfor kan oppdagelsen av nye SCLC-risiko-forbundet SNPs være en potensielt verdifull vei mot å belyse etiologi SCLC.
MDM4, også kjent som MDMX eller HDMX, er et strukturelt homolog protein av MDM2. MDM4 aksjer en NH
2-terminal P53-bindende domene med MDM2 og kan hemme virksomheten til P53 i forskjellige maligniteter [13-17]. Som vokter av menneskelige genom, til P53 funksjoner i sentrum av et komplekst molekyl nettverk mekle svulst undertrykkelse. Som velkjent onkogen, overuttrykt MDM4 i humane tumorer, inkludert lungekreft førte til deprimerte P53 aktiviteter og, således, tumorigenesis. I tråd med dette, musemodell med overuttrykt MDM4 via transgene teknologi viste spontan kreftutvikling i løpet av sin levetid [18].
Det er en
MDM4
3′-untranslatedregion (3′-UTR) rs4245739A . C genotyper som beskrevet i detalj tidligere [22,25,26]. I korte trekk primere anvendt for å amplifisere DNA-segmenter med rs4245739 området (mismatch basen er understreket) ble 5′-AAGACTAAAGAAGGCTGGGG-3 «og 5′-TTCAAATAATGTGGTAAGTGACC-3». Restriksjonsenzym
MSP
I (New England Biolabs) ble brukt til å fordøye PCR-produktene, og skille de rs4245739 genotyper. En 10% tilfeldig prøve ble undersøkt ved gjensidig annen person, og reproduserbarheten var 98,7%. I tillegg en 5% stikkprøver ble også testet via Sanger-sekvensering, og reproduserbarhet var 100%.
Plasmid bygging
MDM4
rs4245739A og rs4245739C allele reporter konstruksjoner var utarbeidet ved å forsterke en del av
MDM4
3′-UTR regionen fra fagene homozygote for rs4245739AA eller rs4245739CC genotype. PCR-primere som ble anvendt var som følger: 5′-AACTCTAGAGGTAGTACGAACATAAAAATGC-3 «og 5′-AACTCTAGACTGCATAAAGTAATCCATGG-3», som inkluderer
Xba
-restriksjonssete (understreket sekvenser). PCR-produktene ble spaltet med
Xba
I (New England Biolabs) og ligert, respektivt, inn i en passende spaltet pGL3-kontroll-vektor (Promega). Konstruksjonene ble betegnet aspGL3-rs4245739A og pGL3b-rs4245739C, henholdsvis. Innleggene ble bekreftet ved DNA-sekvensering.
Dual luciferasereportergenet analysen
En ildflue luciferase reporter plasmid (pGL3-kontroll, pGL3-rs4245739A eller pGL3-rs4245739C), en Renilla luciferase vektor (PRL -SV40, Promega) pluss 30 nMsmall RNA (MIR-191-5p ligner, MIR-887-3p etterligner eller negativ kontroll RNA) (Genepharma, Guangzhou, Kina) var co-transfektert inn SCLCH446 celler med Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Luciferase-aktivitet ble bestemt ved 48 timer etter transfeksjon ved bruk av et luciferase-analysesystemet (Promega) som beskrevet tidligere [27-29]. Tre uavhengige eksperimenter ble utført transfeksjon og hver ble utført i tre eksemplarer. Dobling ble beregnet ved å definere aktiviteten til tom pGL3-kontroll vektor som 1.
Statistiske analyser
Som beskrevet i detalj tidligere [22, 30-32], forskjeller i demografiske variabler og genotypen distribusjoner av
MDM4
rs4245739 SNP mellom SCLC saker og kontroller ble beregnet ved hjelp av Pearsons χ
2 test. Sammenhenger mellom
MDM4
rs4245739 genotyper og SCLC risiko ble beregnet ved odds ratio (OR) og deres 95% konfidensintervall (CIS) beregnet ved hjelp ubetinget logistisk regresjonsmodell. Alle Ors ble justert for alder, kjønn og røykestatus, der det var hensiktsmessig. Vi testet nullhypotese av multiplikativ gen-kovariat samhandling og evaluert avganger fra multiplikative samhandlingsmodeller ved å inkludere hovedeffektvariabler og deres produkt vilkår i den logistiske regresjonsmodellen [30-32]. Et
P
-verdi på mindre enn 0,05 ble brukt som kriterium for statistisk signifikans, og alle statistiske tester var tosidig. Alle analyser ble utført med SPSS programvarepakke (versjon 16.0, SPSS Inc., Chicago, IL).
Resultater
Alleliske frekvenser og genotype distribusjoner av
MDM4
rs4245739SNP
median alder var 57 år (range, 25-82 år for Shandong sett; range, 23-79 år for Jiangsu sett) for pasientene og 57 år (range, 19-80 år for Shandong sett, rekkevidde, 20-81 år for Jiangsu sett) for kontrollene (Shandong satt:
P
= 0,615, Jiangsu sett:
P
= 1,000). Det var ingen signifikant forskjell mellom saker og kontroller i kjønnsfordeling (Shandong satt: 78.4% menn incases vs. 76,4% hos kontrollene;
P
= 0.480, Jiangsu sett: 74,0% menn incases vs. 71,3% i kontroller ;
P
= 0,479). Dette indikerer at frekvenstilpasning var tilstrekkelig (tabell 1). Imidlertid ble flere røykere blant SCLC pasienter funnet i Shandong case-control sett sammenlignet med kontrollpersoner (Shandong sett: 77,8% vs. 34,2%,
P
0,001). Tilsvarende er det flere SCLC pasienter som røyker enn kontrollene i Jiangsu sett (78,5% vs. 21,5%,
P
0,001). I tillegg ble det observert flere pasienter med begrenset sykdom enn blant de med omfattende sykdom i to sett (Shandong sett: 56,9% vs. 43,1%, Jiangsu sett: 56,5% vs. 43,5%).
Som vist i tabell 2, frekvensen for
MDM4
rs4245739 C allel var 0,038 og 0.073among SCLC pasienter og friske kontroller fra Shandong sett, og 0,043 og 0,101 fra Jiangsu sett. Alle observerte genotypefrekvensene i begge SCLC tilfeller og kontroller i samsvar med Hardy-Weinberg likevekt. Utdeling av disse
MDM4
genotyper ble deretter sammenlignet blant SCLC saker og kontroller. Frekvensen av
MDM4
rs4245739 AA og AC eller CC genotyper blant pasienter var signifikant forskjellig fra de blant kontrollene i Shandong sett (χ
2 = 10,70,
P
= 0,005,
df
= 2) (tabell 2). Tilsvarende frekvensene av
MDM4
rs4245739 AA og AC eller CC genotyper blant tilfellene var signifikant forskjellig fra de blant kontrollpersoner i Jiangsu sett (χ
2 = 12,84,
P
= 0,002
df
= 2) (tabell 2).
Association mellom
MDM4
rs4245739SNP og SCLC risiko
foreninger mellom genotyper av
MDM4
rs4245739 A C polymorfisme og SCLC risiko ble beregnet ved hjelp av selvskyldnerlogistisk regresjon (tabell 2). Som vist i tabell 2,
MDM4
rs4245739 C allel fungerer som et beskyttende allel av SCLC. Individer med AC genotype hadde en OR på 0,52 (95% CI = 0,31 til 0,87,
P
= 0,013) for utvikling av SCLC, sammenlignet med personer med AA genotype. Betydelig redusert SCLC risiko ble også observert blant rs4245739 AC eller CC bærere forhold til AA bærere (OR = 0,53, 95% CI = 0,32 til 0,89,
P
= 0,014). De sammenslutninger av SCLC risiko med
MDM4
rs4245739SNP ble ytterligere bekreftet i en uavhengig Jiangsu case-control sett. En betydelig redusert SCLC risiko var også assosiert med rs4245739 (AC: OR = 0,48, 95% CI = 0,26 til 0,88,
P
= 0,019, AC eller CC: OR = 0,47, 95% CI = 0,26 til 0,87
P
= 0,017). I de samlede analysene, fant vi at rs4245739 AC genotype hadde en 0,49-folddecreased risiko for SCLC sammenlignet med AA genotype (95% CI = 0,32 til 0,75,
P
= 0,001), og rs4245739 AC eller CC genotype hadde en 0,50-folddecreased risiko sammenlignet med AA genotype (95% CI = 0,32 til 0,76,
P
= 0,001) (tabell 2). Alle Ors ble justert for kjønn, alder og røykestatus.
Vi har undersøkt SCLC risiko forbundet med
MDM4
rs4245739genotypes av stratifisering for alder, kjønn, røykestatus og sykdom stadium ved å bruke felles videre data fra to kinesiske kasus-kontrollsett (tabell 3). I stratifisert analyser med alderen, ble rs4245739AC og CC genotyper signifikant assosiert med redusert risiko hos personer i alderen 57 år eller yngre (OR = 0,40, 95% CI = 0,21 til 0,74,
P
= 0,003), men ikke i fag i alderen eldre enn 57 år (OR = 0,63, 95% CI = 0,35 til 1,15,
P
= 0,134). Det var ingen signifikant gen-alder interaksjon (
P
interaksjon = 0,274). En betydelig redusert risiko for SCLC var assosiert med AC og CC genotyper bare blant kvinner (OR = 0,33, 95% CI = 0,15 til 0,74,
P
= 0,007), men ikke blant menn (OR = 0,63, 95 % CI = 0,38 til 1,06,
P
= 0,083), sammenlignet med
MDM4
rs4245739 AA genotype. Ingen signifikant gen-sex interaksjon ble observert (
P
interaksjon = 0,135). Vi fant ikke signifikant redusert risiko (OR = 0,73, 95% CI = 0,42 til 1,28,
P
= 0,274) for operatører med AC og CC genotyper sammenlignet med personer med AA genotype hos røykere. Men thers4245739AC og CC genotyper gjorde viser en 0,30 ganger redusert risiko for å utvikle SCLC (95% CI = 0,14 til 0,64,
P
= 0,002) sammenlignet med AA genotype i røykere. En multiplikativ gen-røyk interaksjon eksisterte (
P
interactioin = 0,048). ble observert assosiasjoner mellom rs4245739 AC og CC genotyper og SCLC risiko både for pasienter med begrenset stadium sykdommen (OR = 0,52, 95% CI = 0,32 til 0,84,
P
= 0,008) eller omfattende stadium sykdommen (OR = 0,48, 95% CI = 0,24 til 0,97,
P
= 0,040) (tabell 3).
Funksjonell relevans ofrs4245739 på miRNA-mediert
MDM4
regulering
SNPrs4245739A C kan føre til høyere affinitet mellom MIR-191-5p /MIR-887-3p og
MDM4
mRNA og redusert
MDM4
uttrykk i flere maligniteter [19 -22]. Men dens virkninger på
MDM4
regulering i SCLC er fortsatt uklart. Som et resultat, undersøkte vi om det er et allel-spesifikk effekt av rs4245739polymorphismon
MDM4
uttrykk i SCLC celler ved MIR-191-5p og MIR-887-3p. Relative luciferaseekspresjon analyser indikerte at Mir-191-5p kan betydelige lavere luciferasepreparater aktiviteter i SCLC H446 celler transfektert med rs4245739C allele reporter konstruksjoner i forhold til negative kontroll RNA (
P
= 0,003) (fig 1). Tilsvarende MIR-887-3p regulerer også
MDM4
3′-UTR region med betydelig lavere luciferasepreparater aktiviteter i H446 celler som uttrykker rs4245739C allele konstruksjoner i forhold til negative kontroll RNA (
P
= 0,014) ( Figur 1). Men det var ingen slik depresjon i H446 celler med transfeksjon av rs4245739A allel reporter konstruerer av begge mirnas ligner (fig 1).
H446 celler ble transfektert med PRL-SV40 å standardisere transfeksjon effektivitet. Gangers økning ble målt ved å definere aktiviteten av celler ko-transfektert med både pGL3-rs4245739A eller pGL3-rs4245739Creporter konstruere og NC-RNA som 1. Alle forsøk ble utført in triplo i minst tre uavhengige eksperimenter transfeksjon, og hver verdi representerer gjennomsnitt ± SD . *
P
0.05compared med hver av luciferase konstruksjon av
t
-UNDERSØKELSER. NC-RNA, negativ kontroll RNA; SCLC, småcellet lungekreft.
Diskusjoner
I denne studien undersøkte vi sammenhengen mellom
MDM4
rs4245739 funksjonelle SNP og SCLC risiko via en sak -kontroll tilnærming. Vi observerte at personer med
MDM4
rs4245739 AC eller CC genotyper viser betydelig redusert SCLC risiko sammenlignet med AA genotypen bærere. For å avdekke MIR-191-5p /MIR-887-3p mediert allel-regulering av denne SNP, undersøkte vi luciferase aktiviteter i SCLC celler transfektert med forskjellige allel reporter konstruksjoner. Den genotype-fenotype korrelasjon analyser indikerte at begge mirnas kunne hemme
MDM4
uttrykk bare i SCLC celler med C-allelet konstruksjoner uttrykk, men ikke A-allel konstruksjoner. Disse resultatene markere involvering av funksjonelle genetiske varianter i miRNA-bindingsseter i SCLC etiologi.
Akkumulert bevis vist at genetiske sammensetningen kan ha direkte bidrag til SCLC risiko [33-35]. Interessant, med henvisning til de databaser av genuttrykk profil for å identifisere gener som er deregulert i SCLC og deres SNPs i 3′-UTR, Xiong et al identifisert en SCLC mottakelighet SNP rs3134615 G T kan hemme interaksjonen mellom MIR-1827 med
MYCL1
3′-UTR, noe som resulterer i høyere konstitutiv ekspresjon av MYCL1 [35]. I samsvar med denne oppfatningen, fant vi også et
MDM4
3′-UTR SNP målrettet av mirnas er assosiert med SCLC mottakelighet.
MDM4
rs4245739 polymorfisme viste en konsekvent sammenheng med SCLC risiko intwo uavhengige kasus-kontrollsett, som er usannsynlig å være knyttet til ukjente konfunderende faktorer grunn til å ha betydelig økt oddsratioet med små
P
verdier. I tillegg genotype-fenotype forhold mellom rs4245739 polymorfisme og reportergenekspresjon støtter vår konklusjon. Videre er
MDM4
rs4245739 SNP kan være en felles genetisk risiko komponent for ulike kreftformer, som har blitt bevist av vår gruppe og andre via enten kandidat genet tilnærming eller GWAS [19-26]. For eksempel, vi tidligere funnet at rs4245739 AC og CC genotyper var signifikant assosiert med redusert risiko for spiserørskreft [22], en malignitet med lignende miljø etiologi av SCLC (dvs. tunge røyking). Men det kan være flere begrensninger i dagens case-control studie. For eksempel, siden alle SCLC saker ble rekruttert fra sykehuset, kan iboende utvalgsskjevhet eksisterer. Derfor funnene i vår studie garanterer å få den godkjent i en populasjonsbasert prospektiv studie i fremtiden. Relativt liten utvalgsstørrelse for ikke-røykere bør analyseres videre i en større befolkning.
I sammendraget, våre resultater antydet at funksjonell
MDM4
rs4245739 SNP var assosiert med en signifikant redusert SCLC risiko i kinesisk Han populasjoner. Assosiasjoner mellom SNPs og SCLC risiko er bemerkelsesverdig i røykere. Gitt dette faktum, er ytterligere innsats for å undersøke om
MDM4
rs4245739 genetisk polymorfisme kan brukes som en diagnostisk markør for SCLC.
