Abstract
α-Tomatine, en tomat glycoalkaloid, har blitt rapportert å ha antibiotiske egenskaper mot humane patogener. Imidlertid er mekanismen for dets virkning mot leukemi er fortsatt uklar. I denne studien ble det terapeutiske potensialet i α-tomatine mot leukemiceller evalueres
in vitro Hotell og
in vivo
. Celleviabilitet Forsøkene viste at α-tomatine hadde signifikante cytotoksiske effekter på de humane leukemicancercellelinjene HL60 og K562, og cellene ble funnet å være i det Annexin V-positive /propidiumjodid-negative fase av celledød. I tillegg α-tomatine indusert både HL60 K562 og celle apoptose i en celle cycle- og caspase-uavhengig måte. α-Tomatine eksponering førte til et tap av mitochrondrial membranpotensiale, og dette funnet var i samsvar med det som ble observert på aktivering av Bak og Mcl-en kortform (MCL-1s) proteiner. Eksponering for a-tomatine også utløste utgivelsen av apoptose-induserende faktor (AIF) fra mitokondriene inn i kjernen og nedregulert Survivin uttrykk. Videre α-tomatine inhiberte signifikant HL60 xenograft tumorvekst uten å forårsake tap av kroppsvekt i alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) mus. Immunhistokjemisk testen viste at den reduserte tumorvekst i den α-tomatine-behandlede mus var et resultat av økt apoptose, som var assosiert med øket translokasjon av AIF i kjernen og redusert Survivin uttrykk
ex vivo
. Disse resultatene tyder på at α-tomatine kan være en kandidat for leukemi behandling
Citation. Chao MW, Chen CH, Chang YL, Teng CM, Pan SL (2012) α-Tomatine-mediert Anti-Cancer aktivitet
In vitro Hotell og
In Vivo
gjennom Cell Cycle- og caspase-Uavhengige Pathways. PLoS ONE 7 (9): e44093. doi: 10,1371 /journal.pone.0044093
Redaktør: Ferenc Gallyas, Universitetet i Pecs Medical School, Ungarn
mottatt: 13 februar 2012; Godkjent: 30 juli 2012; Publisert: 06.09.2012
Copyright: © Chao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra National Science Council of Taiwan (NSC 99-2320-B400-008-My3) og (NSC 99-2628-B002-024-My3). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
α-Tomatine er en glycoalkaloid funnet i tomat (
Lycopersicon esculentum
). Den ble først isolert ved Fontaine
et al
, og ble funnet å være rik på umodne grønne tomater (500 mg α-tomatine /kg av frisk frukt) [1]; Det er imidlertid i stor grad degradert som tomater modnes (5 mg /kg) [2]. Antibiotika og immunologiske virkninger av α-tomatine er blitt rapportert [3], [4]. α-Tomatine har også vist anti-proliferativ og apoptotiske aktivitet gjennom inaktivering av phosphoinostide 3-kinase (PI3K) /AKT-reaksjonsveien eller nukleær faktor (NF) -κB aktivering i faste tumorcellelinjer så som lever, tykktarm, og lungekreftceller [1], [5], [6]. Imidlertid er rollen til α-tomatine i leukemiceller er ukjent.
Leukemi, som er den vanlige hematologisk neoplasma, er det en malignitet som påvirker blod forløperceller i benmargen. Umodne eller ufullstendig differensierte blodlegemer akkumuleres i beinmargen og erstatte normale blodceller. I de senere årene har forekomsten og dødeligheten for leukemi økt og kjemoterapi har vært den store strategien vedtatt for behandling og helbredelse av leukemi. Imidlertid har den mest definitive og effektiv behandling for leukemi vært benmargstransplantasjon. Ikke desto mindre, på grunn av den høye tilbakefall av leukemi, lav suksessrate av benmargstransplantasjon, mangel på meget selektive kjemoterapi alternativer, og alvorlige negative virkninger av begge behandlingsmåter, undersøkere fortsette å søke etter og utvikle medikamenter som er mer selektive og mindre toksisk for effektiv behandling av leukemi [7].
Apoptose er en form for programmert celledød og den apoptotiske kaskade kan initieres av to hovedveier, indre og ytre baner [8]. Den indre vei, også kalt mitokondrie vei, kan utløse cytokrom
c
utgivelse fra mitokondriene. Den ytre vei, også kalt død reseptoren vei, blir aktivert av døds reseptorer på ligandbinding. Caspaseaktivering er et fellestrekk ved de to hoved apoptotiske reaksjonsveier. Imidlertid har caspase-uavhengig celledød blitt rapportert, som er definert som celledød som ikke involverer caspaseaktivering [9], [10]. Nylig, i tillegg til de kjente mitokondrie proteiner som er assosiert med caspaseaktivering, noen mitokondrielle proteiner er blitt funnet å aktivere caspase-uavhengig celledød, inkludert den apoptose-induserende faktor (AIF), endonuklease G (Endo G), og HtrA2 ( Omi)
survivin er en bi-funksjonell medlem av inhibitor av apoptose protein (IAP) familie som formidler celle overlevelse og kontroller cellecyklusprogresjonen [11] – [13].. Det er ikke funnet i normale differensierte vev, men det er vanligvis over-uttrykt i humane kreft vev, spesielt på leukemi vev [14] – [16]. Når cellene blir utsatt for stimuli som Fas /CD95, stråling eller kjemoterapi, kan Survivin beskytte dem mot celledød. I tillegg kan Survivin hemme caspase-9 direkte og caspase-3 og -7 indirekte ved å binde seg til Smac /Diablo [17]. I tillegg til sin rolle i den caspase-avhengige reaksjonsveien, har Survivin blitt rapportert å påvirke caspase-uavhengig reaksjonsvei ved å undertrykke AIF frigivelse, som tilveiebringer en alternativ rute til celleoverlevelse [12]. Survivin uttrykk er også oppregulert i G
2 /M fase av prolifererende celler [18]. Det er et medlem av kromosomet passasjer komplekset og spiller en viktig rolle i celledelingen. Videre har mange andre faktorer som Wnt /β-catenin, cytokiner, AKT, og NF-kB er rapportert å oppregulerer ekspresjonen Survivin uavhengig av cellesyklusen [12].
Formålet med denne studien var å undersøke de molekylære mekanismer som ligger til grunn for aktiviteten av α-tomatine, som ble isolert fra tomat, og for å bestemme dens mulige rolle i leukemi behandling. Våre resultater viser at α-tomatine har anti-kreft aktivitet, både
in vitro Hotell og
in vivo
. α-Tomatine eksponering indusert leukemicelledøds uavhengig av cellesyklusprogresjon og caspaseaktivering. Men det forårsaket Bak og MCL-1s aktivering og senere tap av membranpotensiale, utløser AIF utgivelse. Det er også hemmet uttrykket av survivin, både
in vitro Hotell og
in vivo
. Disse funnene tyder på at α-tomatine kan være en lovende kandidat legemiddel for behandling av leukemi.
Materialer og metoder
Material
α-Tomatine ble kjøpt fra Tokyo Chemical Industry Co, Ltd og oppløst i DMSO (dimethysulfoxide), deretter holdt ved -20 ° C. RPMI 1640, føtalt bovint serum (FBS), penicillin /streptomycin ble kjøpt fra Life Technologies (Grand Island, NY, USA). Doxorubicin, Z-VAD-FMK, rhodamin 123, 3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5 -diphenyltetrazolium, propidiumjodid og alle de andre kjemiske reagenser anvendt i denne studien ble kjøpt fra Sigma Chemical ( St. Louis, MO, USA). Annexin V-FITC apoptose Detection Kit og antistoffer mot caspase-6 og caspase-7 ble kjøpt fra BD Biovitenskap (San Jos, CS, USA). Antistoff mot caspase-3 ble kjøpt fra IMGENEX (San Diego, California, USA). Antistoffer mot caspase-8, survivin, AIF, og Bud ble kjøpt fra Cell Signaling (Beverly, MA). Antistoff mot aktin ble kjøpt fra Millipore (Billerica, MA, USA). Antistoff mot caspase-9 ble kjøpt fra Epitomics (Burlingame, CA, USA). α-Tubulin, poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), Mcl-1, Bcl-2, Bak, Bcl-xl, HRP-konjugert anti-mus og anti-kanin ble innkjøpt fra Santa Cruz (CA, USA).
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
Menneske kronisk myelogen leukemi K562 cellelinje og for akutt leukemi HL60 cellelinje ble oppnådd fra Bioresource Collection and Research Center. Begge ble dyrket i RPMI-1640 medium med 10% føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin og opprettholdes i 5% CO
2 ved 37 ° C.
celleviabilitet analysen
Cell levedyktighet ble bestemt ved MTT-analyse. Den mitokondrie-dehydrogenase i levende celler redusert 3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5-difenyltetrazoliumbromid, MTT (gul) til formazan fargestoffer (purpur). K562-celler (3 x 10
5 /ml) og HL60-celler (4 x 10
5 /ml) ble sådd ut på 24-brønners plate. Cellene ble behandlet med α-tomatine i 24 timer. Etter behandling med medikamentet, ble 100 ul MTT-løsning (0,5 mg /ml i PBS) per brønn tilsatt til 24-brønners plate, og platen ble inkubert ved 37 ° C i 1 time. Til slutt ble 100 ul ekstraksjon buffer (0,1 M natriumacetat-buffer) tilsatt til platen per brønn for å oppløse formazanfremstilling fargestoffer og absorbansen ble målt ved 550 nm ved hjelp av ELISA-leser (Packard, Meriden, CT, USA).
Strømningscytometri-analyse
fenomenet apoptose ble påvist ved fosfatidylserin (PS) translocating fra den indre membran til den ytre celleoverflate. Og merket annexin V kan binde seg til PS å oppdage apoptotiske celler. Etter at cellene ble behandlet med α-tomatine i løpet av tiden, ble cellene høstet og farget med propidiumjodid (PI, 0,5 ug /ml) og Annexin V-FITC (25 ug /ml) løsning i 15 min ved romtemperatur. Prosentandelen av apoptotiske celler ble analysert ved FACScan Flowcytometer og Cellquest-programvare (Bectan Dickinson). DNA-innhold kan anvendes for å analysere cellesyklus. Etter behandling med α-tomatine i løpet av den angitte tid,-celler (5 x 10
5 /ml) ble høstet og fiksert med 70% (v /v) iskald etanol ved -20 ° C i 30 minutter i det minste. De fikserte cellene ble skylt to ganger med fosfat-bufret saltvann (PBS), resuspensed i 0,2 ml DNA-ekstraksjon buffer (0,2 M Na
2HPO
4 til 0,1 M citritic buffer, pH 7,8) i 30 minutter og farget med PI -løsning (80 ug /ml propidiumjodid, 100 ug /ml RNase A, og 1% Triton X-100 i PBS) i 30 minutter ved romtemperatur. Data ble analysert ved FACScan Flowcytometer og Cellquest programvare (Bectman Dickinson).
Måling av mitokondriell membranpotensiale
mitokondriemembranen potensiale ble overvåket av rhodamine 123. Rhodamine 123, en slags lipofilt fluorone fargestoff med negativt ladet, kan selektivt tas opp mitokondrie membran. Når mitokondrienes membranpotensiale er tapt, kan rhodamin 123 ikke bli absorbert inn i membranen. Celler ble behandlet med den α-tomatine for den angitte tid. Rhodamin 123 (sluttkonsentrasjon 10 uM) ble tilsatt før cellene ble høstet og inkubert i 30 minutter ved 37 ° C. Deretter ble cellene endelig oppsamlet, skyllet med PBS og analysert ved FACScan Flowcytometer og Cellquest-programvare (Bectman Dickinson).
Western blot-analyse
Etter behandlingen celler (10
6cells /mL) ble høstet. Hele cellepelletene ble vasket to ganger med PBS, lysert i iskald lyseringsbuffer (50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM PMSF, 10 ug /ml aprotinin, 10 ug /ml leupeptin, 1 mM natrium orthovandate og 1 mM NaF) i 30 min og deretter sentrifugert ved 13000 rpm ved 4 ° C i 30 minutter. For ekstraksjon av kjerneprotein, ble cellepelletene lysert i buffer A (10 mM Hepes, pH 7,9, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl
2, 0,2 mM PMSF, 0,5 mM DTT, dH
2o). Etter inkubering på is i 15 minutter, ble cellene sentrifugert ved 2000 rpm ved 4 ° C i 3 minutter og deretter pelletene ble renset med buffer B (10 mM Hepes, pH 7,9, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 25% glycerol, dH
2o). Til slutt, ble pelletene resuspendert i buffer C (20 mM Hepes, pH 7,9, 420 mM NaCl, 1,5 mM MgCl
2, 0.2 mM EDTA, 25% glycerol, 0,2 mM PMSF, 0,5 mM DTT) i 20 minutter på is og sentrifugert ved 13000 rpm ved 4 ° C i 30 min. Protein ble kvantifisert ved BCA Protein Assay Kit (Thermo vitenskapelig, Rockford, IL, USA). For Western blot-analyse ble proteinet separert ved elektroforese og overført til en nitrocellulosemembran. Deretter blokkere membranen med fettfri melk i 1 time og ble inkubert med primært antistoff i PBS ved 4 ° C over natten. På den neste dag, ble membranen vasket med PBST (0,1% Tween 20 i PBS) og inkubert med sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur. Deretter ble membranen vasket igjen med PBST og endelig signalet ble oppdaget med en forbedret chemiluminescence deteksjon kit (Amersham, Buckinghamshire, UK).
Tumor xenograft modeller
For å estimere
i vivo
antitumoraktivitet av α-tomatine, HL-60-celler (10
8 celler /ml) ble injisert inn i 20 alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) mus subkutant. Når gjennomsnittlig tumorstørrelse ca. nådde 100 mm
3, mus ble separert i to grupper (en gruppe for 10 mus) og deretter behandlet med α-tomatine (5 mg /kg) i 5% DMSO /5% Cremophor /90% D5W (5% glukose) intraperitonealt. Når gjennomsnittsstørrelsen på svulsten var større enn 2,500 mm
3, ble musene avlivet. Svulster ble tatt reseksjon, veiet og frosset i formalin for immunhistokjemiske eksperimenter. Tumorstørrelse ble målt ved skyvelære måling (mm) og ellipsoide sfære formel (LW
2/2, L: lengde; W: bredde). Alle prosedyrer ble fulgt av National Taiwan University Animal Bruk og Management Committee.
immunhistokjemisk farging
Parafin-embedded tumorvev fra mus ble seksjonert og deparaffinized med xylen. Platene ble nedsenket i forskjellig konsentrasjon av alkohol (100%, 95%, 75%, 50%, DDH
20) trinnvis for rehydrering og deretter i 3% H
20
2 for å blokkere endogen peroksidase. For antigen gjenfinning, nedsenke lysbildene i kokende (95-100 ° C) citratbuffer (pH 6,0) i 20 minutter var nødvendig. Etter vasking med PBS ble objektglassene dyppet i blokkeringsoppløsning (3% BSA) ved romtemperatur i 30 min. Glassene ble inkubert med det primære antistoff fortynnet, Survivin eller AIF (Cell Signaling, Beverly, MA) ved 4 ° C over natten. Etter skylling med PBS for flere ganger, det sekundære antistoff, HRP-konjugat Polymer Reagent (SuperPicture Polymer Detection Kit), ble tilsatt i 10 minutter og deretter DAB kromogen i 5 min. Hver inkuberingstrinnet, lysbildene ble etterfulgt av vasking med PBS i 5 min. Og deretter, Mayers hematoksylin oppløsning ble anvendt for kontra. Til slutt, lysbildene måtte bli dehydrert, lufttørket og montert. For hematoxylin og eosin-farging (H 0,05
Resultater
α-Tomatine indusert apoptose i HL60 og K562 leukemiceller
α-Tomatine består av steroid-aktig tomatidine, galaktose, glukose, xylose og (fig. 1A). Cytotoksisiteten av α-tomatine ble først bestemt med to forskjellige typer av humane leukemiceller, K562 (human kronisk myeloid leukemi) og HL60 (human for akutt leukemi). MTT-analyse avslørte α-tomatine hadde sterke cytotoksiske effekter som kan hemme celleoverlevelse i HL60 K562 og i en konsentrasjonsavhengig måte ved IC
50 1,92 og 1,51 uM, henholdsvis (fig. 1B). Disse resultater ble også vist i andre leukemicellelinjer (Fig. S1). Imidlertid α-tomatine hadde heller svak cytotoksisk effekt på lymfom cellelinje og normale celler (fig. S1 og S2). For å bekrefte statusen til celledød prosessen indusert av α-tomatine, PI og Annexin V dobbel farging ble utført. Som vist på figur 1C, ble ca 40% av HL60-celler behandlet med α-tomatine i 12 timer farget av Annexin V, som representerte tidlig stadium apoptotiske celler, og 10% av cellene ble farget av både PI og Annexin V, noe som indikerte sen fase apoptose eller nekrose. Etter behandling i 24 timer, 60% av cellene var i den tidlige fase av apoptose og 20% av cellene var i den sene fasen. Disse funnene tyder på at α-tomatine kunne hemme cellevekst og induserer apoptose i HL60 og K562-cellelinjer.
(A) Den kjemiske strukturen til α-tomatine. (B) Celler ble behandlet med eller uten α-tomatine i 24 timer, og cellenes levedyktighet ble målt ved hjelp av MTT-reduksjon mitochrondrial aktivitetsanalyse. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM fra minst tre bestemmelser. *
P
0,05, **
P
0,01, og ***
P
0.001 sammenlignet med kontrollgruppen. (C) Strømningscytometri-analyse av plasmamembraner med Annexin V-FITC /PI dobbel farging. Celler ble inkubert med DMSO i 12 timer eller i nærvær av 5 pM α-tomatine for 12 og 24 timer. I de følgende forsøk ble 0,1% DMSO anvendt som kontroll. Uskadede celler ble farget negativ med Annexin V-FITC /PI (nederst til venstre kvadrant). Etter inkubasjon med 5 uM av α-tomatine i 12 timer, var det et betydelig antall av apoptotiske celler som farget positivt med Annexin V-FITC og negative med PI (nederst til høyre kvadrant). Data er uttrykt fra minst tre separate bestemmelser.
α-Tomatine ikke påvirke cellesyklus distribusjon
Analyse av cellesyklusen distribusjonsfase kunne hjelpe evaluere α-tomatine mekanisme av handling; å observere cellesyklusfordelingen for både HL60 og K562-cellelinjer, ble α-tomatine som ble brukt ved 10 uM for 12, 24 og 48 timer. Ingen åpenbare cellesyklusfaseforandringer ble observert med hensyn til tidsavhengig eksponering til a-tomatine (fig. 2A og 2B). Disse funnene tyder på at fasen av cellesyklus for HL60 og K562-cellelinjer som ikke ble endret etter α-tomatine behandling. Med andre leukemiceller, α-tomatine ikke har også innflytelse på cellesyklus distribusjon (Fig. S3). I henhold til tidligere studier, cellesyklus akkumulering i G
2 /M fasen ble observert med paklitaxel [19]. Paclitaxel ble anvendt som en positiv kontroll. Strømningscytometri viste at andelen av celler i G
0 /G
1 fase ble redusert og sub-G
en populasjon økt etter behandling av cellene med paclitaxel i en dose på 10 uM. Etter behandling i 24 timer, sammenlignet med kontrollgruppen celler, antallet celler i sub-G
1 fase økt med omtrent 15 ganger (fig. 2A). Disse funnene antyder at α-tomatine ikke påvirke cellesyklusfordelingen av de humane leukemicellene ble studert.
(A) Det øvre felt viser HL60-celler som ble behandlet med α-tomatine (10 uM) for den indikerte tid; cellesyklusfordelingen ble bedømt ved FACScan flowcytometrisk analyse. Den nederste kjørefelt, HL60-celler behandlet med paclitaxel (10 uM) i den angitte tid, tjente som en positiv kontroll. (B) K562-celler ble behandlet med α-tomatine (10 uM) i den angitte tid. Data er uttrykt fra minst tre separate bestemmelser.
α-Tomatine indusert celledød uavhengig av caspaseaktivering
caspaseaktivering spiller en viktig rolle i både indre og ytre apoptotiske veier. Blant alle kaspaser, er aktivering av kaspaser-3, 6 og-7 antatt å være den viktigste i apoptose pathway. Derfor, for å bekrefte den rollen caspase-3 i HL60 og K562-celler ble behandlet med α-tomatine ved forskjellige konsentrasjoner. Resultatene viste at caspase-3 ikke blir aktivert ved α-tomatine (Fig. 3A og 3C). Imidlertid paclitaxel (3 pM), anvendt som en positiv kontroll, aktivert kaspase-3. I tillegg til caspase-3, caspase-6, -7, -8, -9 og var tilsynelatende uendret etter α-tomatine behandling, selv etter eksponering for en høy konsentrasjon av α-tomatine (5 uM) i 24 timer (fig. 3A og 3C). For å bekrefte at alle de caspaseaktivering var involvert i α-tomatine-indusert celledødsveier, en panne kaspaseinhibitor, z-VAD-FMK, ble anvendt for bekreftelse eksperimenter. MTT-analysen viste at samtidig behandling av HL60 og K562-celler med Z-VAD-FMK og α-tomatine ikke omvendt α-tomatine-indusert celledød (fig. 3B og 3D). I tillegg ble disse lignende funn også vist i andre leukemicellelinjer (Fig. S4). Disse resultater antyder at α-tomatine indusert celle apoptose er uavhengig av kaspase-aktivering i leukemicellelinjer.
(A) HL60-celler ble behandlet med α-tomatine (5 uM) eller paclitaxel (3 uM) i 24 HR og caspase-3, -6, -7, -8 og -9 aktive ble oppdaget. Proteinene ble separert og undersøkt ved hjelp av Western blot-analyse. Paclitaxel (3 pM) ble anvendt som en positiv kontroll. (B) HL60-celler ble forbehandlet med 100 pM Z-VAD-FMK i 30 min og deretter behandlet med α-tomatine (5 uM) i 24 timer. Cytotoksisiteten ble bestemt ved MTT-analyse. (C) K562-celler ble behandlet med α-tomatine (5 uM) og caspase-3, -6, -7, -8, -9 og aktiveringer ble detektert. (D) K562-celler ble forbehandlet med 100 pM Z-VAD-FMK i 30 min og deretter behandlet med α-tomatine (5 uM) i 24 timer.
α-Tomatine påvirket mitokondriemembranpotensialet og beslektede proteiner
Fordi mitokondrier spiller en viktig rolle i både indre og ytre apoptose trasé, mitokondriemembranpotensialet, ble målt. HL60 og K562-celler ble utsatt for a-tomatine ved en konsentrasjon på 5 uM i de angitte tidsrom (1, 2, 4, 8, og 12 timer) og behandlet med rhodamin 123 i 30 min; og deretter ble cellene analysert ved hjelp av strømningscytometri. Figurene 4A og 4B viser et band skift fenomen ble observert etter inkubasjon i 1 og 2 timer i HL60 og K562-cellelinjer, henholdsvis; disse fenomenene endret seg betydelig på fire timer. Det ovennevnte viser at α-tomatine påvirket mitokondriemembranpotensialet. Ikke bare i HL60 og K562 celler, α-tomatine også forårsaket mitokondriemembranen potensielle tap i andre leukemiceller (Fig. S5).
mitokondriemembranpotensiale ble kvantifisert ved flowcytometrisk analyse med rhodamine 123. ( A) HL60 og (B) K562-cellelinjer ble behandlet med 10 pM rhodamin 123 og inkubert ved 37 ° C i 30 minutter i nærvær av 5 pM α-tomatine. Den horisontale aksen viser den relative fluorescensintensitet, og den vertikale aksen indikerer celletallet. Den grønne kurven angir kontrollen. Den blå kurven viser til α-tomatine-behandlede celler. En omlegging fra den grønne kurven til den blå kurven indikerer et tap av mitokondriemembranen potensial. Data er uttrykt fra minst tre separate bestemmelser.
I tidligere studier ble Bcl-2 familien vist seg å spille en avgjørende rolle i mitokondriene, inkludert mitokondriemembranen potensial mekling [20]. Derfor, undersøkte vi hvorvidt α-tomatine induserte forandringer i mitokondriemembranen potensial på grunn av effektene av Bcl-2-familien proteinekspresjon. I de HL60 og K562-celler, ble Mcl-en lang form (Mcl-1L) protein, som formidler av inhibisjon av celle apoptose, ikke regulert av α-tomatine; imidlertid uttrykk for Mcl-en kortform (MCL-1s), som induserer celle apoptose, økt etter behandling (Fig. 5A og 5B). Likevel, som vist i figur 5A og 5B, var det ingen endringer i BCL-2 og Bud proteinnivåer i HL60 og K562 celler. Disse funnene tyder Bak og Mcl-en spilt viktige roller i α-tomatine-indusert apoptose i humane leukemiceller.
(A) α-Tomatine indusert MCL-1s og Bak up-regelverket (pro-apoptotiske), men påvirket ikke Bcl-2 og Bud proteinnivået i HL60 celler. (B) I K562 celler, α-tomatine betydelig forbedret aktivering av Bak og up-regulerte MCL-1s; men α-tomatine ikke påvirket BCL-2 og Bud protein uttrykk. Begge cellelinjer ble behandlet med 5 uM α-tomatine for de angitte intervaller. Data er uttrykt fra minst tre separate bestemmelser.
α-Tomatine indusert AIF kjernefysisk translokasjon og hemmet survivin uttrykk
Tidligere funn og de data som presenteres her har avdekket at α-tomatine indusert celledød uavhengig av kaspase-aktivering [21] og påvirkede mitokondriemembranpotensialet. Videre har det blitt rapportert at permeabiliteten av mitokondriemembranen er også regulert av AIF. Således, AIF-indusert celledød, noe som forbigår caspaseaktivering, kan være involvert i den α-tomatine-indusert celle apoptose pathway. Figur 6A og 6B viser α-tomatine-indusert nukleær translokasjon av AIF i begge cellelinjer i en tidsavhengig måte.
(A) HL60 og (B) K562-celler ble behandlet med og uten α-tomatine ( 5 uM) i 12 timer, 18 timer, 24 timer og 30 timer. Cellene ble deretter fraksjonert inn i kjernefysiske komponenter, og protein uttrykk for AIF og nucleolin (atom lasting kontroll) ble undersøkt ved Western blot-analyse. (C) HL60 og (D) K562-celler ble behandlet med α-tomatine ved de angitte konsentrasjoner og tid. Survivin og actin proteinnivåer ble påvist ved Western blot-analyse. Data uttrykkes fra minst tre separate bestemmelser.
I henhold til Carter
et al.
, Blir mange typer av leukemicellelinjer forbundet med Survivin hemning som fremmer celledød uavhengig av celle syklusprogresjon [22]. I tillegg har Survivin vist seg å undertrykke AIF translokasjon til cytoplasma fra mitokondrier som kan indusere den caspase-uavhengig apoptotiske reaksjonsvei [12]. Vi undersøkte om α-tomatine kan direkte ned-regulere survivin proteinnivået som fører til celledød. Faktisk ekspresjon av Survivin ble nedregulert i begge cellelinjer og andre leukemicellelinjer i en treringstrinnet og tidsavhengig måte (fig. 6C og 6D og S6). Disse funnene tyder på at AIF trans og survivin hemming var involvert i α-tomatine-mediert caspase-uavhengig celledød.
Antitumor aktivitet og uttrykk for AIF og survivin med α-tomatine
in vivo
for å bestemme antitumor effekt av α-tomatine i
vivo
, SCID-mus ble subkutant injisert med HL60 celler i sin høyre flanke. Når tumorvolumet nådde 100 mm
3, ble musene delt i to grupper: en kontroll (bærer) og α-tomatine behandlingsgrupper (5 mg /kg, i.p., annenhver dag). Forsøket ble avsluttet når den gjennomsnittlige volumet av svulster nådd 2.500 mm
3. Figur 7A viser at α-tomatine inhiberte tumorvekst og er forbundet med mangel på vekttap i de behandlede mus. Svulstene ble resected; en del av den resekterte tumorer ble fiksert i formalin og innstøpt i parafin for immunhistokjemisk analyse, og den andre delen av ble malt og deretter nedsenket i lyseringsbuffer. Immunhistokjemisk farging ble utført for å beregne uttrykk for AIF og survivin,
ex vivo
. Hematoxylin og eosin (H c, d, e og f farging for AIF (brun); g, h, i og j farging for Survivin (brun). c, d, g og h er under 200 x forstørrelse; a, b, e, f og j er under 1000 x forstørrelse. (C) Western blot-analyse ble utført i AIF og Survivin uttrykk sammen med aktin som en lasting kontroll fra tilfeldig valgt tumor i hvert av styre- og 5 mg /kg a-tomatine behandlingsgruppene.
diskusjon
α-Tomatine er en viktig saponin funnet i tomat, og nylige studier har vist at den har antitumoraktivitet i solide tumorceller [1], [5], [6]. Imidlertid har den molekylære mekanisme av α-tomatine aktivitet ikke er fastlagt i leukemiceller. I den foreliggende undersøkelse, ble α-tomatine funnet å inhibere overlevelsen av leukemiceller i en konsentrasjonsavhengig måte (fig. 1B og S1). Hemmingen av celleoverlevelse kan tilbakeføres til hemming av cellevekst eller celle-cytotoksisitet. Derfor cellecyklusen fordeling ble undersøkt ytterligere etter behandling med α-tomatine. Resultatene viste at α-tomatine ikke påvirke cellesyklusprogresjon i de evaluerte leukemicellelinjer (Fig. 2 og S3). Men propidiumjodid (PI) og Annexin V flekker avslørte at α-tomatine fremmet-leukemicelle apoptose fra tidlig til sent faser (Fig. 1C). Videre α-tomatine behandlingen resulterte i endringer i ekspresjon av BCL-2-protein familien (fig. 5). Signifikant mitokondriell forstyrrelse (fig. 4 og S5) ble observert, og det deretter utløste AIF translokasjon til kjernen og hemmet Survivin ekspresjon som fører til leukemicelle apoptose (Fig. 6 og S6).
Resultatene av denne studien viste ingen α-tomatine relaterte endringer i fordelingen av cellesyklusen, selv ved en høy α-tomatine konsentrasjon (10 pM). Men resultatene av PI-annexin V dobbeltfarging antydet at apoptose observeres var forårsaket av α-tomatine.
