Abstract
Aktivering av peroksisomproliferatoraktiverende aktivert reseptor-γ (PPARy) hemmer veksten av kreftceller, inkludert ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Klinisk bruk av tiazolidindioner, som er farmakologiske aktivatorer av PPARy er assosiert med en lavere risiko for utvikling av lungekreft. Imidlertid er rollen til denne reaksjonsveien i lunge cancer metastase ikke blitt undersøkt godt. Systemisk effekt av pioglitazon ble undersøkt i to modeller av kreft metastasering lunge i immun-kompetente mus. I en ortotopisk modell, murine lungekreftceller implantert i lungene av syngen mus spredning til leveren og hjernen. Som et andre modell, kreftceller injisert subkutant spredning til lungen. I begge modellene systemisk administrasjon av pioglitazon økt frekvensen av metastaser. Undersøkelse av vev fra orthotopic modellen demonstrert økt antall arginase I-positive makrofager i svulster fra pioglitazon-behandlede dyr. I ko-kultur-eksperimenter av kreftceller med benmarg-avledede makrofager, pioglitazon fremmet arginase jeg ekspresjon i makrofager, og dette var avhengig av ekspresjon av PPARy i makrofager. For å vurdere bidraget av PPARy i makrofager til kreft progresjon, ble eksperimenter utført i benmargstransplanterte dyrene som fikk benmarg fra Lys-M-Cre + /PPARy
FLOX /FLOX mus, der PPARy slettes spesielt i myeloide celler ( PPARy-Mac
neg), eller kontroll PPARy
FLOX /FLOX mus. I begge modellene, mus som fikk PPARy-Mac
neg benmarg hatt en markant nedgang i sekundære tumorer som ikke ble vesentlig endret ved behandling med pioglitazon. Det var assosiert med reduserte mengder arginase I-positive celler i lungen. Disse data understøtter en modell hvor aktiveringen av PPARy kan ha motsatte virkninger på tumorprogresjon, med anti-tumorigen effekter på kreftcellene, men pro-tumorigene effekter på celler av mikromiljøet, spesielt myeloide celler
Citation.: Li H, Sorenson AL, Poczobutt J, Amin J, Joyal T, Sullivan T, et al. (2011) Aktivering av PPARy i myeloide celler Fremmer Lung Cancer Progresjon og metastasering. PLoS ONE 6 (12): e28133. doi: 10,1371 /journal.pone.0028133
Redaktør: Guenter Schneider, Technische Universität München, Tyskland
mottatt: 26 august 2011; Godkjent: 01.11.2011; Publisert: 01.12.2011
Copyright: © 2011 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra NIH (CA103618, CA108610, og CA58187), samt en Pilot Grant fra SPORE på Lung Cancer Dr. Weiser-Evans. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall i både menn og kvinner over hele verden, og overlevelse er fortsatt lave [1]. En vesentlig grunn er at mange pasienter Liggende med langt fremskreden sykdom og metastaser ved diagnosetidspunktet. Derfor translasjonsforskning studier designet for å identifisere legemidler som hemmer metastasering er viktig for å forbedre kliniske resultater. Selv om genetiske endringer i kreftcellene kjøre startfasen, spiller svulsten mikromiljøet en avgjørende rolle i tumorprogresjon og metastase [2]. Interaksjoner mellom kreftceller og celler i svulsten mikromiljøet (f.eks vaskulære celler, immunceller, fibroblaster) kontroll tumor angiogenese og kan fremme en mer aggressiv fenotype. Disse celle-celle interaksjoner mediert gjennom cytokiner og vekstfaktorer i utgangspunktet produsert av tumorcellene, noe som resulterer i immunsystemet og vaskulære cellerekruttering. Rollen av tumoren mikromiljøet i lungekreft er ikke blitt så omfattende studert som i andre typer av kreft, slik som bryst og prostata, i det minste delvis på grunn av mangel på gode dyremodeller. Kjemiske karsinogenisitetsstudier modeller har vært viktig i å studere startfasen, men de resulterende svulster er vanligvis adenomer som ikke metastasize. Genetiske musemodeller har også vært ansatt, men selv om disse skjema adenokarsinomer, de er ofte svakt metatastic [3]. Studier med humane lungekreftcellelinjer har brukt xenograft modeller hvor kreftceller blir inokulert subkutant i immunkompromitterte gnagere. Således miljøet hvor den primære svulsten utvikler ikke er lungen, og den fulle rolle av immunceller for tumorprogresjon kan ikke vurderes. Vi har derfor utviklet en ortotopisk modell i hvilken musetumorceller avledet fra lungesvulster i C57BL /6 mus [4] blir direkte injisert inn i lungene av syngeniske mus [5], slik at en vurdering av tumorprogresjon og metastase hos immunkompetente dyr. Dette gir en klinisk relevant system for å teste effekten av nye strategier /legemidler utformet for å målrette lungekreft progresjon og metastasering.
peroksisomproliferatoraktiverende aktivert reseptor-γ (PPARy) er et medlem av atom hormonreseptor superfamilie av ligand-aktiverte transkripsjonsfaktorer [6]. Den klassiske vei av PPARγactivation involverer binding som en heterodimer med retinsyre X reseptor til spesifikke DNA-sekvenser i promotorene av målgener. Ligandbinding fører til en konformasjonsendring, noe som resulterer i frigjøring av co-repressorer og bindingen av ko-aktivatorer. PPARy er også blitt vist å binde seg til andre transkripsjonsfaktorer som fører til transrepression [6]. Endogene PPARy-aktivatorer innbefatter flerumettede fettsyrer og eikosanoider, mens syntetiske aktivatorer av PPARy omfatter tiazolidindioner (TZDs), som for eksempel rosiglitazon og pioglitazon [7]. Det er godt dokumentert at PPARy-aktivering spiller en kritisk rolle i adipocyttdifferensiering aktivering og differensiering. Nylig har imidlertid PPARy har også vært implisert i regulering av flere typer kreft, inkludert lungekreft. Analyse av humane lungesvulster har rapportert at redusert ekspresjon av PPARy er korrelert med en dårlig prognose [8]. Viktigere, en retrospektiv studie som undersøker kreftforekomst hos diabetespasienter som bruker TZDs viste en 33% reduksjon i risikoen for lungekreft [9], med en enda mer dramatisk reduksjon i afrikansk-amerikanske diabetespasienter (75%). Dette reduserte risiko var spesifikk for lungekreft, uten noen beskyttende virkning observert for prostatakreft eller kreft i tykktarmen. Prekliniske studier fra vårt laboratorium har vist at aktivering av PPARy i menneskelige ikke-småcellet lungekreft celle (NSCLC) linjer hemmet forvandlet vekst og invasivitet, og fremmet en mer differensiert fenotype [10], [11]. Videre er rettet overekspresjon av PPARy i mus for å fjerne type II alveolare epitelceller hadde kjemopreventive effekter ved å inhibere initiering av lungekreft [12]. Kollektivt, disse studiene tyder på at målretting PPARy kan ha viktige chemopreventive applikasjoner for lungekreft. Imidlertid er rollen av PPARy-aktivering ved systemisk administrering av TZDs i å regulere tumorprogresjon og metastasering av lungekreft har ikke vært godt undersøkt. Faktisk, den retrospektive kliniske studien som viste redusert forekomst av lungekreft hos diabetikere som behandles med TZDs ekskluderte personer som hadde en pre-eksisterende diagnose av kreft [9]. Målet med vår studie var å fastslå effekten av systemisk PPARy aktivisering på lungekreft progresjon og metastase bruker TZD pioglitazon i vår orthotopic immunocompetent modell. I motsetning til vårt opprinnelige hypotese at pioglitazon ville utøve beskyttende effekt på lungekreft metastase, her rapporterer vi uventede funn at systemisk administrering av pioglitazon akselererer hastigheten av lungetumorprogresjon og metastase, og dette blir mediert gjennom aktivering av PPARγin myeloide celler.
Resultater
Pioglitazone matet mus utstillings økt lungekreft progresjon og metastase
for å vurdere effekten av systemisk administrert pioglitazon på lungekreft progresjon og metastasering i immunkompetente mus vi brukte CMT /167-celler, en lunge adenokarsinom-cellelinje avledet fra C57BL /6 mus [13]. Vi har tidligere vist at injeksjon av slike celler i lungene av syngene C57BL /6 mus resulterer i en primærtumor, som senere utvikler seg til å danne sekundære lungetumorer, og metastasizes til lymfeknutene og fjerntliggende organer [5]. In vitro eksperimenter vist at pioglitazon inhiberer invasivitet av disse cellene (figur S1), og fremmer en mer differensiert fenotype i tre-dimensjonale Matrigel kulturer (Figur S1), i samsvar med det vi har observert med PPARy aktivering i menneske NSCLC [10]. For å undersøke den systemiske rolle in vivo PPARy villtype C57BL /6-mus ble plassert på kontroll eller pioglitazon-impregnert chow 7 dager før cancerceller, injeksjoner og i løpet av eksperimentet. Etter 7 dager kreftceller stabilt uttrykker luciferase (CMT /167-luc) suspenderes i Matrigel (BD Biosciences) ble injisert inn i brysthulen til venstre lapp mus som tidligere beskrevet [5]. Primær svulstdannelse ble analysert 3 dager etter injeksjoner av in vivo bioluminescent bildebehandling; mus som ikke viser utviklingen av en primær svulst ble fjernet fra studien. Til forskjellige tider etter injeksjoner, ble musene avlivet og lunger, hjerte, lever og hjerne fjernet for ex vivo bioluminesens bildebehandling og histologisk analyse. Undersøkelse av H E lunge seksjoner (figur 1C). Forekomst av lever og hjernemetastaser ble kvantifisert ved 25-30 dager etter injeksjon av ex vivo bioluminescent imaging. Forekomsten av levermetastaser i pioglitazon-behandlede mus var det dobbelte av kontrollgruppen (figur 1D, E). I pioglitazon gruppen behandlet med ca 10% av dyrene utviklet hjernemetastaser, mens ingen hjernemetastaser ble funnet i kontrollgruppen (figur 1D, F). Total overlevelse var ikke forskjellig i de to gruppene av mus (Figur 1G). For å validere at mus matet pioglitazon impregnert chow mottatt stoffet, og at PPARy ble aktivert, serum ble samlet og adiponectin nivåene ble målt med ELISA. Som har vært tidligere utgitt [14], serum adiponectin nivåer ble økt innen 7 dager pioglitazon administrasjon, og forble forhøyet etter 23 dager (Figur 1 H).
Wild-type C57BL /6 mus ble matet enten normal chow eller chow impregnert med pioglitazon (0,05%) i en uke før tumorcelle implantasjon, og i løpet av eksperimentet. CMT /167-Luc-celler (10
5) ble orthotopically injisert i venstre lunge som beskrevet i metodedelen. Lunger, lever og hjerne ble høstet 25-30 dager etter injeksjon.
En
.
Hematoxylin-eosin farget deler av tumorbærende lungene. Piler indikerer primære eller sekundære lungetumorer, samt tumorer intravasating inn i eller ut extravasating av et blodkar.
B
.
Kvantifisering av primærtumor diameter kontroll (n = 17) og pioglitazon behandlede pasienter (n = 16) dyr målt ved hjelp av digitale calipers.
C.
Antall sekundære lungesvulster i C57BL /6 mus matet enten normal chow eller pioglitazon chow ble bestemt ved å kvantifisere svulster i Hematoxylin-eosin fargete snitt gjennom midten av lungene. Dataene er midler og S.D. av teller fra 12-16 dyr i hver gruppe.
D.
Andel C57BL /6 mus matet enten normal chow (n = 17) eller pioglitazon impregnerte chow (n = 16) med lever og hjernemetastaser. Lever og hjernemetastaser ble identifisert ved
ex vivo
bioluminescent avbildning av organer ved tidspunktet for avlivelse, og ble bekreftet ved histologi.
E.
Representative bioluminescent bilder av levermetastaser hos mus matet enten normal chow (øverst til venstre panel) eller pioglitazon impregnerte chow (panel øverst til høyre). Representative bioluminescent bilder av hjerner fra mus som enten normal chow (nederst til venstre panel) eller pioglitazon impregnerte chow (nederst til høyre panel).
F
.
Kaplan-Meier overlevelseskurven for C57BL /6 mus injisert med CMT /167-Luc celler matet enten kontroll eller pioglitazon impregnert chow.
G.
Mean serumkonsentrasjonen av adiponectin i C57BL /6 mus matet enten normal chow eller pioglitazon impregnert chow. For alle grafer * P. 0,05 vs kontroll
Systemisk administrering av pioglitazon øker antallet arginase I-positive makrofager i svulster
Rekruttering av benmarg-avledede celler, og i særdeleshet monocytter /makrofager, bidrar til tumoren mikromiljøet og er assosiert med mer aggressive, ondartede svulster [15]. For å karakterisere virkningene av systemisk PPARy aktivering indusert av pioglitazon på benmarg celle rekruttering og tumorprogresjon, WT mus fikk benmargstransplantasjon fra UBI-EGFP /B6 transgene givere, som uttrykker EGFP i alle celler. Etter at 6 uker til gjenvinning, ble dyrene plassert på passende chow i 7 dager, og deretter injisert med CMT /167-Luc celler. Dyrene ble opprettholdt på hver sin pioglitazon-impregnert eller kontroll chow i løpet av eksperimentet. Lunge Seksjonene ble undersøkt for GFP, mac3 og arginase I ekspresjon ved trippel immunofluorescens for å bekrefte rekruttering av benmarg-avledede makrofager og for å bestemme om rekrutterte makrofager er polarisert til å uttrykke en alternativ M2, anti-inflammatorisk fenotype. Begge grupper av mus oppviste betydelige mengder GFP (+) mac3 (+) celler som omgir svulsten (figur 2A; representativt bilde fra pioglitazon matet lunge-delen), som indikerer at de fleste av de rekrutterte benmargceller er makrofager. I tillegg fant vi at det store flertallet av arginase I-positive celler innenfor og omkringliggende svulster var mac3 (+) makrofager (Figur 2A). Tumorassosierte makrofager (TAM) ble kvantifisert ved å telle mac3 (+) celler i primære tumorer i begge grupper av mus. Selv om ingen forskjeller i det totale antall makrofager som omgir primær lungetumorer ble funnet mellom de to gruppene av mus som brukes i vår ortotopisk lunge forsøk (data ikke vist), ble antallet arginase I-positive makrofager i primærsvulster markert økt i mus foret pioglitazone-impregnerte chow 16 dager etter implantasjon av tumorceller (figur 2B).
A.
Representative immunofluorescerende farging for GFP (a), mac3 (b), arginase i (c), og overlay av alle tre med DAPI (d) i en primærtumor og omkringliggende vev 16 dager etter at kreftcelle injeksjon fra en pioglitazon behandlet mottaker mus som fikk en benmargstransplantasjon fra en UBI-EGFP transgen donor. Stjernen indikerer svulsten.
B.
Kvantifisering av arginase I-positive celler i svulster 16 dager etter injeksjon. Dataene er midler og standardavvik av teller fra 11-13 dyr i hver gruppe, ved hjelp av 1-2 lysbilder per dyr og teller 4 tilfeldige felt per lysbilde. * P 0,05 vs Control.
C.
Benmarg makrofager isolert som beskrevet i metodedelen ble stimulert i 18 timer med enten IFNy /LPS eller IL-4 og analysert for uttrykk av arginase I.
D.
identiske celler fra (C) ble dyrket alene eller i co-kultur med CMT /167 celler for 3 dager i fravær eller nærvær pioglitazon (10 mm). Cellelysater ble immunblottet for arginase I.
E.
Helcellelysater fra WT, PPARy
FLOX /FLOX (Fl /Fl), eller PPARy-Mac
neg (KO) makrofager ble analysert for PPARγexpression.
F.
WT, PPARy
FLOX /FLOX, eller PPARy-Mac
neg makrofager ble ko-dyrket med CMT /167 celler i nærvær eller fravær av pioglitazon (10 mm). Cellelysater ble analysert for ekspresjon arginase I. Densitometry målinger som viser normaliserte nivåer i forhold til kontroll vises under western blot (gjennomsnitt av tre uavhengige forsøk). Den densitometrisk analyse ble utført ved anvendelse ImageJ programvare (NIH, Bethesda, MD), som beskrevet i metodedelen. * P 0,05 vs WT kontroll, ** P 0,05 vs WT PAD. For all Westerns, ble b-aktin brukt som en lasting kontroll.
Pioglitazon fremmer en «M2» pro-tumorigent makrofag fenotype i co-kulturer av kreftceller og makrofager
Å bestemme hvorvidt PPARy spiller en rolle i makrofag M2 polarisasjon, benmargceller isolert fra villtype C57BL /6 hannmus ble dyrket i nærvær av rekombinant M-CSF for å fremme differensiering til makrofager [16]. Disse cellene har morfologien for makrofager, er mer enn 95% F4 /80 positiv, og uttrykker ikke kjente nivåer av enten iNOS eller arginase I, markører, M1 og M2 makrofag fenotyper henholdsvis [17]. Stimulering av disse celler med IL-4-indusert arginase I ekspresjon, i samsvar med en M2 fenotype (figur 2C). For å undersøke effekten av pioglitazon om interaksjoner mellom kreftceller og makrofager, benmargsmakrofager ble ko-dyrket med CMT /167 celler i tre dager i fravær eller nærvær av pioglitazon (10 mm) ved hjelp Transwells som lar diffusible meklere til å handle på hver celletype. CMT /167 celler selektivt indusert ekspresjon av arginase I i makrofager (figur 2D), med ingen effekt på iNOS uttrykket (ikke vist). Pioglitazon som en eneste agent påvirket ikke uttrykk for enten arginase jeg eller iNOS. Imidlertid ble arginase jeg uttrykk forsterkes i co-kulturer behandlet med pioglitazon (figur 2D).
For å definere bidrag PPARy i makrofager til induksjon av arginase jeg ble benmargsmakrofager isolert fra Lys-M -Cre × PPARy
FLOX /FLOX mus, der PPARy selektivt slettet i myeloide linjene (PPARy-Mac
neg), eller kontrollmusene (PPARy
FLOX /FLOX) mus. Uttrykk av PPARy var umulig å oppdage i makrofager fra PPARy-Mac
neg mus, mens WT og PPARy
FLOX /FLOX hadde sammenlignbare nivåer av uttrykk (figur 2E). Viktigere, co-kulturer av CMT /167 celler med PPARy-Mac
neg makrofager resulterte i lavere nivåer av arginase jeg uttrykk i disse makrofager i forhold til å kontrollere makrofager (figur 2F). Disse data indikerer at aktiveringen av PPARy i makrofager samarbeider med signaler fra kreftceller til å fremme M2 fenotype. Det bør bemerkes at pioglitazon fortsatt beskjedent økt arginase jeg uttrykk i PPARy-Mac
neg makrofager, noe som tyder på noen bidrag av PPARy-uavhengige «off-target» effekter.
Målrettet sletting av PPARy i makrofager hemmer metastase
for å vurdere hvilken rolle PPARy i makrofager in vivo, utførte vi benmargstransplantasjon, der WT mus fikk benmargstransplantasjon fra enten PPARy-Mac
neg eller kontrollere PPARy
FLOX /FLOX donorer. Seks uker etter transplantasjonen, ble dyrene plassert på pioglitazon-impregnert eller kontroll chow i 7 dager, fulgt av implantering av 10
5 CMT /167-Luc-celler i lungen. Dyrene ble opprettholdt på enten pioglitazon-impregnert eller kontroll chow før de ble avlivet 4 uker etter svulst implantasjon. Sekundære lungesvulster ble kvantifisert ved å telle synlige metastaser under et dissekere mikroskop og bekreftet ved histologi. Som vist i figur 3A, ble antallet av sekundære lungetumorer sterkt hemmet i alle de mus som fikk benmarg fra PPARy-Mac
neg mus. Pioglitazon økt sekundær lungesvulster i kontroll mus, i samsvar med våre funn i untransplanted mus. Imidlertid pioglitazon ikke signifikant øke antall lungemetastaser i mus transplantert med benmarg fra PPARy-Mac
neg mus (figur 3A). Representative histologi av de sekundære lungetumorer er vist i figur 3B. Midlere størrelse til metastaser var ikke signifikant forskjellig i noen av de fire grupper (data ikke vist). Vi undersøkte arginase I positive makrofager i lungene av tumorbærende dyr. Pioglitazon endret ikke antall arginase I-positive celler i kontroll PPARy
FLOX /FLOX lungene. Men lungene fra PPARy-Mac
neg mus på kontroll chow viste en statistisk nedgang i arginase I positive celler; pioglitazon økt antall av disse cellene til nivåer sett i PPARy
FLOX /FLOX mus (figur 3C, D). I alle tilfeller det store flertallet av arginase jeg positive celler farget positivt for makro markører (data ikke vist).
Etter dødelig stråling, WT C57BL /6 mus fikk benmarg fra enten PPARy-Mac
neg ( KO) eller PPARy
FLOX /FLOX (FLOX) donor mus som beskrevet i «Methods» -delen. Etter 5 uker for å tillate gjenvinning av engraftment, ble mus plassert på hver pioglitazon-inneholdende chow eller kontroll chow i 1 uke før tumorcelle implantasjon, og i løpet av eksperimentet. Dyrene ble injisert med 10
5 CMT /167-Luc-celler orthotopically som i fig. 1. Fire uker etter kreftcelle inokulering ble dyrene fotografert av bioluminesens og ofret.
A.
Antallet sekundære lungetumorer ble kvantifisert ved undersøkelse under et disseksjonsmikroskop. Svulster ble talt ved to uavhengige observatører blindet. Dataene er midler og standardavvik av teller fra 6-9 dyr i hver gruppe. Mus som fikk PPARy-Mac
neg benmargen hadde betydelig færre antall sekundære lungesvulster enn mus som fikk PPARy
FLOX /FLOX. * P 0,05 vs FLOX kontroll. ** P 0,05 vs FLOX kontroll.
B
Representative histologi (H E). Er vist for sekundære lungetumorer fra alle 4 grupper av dyr.
C.
Tumorbærende lunge seksjoner fra WT PPARy
FLOX /FLOX eller PPARy-Mac
neg mus ble immunhistokjemisk farget for arginase I (brun reaksjon farge). Representative Bildene vises i lungene fra alle 4 grupper av dyr.
D.
Antall arginase I-positive celler ble kvantifisert ved to uavhengige blindet observatører. Dataene er midler og standardavvik av teller fra 6-9 dyr i hver gruppe. Lunger fra PPARy-Mac
neg mus på kontroll chow viste en statistisk nedgang i arginase I positive celler; pioglitazon økt antall av disse cellene til nivåer sett i PPARy
FLOX /FLOX mus. * P. 0,05 vs FLOX kontroll
For å bekrefte funnene i vår orthotopic modell, vi ansatt en ny modell der tumorceller ble implantert subkutant i flankene av C57BL /6 mus matet enten normal eller pioglitazon impregnert chow. Vi brukte WT C57BL /6 mus transplantert med benmarg fra enten PPARy-Mac
neg mus eller kontroll PPARy
FLOX /FLOX mus. Seks uker etter transplantasjonen, ble dyrene plassert på pioglitazon-impregnert eller kontroll chow i 7 dager, fulgt av implantering av 10
5 CMT /167-Luc celler i flanken. Dyrene ble opprettholdt på enten pioglitazon-impregnert eller kontroll chow før de ble avlivet 4 uker etter svulst implantasjon. Primær tumorstørrelse ble målt med digital calipers og lungemetastaser ble kvantifisert ved å telle synlige metastaser under et dissekere mikroskop og bekreftet ved histologi. Som vist i figur 4A, primær tumorvolumet var lik i PPARy
FLOX /FLOX mus i nærvær eller fravær av pioglitazon, så vel som i PPARy-Mac
neg mus på kontroll chow; PPARy-Mac
neg mus som fikk pioglitazon viste en beskjeden nedgang i primærtumorstørrelse. Viktigere og lik vår orthotopic modell, pioglitazon markert økt lungemetastaser i PPARy
FLOX /FLOX mus sammenlignet med kontroll chow-matet PPARy
FLOX /FLOX mus (figur 4B). I motsetning til dette, pioglitazon mislyktes i å vesentlig øke antallet lungemetastaser i PPARy-Mac
neg mus (figur 4B). Representative histologi av lungemetastaser er vist i figur 4C. Midlere størrelse til metastaser var ikke signifikant forskjellig i noen av de fire grupper (data ikke vist). Total, vi har ikke observert en sammenheng mellom primær tumorstørrelse og metastasering i noen av modellene vi har studert. I tillegg og i likhet med den ortotopisk modell, pioglitazon ikke endre antallet arginase I-positive celler i lungene til PPARy
FLOX /FLOX mus. Imidlertid er antallet arginase I-positive celler ble signifikant redusert i PPARy-Mac
neg mus, begge under kontrollbetingelser, og i nærvær av pioglitazon (figur 4D, E). Til slutt, for å avgjøre om effekter på metastaser var spesifikke for pioglitazon, ble forsøkene gjentas med chow impregnert med rosiglitazon, en annen TZD. Eksponering for rosiglitazon viste tilsvarende økninger i forekomst av metastaser, men ingen endring i primærtumorvolum (figur S2).
Etter dødelig stråling, WT C57BL /6 mus fikk benmarg fra enten PPARy-Mac
neg (KO) eller PPARy
FLOX /FLOX (FLOX) donor mus som beskrevet i «Methods» -delen. Etter 5 uker for å tillate gjenvinning av engraftment, ble mus plassert på hver pioglitazon-inneholdende chow eller kontroll chow i 1 uke før tumorcelle implantasjon, og i løpet av eksperimentet. Dyrene ble deretter injisert med 10
5 CMT /167-Luc celler subkutant. Dyrene ble fotografert av bioluminesens, og ofret 4 uker etter kreftcelle vaksinasjon.
A.
Primærtumor volumer i alle musene ble målt ved hjelp av digitale calipers. Dataene er midler og standardavvik av teller fra 9-14 dyr i hver gruppe. * P 0,05 vs FLOX Control.
B.
Forekomst av lungemetastaser ble kvantifisert ved undersøkelse under et dissekere mikroskop. Svulster ble talt ved to uavhengige observatører blindet. Dataene er midler og standardavvik av teller fra 9-14 dyr i hver gruppe. Pioglitazon økt forekomst av metastase i WT mus, men ikke i mus som mottok PPARy-Mac
neg benmarg. * P 0,05 vs FLOX Control. ** P 0,05 vs FLOX Pio.
C.
Representant histologi er vist for lungemetastaser fra alle 4 grupper av dyr.
D.
Tumorbærende lunge seksjoner fra WT eller PPARy-Mac
neg mus ble immunhistokjemisk farget for arginase I (brun reaksjon farge). Representative Bildene vises i lungene fra alle 4 grupper av dyr.
E.
Antall arginase I-positive celler ble talt av to uavhengige blindet observatører. Dataene er midler og standardavvik av teller fra 9-14 dyr i hver gruppe med en del per dyr og 4 tilfeldige felt per lysbilde. Antallet arginase I-positive celler ble signifikant redusert i PPARy-Mac
neg mus, begge under kontrollbetingelser, og i nærvær av pioglitazon. * P. 0,05 vs FLOX Kontroll
Diskusjoner
Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) står for de fleste tilfeller av lungekreft, som er den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis. Nye terapeutiske tilnærminger til behandling av lungekreft er sterkt behov. Basert på retrospektive kliniske studier [9], er det stor interesse for bruk av TZDs som potensiell chemopreventive eller kjemoterapeutika i behandling av lungekreft. Dette støttes av omfattende studier som viser effekten av PPARy-aktivering i kreftceller på inhibering av transformerte vekst [18], induksjon av apoptose [19], [20], og fremming av differensiering [10], [21]. I tillegg har PPARy-aktivatorer blitt vist å hemme tumor initiering i en kjemisk karsinogenese modell [22]. Men i motsetning til cancer initiering, noe som i stor grad er mediert gjennom endringer i transformerte epitelceller, tumorprogresjon og metastase innebærer kritiske interaksjoner mellom tumor og mikromiljøet. I serie eksperimenter vi rapporterer her, systemisk administrasjon av pioglitazon til mus akselerert tumorprogresjon og metastase i to uavhengige modeller av ikke-småcellet lungekreft. Dette ble reflektert i en økning i både forekomst og antall fjerne organmetastaser som ikke korrelerer til primærtumor størrelse. Viktigere og i motsetning til hva som ble spådd, systemisk administrasjon av pioglitazon utøves ingen overlevelse fordeler sammenlignet med kontroll mus.
Det er flere mulige årsaker til disse tilsynelatende uventede funn. Først, i motsetning til studier av human NSCLC, våre studier benyttet murine lungekreftceller, som kan oppfører seg anderledes enn humane NSCLC-celler. Men ikke våre funn støtter ikke dette. Aktivering av PPARγin CMT /167 celler hemmet invasivitet og fremmet en mer differensiert fenotype i 3D kultur (Hjelpemiddel Informasjon S1), i likhet med hva vi har observert i humane NSCLC-linjer [10]. I stedet foreslår at effektene av pioglitazon på akselerasjon av tumorprogresjon og metastase blir mediert i stor grad gjennom virkninger på tumormikromiljøet. Faktisk mus med en målrettet sletting av PPARy i myeloide linjene viste markant færre videregående lungesvulster i vår orthotopic modell, og færre lungemetastaser i vår flanke modell. Videre pioglitazon klarte å øke lungesvulster i begge knockout-modeller. Disse data til vår kunnskap er den første demonstrasjonen av en viktig rolle PPARy i svulsten mikromiljøet på tumorprogresjon og metastasering. Dessuten, basert på våre in vitro-studier foreslår at PPARy i makrofager er kritisk for konvertering av makrofager i et alternativt aktivert fenotype i nærvær av kreftceller som har vist seg å fremme metastase [23]. Ko-kultur av WT makrofager med kreftceller resulterte i induksjon av arginase I uttrykk, en klassisk markør av eventuelt aktiverte makrofager, med ytterligere økning i ekspresjon observert i nærvær av pioglitazon; Dette ble markert avstumpet hvis makrofager mangelfulle i PPARy ble brukt for co-kultur. Videre er det i begge metastasemodeller, antall arginase I-positive makrofager i lungen ble betydelig redusert hos mus med en målrettet delesjon av PPARy i myeloide celler sammenlignet med kontrollene indikerer at det er en sterk korrelasjon mellom makrofag-spesifikk PPARy-aktivering og metastase progresjon .
Bevis fra kliniske og eksperimentelle studier indikerer makrofager fremme solid tumor progresjon og metastasering. Makrofager er utdannet ved svulsten mikromiljøet, slik at de vedta en trofisk rolle som tilrettelegger for angiogenese, matrise sammenbrudd og tumor cellemotilitet, som alle er elementer av metastatisk prosess.
