Abstract
Plakoglobin (PG) er et beltedyr protein som forbinder med både klassiske og desmosomale cadherins, men er hovedsakelig konsentrert i modne desmosomes i epitel. Mens reduserte nivåer av PG har blitt rapportert i lokaliserte og hormon ildfast prostatakreft, er den funksjonelle betydningen av disse endringene ukjent. Her rapporterer vi at PG uttrykket er redusert i prøver av en prostata svulstvev matrise og omvendt korrelert med fremskridende svulst potensial i 7 PCA cellelinjer. Ectopically uttrykt PG økt interklebekraft, og svekket motilitet og invasjon av aggressive cellelinjer, mens stanse PG i mindre tumorigene celler hadde motsatt effekt. PG også regulert celle-substrat adhesjon og motilitet gjennom ekstracellulære matriks (ECM) -avhengig hemming av Src-kinase, noe som tyder på at PG er effekter var ikke utelukkende på grunn av økt intercellulær adhesjon. PG stanse resultert i forhøyede nivåer av ECM protein vitronectin (VN), og eksponering av PG-uttrykke celler til VN indusert Src aktivitet. Videre økte VN nivåer og Src aktivering korrelert med redusert uttrykk av PG i pasient vev. Således kan PG hemme Src ved å holde VN lav. Våre resultater tyder på at tap av intercellulær adhesjon på grunn av redusert ekspresjon PG kan bli forverret ved aktivering av Src gjennom en PG-avhengig mekanisme. Videre kan PG nedregulering i løpet av PCa progresjon bidra til den kjente VN-avhengige fremming av PCa invasjon og metastase, som viser en ny funksjonell interaksjon mellom desmosomal celle-celleadhesjon og celle-substratadhesjon aliserte akser i prostata kreft.
Citation: Franzen CA, Todorovic V, Desai BV, Mirzoeva S, Yang XJ, Grønn KJ, et al. (2012) The desmosomal Armadillo Protein Plakoglobin Regulerer Prostate Cancer Cell Grep og motilitet gjennom Vitronectin avhengige Src signale. PLoS ONE syv (7): e42132. doi: 10,1371 /journal.pone.0042132
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 21 januar 2012; Godkjent: 03.07.2012; Publisert: 30.07.2012
Copyright: © Franzen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Cancer Institute (NCI) prostata SPORE stipend P50 CA90386, Zell Foundation, støtte fra Rosenberg Seed Grant (til JCP), R01s CA122151, AR041836 og JL Mayberry legat (til KJG), National Institutes of Health (NIH) trening tilskudd T32 CA070085 (til CAF og VT) og F32 AR055444 (VT) og en American Cancer Society (ACS) postdoktor stipend PF-10-235-01-CSM (CAF). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den nest største årsaken til kreftdødelighet i USA [1], hovedsakelig på grunn av metastatisk form av sykdommen [2]. De første stadier av tumorcellemetastase involvere modulering av celle-celle og celle-substrat klebende egenskaper for å lette celle løsgjøring fra vevet av sted invasjon av lokale og distale vev [3]. Nedregulering av celle-celle adhesjon molekyler er en av de viktigste trinn i prosessen av lokale og fjerntliggende prostatatumorinvasjon. Spesielt har endringer i ekspresjon og funksjon av cadherins og deres assosierte proteiner fått oppmerksomhet som viktige regulatorer av tumorprogresjon [4], [5]. Tap av adherens krysset molekylet, P-cadherin, er en tidlig begivenhet i de fleste prostatakreft [6], [7], mens redusert ekspresjon av E-cadherin er forbundet med et mer avansert og aggressiv form av sykdommen [8]. Men på tross av deres uttrykk i prostata vev [9] – [11], er lite kjent om rollen desmosomale cadherins i initiering og progresjon av PCa
Endringer i uttrykket av cadherin-assosierte proteiner. armadillo familien har også vært knyttet til tumorprogresjon og /eller undertrykkelse [12] – [14]. Et slikt protein er en nær slektning av β-catenin som kalles plakoglobin (PG, også kjent som γ-catenin), som kan binde seg til både klassiske og desmosomale cadherins, men finnes primært i desmosomer og er av kritisk betydning i morfogenesen av huden og hjerte [10]. PG har blitt rapportert som en suppressor av tumordannelse i cervical [15], blære [16] og brystkreft [17], og kliniske data tyder på at PG er nedregulert i lokaliserte og mest hormon ildfaste svulster i prostata kreftpasienter [18] . Interessant, i enkelte hormon refraktære tumorer, en mutert versjon av PG er blitt observert i kjerner som korrelerer med økt BCL2 ekspresjon og øket celleoverlevelse [18]. Hvorvidt disse observerte endringene i PG spille en kausal rolle ved PCA progresjon er ikke fastslått.
I tidligere arbeid, viste vi at PG hemmer keratinocyte bevegelighet, blant annet gjennom regulering av celle-celle og celle-substrat heft komponent uttrykket [19], [20]. Gjennom analyse av PCA pasient vevsprøver og en rekke in vitro-vinning og tap av funksjonsstudier, våre data tyder på en modell ved hvilken PG regulerer både celle-substrat interaksjoner og celle-celle-adhesjon ved å dempe vitronektin (VN) -avhengig aktivering av Src. Dette er den første rapporten som desmosomal molekyler kan regulere prostatakreft interaksjoner med ekstracellulære mikromiljøet. Videre våre data heve muligheten for at PG nedregulering under PCa progresjon vil kunne bidra til den kjente VN-avhengige fremme PCa invasjon og metastasering til bein [21].
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og kultur
LNCaP cellene er funksjonelt differensierte, androgen-sensitive menneskelige prostata adenokarcinomceller avledet fra en lymfeknutemetastase [22]. C4-2B celler er en androgen-uavhengig, beinmetastatisk derivat av LNCaP-celler [23]. DU145 cellene er moderat differensiert, androgen-inedpendent menneskelige prostata adenokarcinomceller avledet fra en hjernemetastaser [24]. PC-3 celler er dårlig differensiert, androgen-uavhengig menneskelige prostata adenokarcinomceller avledet fra en ryggvirvel metastase [25]. PC3-M er en meget metastatisk variant av PC-3-cellelinjen [26]. ARCaP celler er androgen-trykt celler som uttrykker funksjonell androgen reseptor [27]. ARCaP
E-celler er en epitelial variant av foreldre ARCaP celler med lav tumorigenicity og ARCaP
M celler er en svært metastatisk mesenchymale variant av foreldre ARCaP celler [28]. PC3-M-celler, LNCaP celler, PC-3 celler (alle gaver fra Dr. Raymond C. Bergan, Northwestern University, Chicago, IL), DU145-celler (en gave fra Dr. Lester F. Lau, University of Illinois, Chicago, IL) og C4-2B celler (en gave fra Dr. RS Taichman, University of Michigan, Ann Arbor, MI) ble dyrket i RPMI 1640 medium (Mediatech) inneholdende 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS) (Invitrogen, Carlsbad , CA), 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Mediatech). ARCaP
E og ARCaP
M celler (Novicure) ble dyrket i Børsverdi media (Novicure) som inneholder 5% varme-inaktivert FBS, 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Mediatech).
Reagenser og antistoffer
pSrc (Y416) polyklonale antistoffer og Src monoklonale antistoffer (for vestlige blotting og immunfluorescens studier i cellelinjer) var fra cellesignalisering Technologies (Danvers, MA). pSrc polyklonale antistoffer (for TMA flekker), Collagen I polyklonale antistoffer var fra Abcam (Cambridge, MA). PG kylling polyklonale antistoffer var fra Aves Labs (Eugene, OR). GAPDH monoklonalt antistoff var fra Millipore (Temecula, CA). HRP-konjugert geite-anti-muse og geite-anti-kanin sekundære antistoffer var fra Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). HRP-konjugert geite-anti-kylling sekundært antistoff var fra Kirkegaard minst 30% av re-belagt celler fortsatt beholdt GFP uttrykk.
siRNA transfections
ARCaP
E, LNCaP og C4-2B celler ble dyrket til 30% konfluens, og deretter ble transfektert med enten individuelt eller et basseng av fire små interfererende ON-TARGETplus RNA (siRNA) for human PG eller med # 2 kontroll ikke-målsøkende sekvens (Dharmacon, Lafayette, CO) på sluttkonsentrasjon på 20 nM ved bruk av Dharmafect en transfeksjon reagens (Dharmacon) i henhold til produsentens anbefalinger. PG siRNA-sekvenser som ble anvendt var som følger: 5′-AGACAUACACCUACGACUC-3 «; 5»-UGAGUGUGGAUGACGUCAA-3 «; 5′-CCACCAACCUGCAGCGACU; 5»-UGUACUCGUCGGUGGAGAA-3 «.
Scratch Sår analysen
PC3-M og ARCaP
M celler ble sådd ut i 24-brønners plater og lov til å feste og spredning. Celler ble transduced med GFP- eller PG-holdige adenovirus. Ved 24 timer etter transduksjon, ble en ripe sår gjort ved å skrape den konfluent monolag med en 20 mL pipette tips. For Src-inhiberingsstudier ble celler behandlet med medium inneholdende Src-inhibitoren PP2 eller DMSO oppløsningsmiddel kontroll i 24 timer forut for skrape såret blir gjort. Celler ble fotografert like etter såret og 24 timer etter såret. Ved 24 timer etter såret, ble celler lysert med ureaprøvebuffer (USB) og lysatene ble brukt til å teste for ekspresjon av PG. ARCaP
E og C4-2B celler ble sådd ut i 24-brønners plater og lov til å feste og spredning. Cellene ble transfektert med kontroll eller PG siRNA. En ripe sår ble gjort 96 timer etter transfeksjon. For Src aktiverings studier ble ARCaP
E celler transduced med GFP-adenovirus eller konstitutivt aktiv Src (caSrc) -adenovirus i 24 timer før scratch såret blir gjort. Celler ble fotografert like etter såret og 18 timer (C4-2B celler) eller 24 timer (ARCaP
E-celler) etter såret. Ved 24 timer etter såret, ble celler lysert med USB og lysater ble analysert ved western blotting for å teste for ekspresjon av PG. Prosentandelen av sårheling ble bestemt ved bruk ImageJ programvare.
Matrigel Invasion Assay
Matrigel invasjonen analysen ble utført som tidligere beskrevet [31] med de følgende modifikasjoner. Den indre brønn av Transwell innsatser (0,8 um; BD Biosciences) ble belagt med 100 ul av Matrigel-basalmembran Matrix (BD Biosciences) og tillatt å permeabilisere ved romtemperatur i 1 time. Den gjenværende væske ble fjernet, og filtrene ble vasket med serumfritt medium og tillatt å lufttørke. PCA celler ble løsrevet ifølge cellelinje spesifikke protokoller (ARCaP
E, ARCaP
M, C4-2B, DU145 og PC-3 celler ble løsnet ved hjelp av trypsin, mens LNCaP og PC3-M-celler ble løsnet ved hjelp av kalsium sequestration) og vasket med serumfritt medium, og 5 x 10
5-celler ble tilsatt til den indre invasjon kammeret. Celler ble tillatt å invadere i 24 timer; ikke-invaderende celler ble fjernet fra brønnene indre ved hjelp av en bomullsdott, og invaderende celler adherente til bunnen av membranen ble fiksert og farget med Diff-Quik farging kit (DADE AG). De invaderer celler ble nummerert med oppreist stereo mikroskop ved hjelp av et 10x objektiv (Nikon).
Immunoblotting
ARCaP
M, C4-2B, og PC3-M-celler ble sådd ut i 6- brønners plater og lov til å feste og spredning. Celler ble transdusert med GFP holdig adenovirus eller PG-inneholdende adenovirus, høstet 24 timer senere med USB og underkastet SDS-PAGE. Etter overføring til en nitrocellulosemembran, ble immunoblot analyse utført med antistoffer mot PG, pSrc, Src, LN, FN, VN, og GAPDH. ARCaP
E og C4-2B celler ble sådd ut i 6-brønners plater og lov til å feste og spredning. Cellene ble transfektert med PG siRNA eller # 2 kontrollsekvens siRNA. Etter 96 timer ble cellene lysert med USB og underkastet SDS-PAGE, overført til en nitrocellulosemembran, og deretter underkastet immunoblotanalyse med antistoffer mot PG, VN, FN, Col IV, og GAPDH. Quantitations av båndintensitetene ble utført ved anvendelse av Analyser Geler verktøyet ifølge programvare ImageJ.
mekanisk styrke (Dispase) analyse
LNCaP, C4-2B, og PC3-M-celler ble sådd ut i 6- brønners plater, og lov til å feste og spredning. Kulturer ble transdusert med GFP holdig adenovirus eller PG-inneholdende adenovirus, og etter 24 timer ble dispase analysen ble utført. For Src-inhiberingsstudier ble celler behandlet med medium inneholdende PP2 (10 uM) eller DMSO (kontroll løsningsmiddel) i 24 timer før gjennomføring av den dispase analyse som beskrevet [32]. Kort sagt ble sammenflytende cellekulturer ble vasket med PBS og inkubert med 2,4 E /ml, dispase i 30 minutter ved 37 ° C. Frigitte monolag ble utsatt for mild mekanisk belastning, og deretter fiksert med formalin. Fragmenter ble regnet med en dissekere omfang (Leica, MZ6) som beskrevet [32] eller avbildes med et Hamamatsu Orca digitalkamera (modell C4742-95) og analysert ved hjelp av MetaVue bildebehandlingsprogrammer (Molecular Devices). Data er uttrykt som gjennomsnittlig antall fragmenter ± SEM. Statistisk analyse ble gjort ved hjelp av en student
t
test.
Hengende Drop Aggregation analysen
Den hengende dråpe Analysen ble utført som beskrevet tidligere [32], med følgende modifikasjoner. Kulturer av PCA cellelinjer ble frittliggende slik som beskrevet ovenfor, sentrifugert og resuspendert i den passende kulturmediet. Dråper (20 ul) av cellesuspensjoner ble sådd ut på den indre overflate av en 35-mm kulturskål lokk og dyrket i 20 timer. For å begrense fordamping ble 2 ml PBS tilsatt til bunnen av kulturskåler. For å sammenligne lignende tettheter av celler suspendert i rulle, 4 × 10
3 celler ble undersøkt. For å undersøke evnen til cellene til å danne aggregater etter 24 timer ble kulturskål lokkene invertert, og de hengende dråper ble flatet med et dekkglass for avbildning. For å undersøke klebestyrken av de cellulære aggregater, ble parallelle kulturer gnidd 10 ganger gjennom en 20-mL pipettespiss (pre-vasket med 0,1% Triton X-100 /PBS) og deretter skyllet 3 ganger i PBS før avbildning. Fem tilfeldige felt av fase kontrast fra hver hengende dråpe ble anskaffet ved hjelp av en Zeiss Axiovert 200 invertert mikroskop med en Zeiss Axiocam kamera og Zeiss Axiovision programvare. Det totale antallet cellegruppene ble regnet fra tredoble hengende dråper.
immunfluorescens
ARCaP
E, ARCaP
M, LNCaP, C4-2B, DU145, PC-3, og PC3-M-celler ble dyrket på dekkglass, skyllet i fosfat-bufret saltvann (PBS) og fiksert i vannfri metanol i 2 minutter ved -20 ° C. De ble deretter inkubert med kylling anti-PG (1407) (1:1000) og muse anti-E-cadherin (HECD-1) antistoffer (1:100) over natten ved 4 ° C. Primære antistoffer ble visualisert ved anvendelse Alexa Fluor 350, 488 og 568-konjugerte geit sekundære antistoffer mot mus, kanin og kylling IgG (1:400), respektivt. Dekk ble undersøkt med en Leica oppreist mikroskop modell DMR (Deerfield, IL), og bildene ble tatt med en Hamamatsu Orca digitalkamera modell C4742-95 (Bridgewater, NJ) og Metamorph 7,6 (Molecular Devices) bildebehandlingsprogrammer.
tissue Microarray farging, Imaging, og Fluorescent Intensitet Analyse
parafin-embedded prostatavevet mikromatriser (BC19021) som inneholder 72 kjerner fra 20 tilfeller ble kjøpt fra USA Biomaks (Rockville, MD), og ble behandlet for immunhistokjemisk farging som beskrevet [33]. Antigen gjenfinning ble utført ved oppvarming av glass-slide til 95 ° C i 0,01 M citratbuffer. Microarray ble blokkert i 2% normalt geiteserum (Jackson Immunoresearch Laboratories) og 1% BSA i 60 minutter ved 37 ° C, og deretter inkubert med primære antistoffer mot PG, VN og pSrc over natten ved 4 ° C i et fuktet kammer. Microarray ble inkubert i AlexaFluor-konjugert sekundært anti-kylling (633), en mus (488) og kanin (568) antistoffer i 60 minutter ved 37 ° C, og dekkglass ble montert i polyvinylalkohol. PG, VN, og pSrc ble visualisert ved hjelp konfokalmikroskopi (Cell Imaging Facility, Northwestern University), innen 3 dager etter behandling. Identiske oppkjøps innstillinger ble brukt for alle bildene for å sikre at bildepikselintensiteten kan sammenlignes. Bilder ble tatt ved 40X forstørrelse, med minst 4 bilder per vev kjerne tatt. Relative fluorescerende intensitet ble bestemt ved hjelp av MetaMorph 7,6 software (Molecular Devices), som beskrevet for [34] med de følgende modifikasjoner. Hver rå, umettet bilde ble satt til en 16 bit utvalg (skala fra 0 til lav og 255 for høy), og ble inkluderende terskel. Measure-Grid-funksjonen ble brukt til å velge områder av tumoren som skal analyseres. Hver rutenettet var 40 × 40 ruter (30.86 pm
2 /kvadrat). Den gjennomsnittlige intensiteten av terskel-områdene ble automatisk beregnet ved MetaMorph for hver rute. Grid firkanter med intensitet fra 0 ble ekskludert fra den gjennomsnittlige intensiteten beregning for hele rutenettet. Tumor oppsetning har vært preget av US-Biomaks, i henhold til den skala som brukes TNM ved UICC [35]. Primær tumor (T) staging kriterier for prostatakreft ble brukt som følger: T1, Klinisk unapparent svulst; T2, Tumor begrenset innenfor prostata; T3, strekker Tumor gjennom prostata kapsel; T4, invaderer Tumor tilstøtende strukturer enn sædblærene. Detaljert beskrivelse av vev som brukes for microarray kan finnes på selskapets hjemmeside https://www.biomax.us/tissue-arrays/Prostate/BC19021. I tillegg ble prostatahyperplasi adenokarsinom gradert av en ekspert genitourinary patolog (Ximing J. Yang) bruker Gleason gradering systemet, som er utelukkende basert på de arkitektoniske elementene av kreftceller.
statistiske metoder
cellekultur eksperimenter ble utført med 3 eller flere replikater. Verdiene er gitt som mener med feilfelt som indikerer SEM. Statistiske analyser ble utført ved bruk av GraphPad Prism software versjon 5.02 for Windows (San Diego, USA). Alle statistiske tester var to-sidig. T-test for søylediagrammet sammenligninger ble utført. Lineær regresjon ble utført for linjediagrammer som sammenligner ekspresjon av VN og PG eller pSrc og PG, med R kvadrert verdi som representerer godheten av tilpasningen av linjen. p 0,1 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
PG er Mislocalized og dens uttrykk er redusert i Prostate Cancer vevsprøver og cellelinjer
Flere rapporter i litteraturen har antydet. at PG ekspresjon blir redusert i kliniske PCA prøvene sammenlignet med normalt vev [18], [36], [37]. Men om modulering av PG uttrykk er ansvarlig for noen av de fysiologiske og molekylære hendelser ved PCA tumorigenesis ennå ikke er mekanistisk studert. For å løse dette problemet og få en bedre forståelse av forholdet mellom PG uttrykk og omfanget av primær prostata svulst invasjonen, ble PCA vev microarray med 72 kjerner fra 20 prostatakreftpasienter analysert for PG uttrykk. Vi har observert en reduksjon i generell PG-ekspresjon i alle maligne prøvene sammenlignet med normalt vev, så vel som en forsvinning av PG fra celle-cellegrensene, hvor det normalt er lokalisert (fig. 1A). Analyse av PG fluorescensintensitet viste i gjennomsnitt ~ 50% mindre PG i primærtumorprøver av alle Gleason Karakterer og trinnvis T1 gjennom T3, sammenliknet med normalt vev (fig. 1B-C). Videre, i invasive T4-tumorer var det en ytterligere ~ 30% reduksjon i PG (fig. 1C). Disse funn indikerte at PG-ekspresjon ble redusert og mislocalized i primær prostata kreftvev i forhold til normal prostatavevet. I tillegg er ytterligere tap av PG i invasive (T4) tumorprøver øker muligheten for at PG spiller en rolle i å undertrykke PCa invasjon.
A-C. En prostata vev microarray ble farget med et antistoff mot PG. A, Representative immunofluorescens bilde som viser PG ekspresjon i normalt prostatavev (øverst) og T3 (nederst) prostatavevet. Bar representerer 50 mikrometer. B. Kvantifisering av PG-ekspresjon i normalt prostatavev, sammenlignet med vev fra prostata tumorer med Gleason grad mindre enn eller lik 6 (6 tumorer), 7 (5), eller er større enn eller lik 8 (33). PG uttrykk er høy i normalt vev (svart) og er redusert med -50% i svulstvev fra alle Gleason karakterer. Gleason gradering ble utført ved kirurgisk patolog Ximing Yang. C. Kvantifisering av PG uttrykk i normal prostata vev i forhold til scenen T prostata svulstvev. PG er sterkt uttrykt i normalt vev (svart) og uttrykket er redusert med ~40% i stadium T1-T3 prostata svulstvev og med nesten 70% i T4 prostata svulstvev. Tumor oppsetning er blitt karakterisert i henhold til den skala som brukes TNM ved UICC [35]. Primær tumor (T) staging kriterier for prostatakreft ble brukt som følger: T1, Klinisk unapparent svulst (3 svulster); T2, Tumor innelukket i prostata (33); T3, strekker Tumor gjennom prostata kapselen (9); T4, invaderer Tumor tilstøtende strukturer enn sædblærene (3). I tillegg var det 8 normale prostata vevsprøver i tabellen. Grafer representerer gjennomsnitt +/- SEM. * P 0,05; ** P 0,002; *** P 0,0005; **** P . 0,0001, etter paret t test
Deretter PG uttrykk nivåer og distribusjon ble vurdert i et panel av syv PCA cellelinjer som varierer i sine tumorigene egenskaper. Generelt er de cellelinjer som er beskrevet i litteraturen som å ha flere metastatisk potensial (ARCaP
M, C4-2B, og PC3-M) utviste flere ganger lavere enn PG uttrykk gjorde mindre aggressive linjer (LNCaP og ARCaP
E). Mens moderat differensierte DU145-celler uttrykte mer PG enn de andre cellelinjer, PG oppviste en mer diffus cytoplasmisk og nukleære lokaliserings stedet for å bli konsentrert på celle-celle grensesnitt (fig. 2A, B). Tilsvarende aggressive ARCaP
M og C4-2B linjer viste svak og diffus farging for PG. Endelig, PC3-M-celler, uttrykte metastatisk variant av PC-tre cellelinje mindre PG enn PC-3 celler (Fig. 2A, B). Interessant nok, selv om de oppviste samlet lavere nivåer enn PG-PC3-M-celler, C42B cellene vise fremdeles noen nukleær farging (fig. 2B). Samlet disse dataene viser en trend med redusert PG uttrykk og et tap av celle-celle grensen lokalisering av PG i de aggressive PCA cellelinjer.
A. Prostatacancercellelinjer ble lysert og underkastet SDS-PAGE, etterfulgt av immunblotting med antistoffer mot PG og GAPDH. PG-nivåer ble bestemt ved å normalisere til GAPDH nivåer for hver cellelinje ved hjelp av Image J. immunoblot viser at ekspresjonen av PG i prostatacancercellelinjer inverst korrelert med graden av aggressivitet av cellelinjen. B. prostatakreft cellelinjer ble platet på dekk og lov til å feste og spredning. Immunfluorescens ble utført ved hjelp av antistoffer mot PG å demonstrere lokalisering av PG i ARCaP
E, ARCaP
M, LNCaP, C4-2B, DU145, PC-3, og PC3-M cellelinjer. Den immunfluorescens viser svakere fargingen og et tap av celle-celle-grensen lokalisering av PG i de mer aggressive cellelinjer (ARCaP
M, C4-2B, og PC3-M). Representanter for minst tre uavhengige immunoblotter vises, med tall som representerer GAPDH normalisert PG proteinnivåer for blot vist. Alle PG protein nivåer ble normalisert til ARCaP
E nivåer innenfor hver blot. Den gjennomsnittlige nivå og standardavvik av PG proteinnivåer i panel A er som følger: ARCaP
E 1.0, ARCaP
M 0,3 +/- 0,2, LNCaP 1,5 +/- 0,5, C4-2B 0.5 +/- 0.2 , DU145 3,4 +/- 1,2, PC-3 1,0 +/- 0,4, PC3-M 0,5 +/- 0,2.
PG fremmer celle-celle adhesjon av PCA Cells
i lys av det faktum at et kjennetegn av invasiv kreft er evnen av maligne celler for å koordinere svekkelse av deres celle-celle adhesjon med forandringer i de funksjonelle interaksjoner med det underliggende substrat [3], vi neste undersøkt hvorvidt eksperimentell manipulasjon av PG nivåer (fig. S1 og S2) påvirkes celle-celle-adhesjon i PCA-celler. PC3-M-celler, C4-2B celler, og LNCaP-celler ble transdusert med PG-uttrykkende adenovirus og et dispase analyse ble utført for å måle intercellulær adhesjon fasthet (Fig. 3A). Celle-celle adhesjon ble betydelig økt i alle celler transduced med PG-uttrykkende adenovirus (PG OE) sammenlignet med celler transduced med kontroll (GFP) adenovirus (Fig. 3A-B).
A. Representant bilde av en dispase analyse i PC3-M-celler etter transduksjon med PG OE adenovirus eller kontrollere GFP adenovirus. B. Quantitations av Dispase analyser utført in triplo; LNCaP, C4-2B, eller PC3-M-celler ble sådd ut i 6-brønners plater, og lov til å feste og spredning. Kulturer ble transdusert med GFP holdige adenovirus (GFP) eller PG-inneholdende adenovirus (PG OE), og etter 24 timer ble dispase analysen ble utført. Overekspresjon av PG i alle tre cellelinjer styrker celle-celle adhesjon. C. LNCaP-celler ble sådd ut i 6-brønners plater og tillatt å feste og spredning. Cellene ble så transfektert med kontroll siRNA eller PG siRNA bassenget. Den dispase Analysen ble utført 96 timer etter transfeksjon. Undertrykkelse av PG uttrykk resulterer i en svekkelse av celle-celle adhesjon i LNCaP celler. D. Representant bilde av en hengende dråpe analyse i DU145 cellene etter transfeksjon med kontroll eller PG siRNA bassenget. E-F. Kvantifisering av hengende slipp analyser utført i tre eksemplarer; C4-2B og PC3-M-celler ble transdusert med GFP- eller PG-holdige adeno-virus (E), ARCaP E, LNCaP, DU145 og PC3-celler ble transfektert med kontroll siRNA eller PG siRNA basseng (F). Aggregering analyser ble utført 24 timer (E), eller 96 h (F) etter behandling. Grafer representerer gjennomsnitt +/- SEM. * P 0,06; ** P 0,005; *** P . 0,0007, etter paret Student t-test
Interessant, overekspresjon av PG i LNCaP celler som allerede uttrykker betydelige nivåer av PG, førte til en ytterligere økning i inter vedheft styrke og celle -celle kryss farging av E-cadherin (fig. 3B og S3 fig.), noe som tyder på at tilstedeværelsen av ytterligere PG kan ytterligere å stabilisere adherens knutepunktene i PCa. I tillegg, i ARCaP
M celler, overekspresjon av PG resulterte i en opp-regulering av desmosomal komponenten desmoplakin (fig. S3), noe som indikerer en potensiell stabiliserende effekt av PG på desmosomale veikryss i PCa også. På den annen side er banket ned PG ekspresjon i LNCaP-celler førte til en betydelig svekkelse av celle-celle adhesjon (Fig. 3C). Videre nedregulering av PG førte til en reduksjon av både E-cadherin og desmosomal cadherin desmoglein 2 i ARCaP
E-celler (fig. S3), fremhever gang viktigheten av PG for stabiliteten i adherens og desmosomale veikryss ved PCA . Disse resultatene kollektivt støtter forestillingen om at PG uttrykk styrker celle-celle adhesjon i PCA celler.
For ytterligere å bekrefte effekten av PG på PCa celle-celle adhesjon, vi utførte aggregering (hengende dråpe) analyser av celler i suspensjon (fig. 3D). Denne analysen ble tidligere brukt til å kvantifisere adhesjonsstyrken av en rekke av epitelceller, inkludert A431, MDCK og SCC68 [38] – [40]. For å teste celle-celle adhesjon styrken vi utsettes tilslag for skjærkraft. Antallet av fragmenter fremstilt ved skjæring av aggregater ble signifikant redusert i de cellelinjer som overuttrykker PG sammenlignet med kontrollen (Fig. 3E). I tillegg er banket ned PG førte til en betydelig økning i antall fragmenter, noe som antyder at svekkelse av celle-celle adhesjon motstand mot skjærkraft (fig. 3d, F).
PG Hemmer motilitet og invasjon i PCA celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
Som svekkelse av celle-celle adhesjon er blitt rapportert å øke celle motilitet [41], vi neste undersøkt om PG status i celler korrelerte med deres relative bevegelighet. Mot dette formål, utførte vi en ripe såret analyse for å sammenligne bevegeligheten av PC3-M, ARCaP
M, ARCaP
E, og C4-2B celler. Analysen viste at PC3-M og ARCaP
M-celler ble sterkt motile (med over 50% av såret lukket i 24 timer), mens ArCaP
E- og C4-2B celler var mindre motile (rundt 20% lukket i 24 h) (fig. 4A, B). Vi deretter overuttrykt PG i PC3-M og ARCaP
M-celler, noe som reduserte deres motilitet ved to-ganger sammenlignet med kontrollen (Fig. 4A). På samme tid, knockdown av PG i ARCaP
E og C4-2B celler resulterte i en omtrent 50%, og i løpet av to-gangers økning i deres motilitet, henholdsvis (fig. 4B). Disse funnene kollektivt støtter ideen om at ectopically uttrykke PG hemmer motilitet av PCA celler, mens stanse PG øker deres bevegelighet.
A. PC3-M og ARCaP
M ble belagt i 24-brønners plater og lov til å feste og spredning. Cellene ble så transdusert med GFP holdig adenovirus eller PG-inneholdende adenovirus, og etter 24 timer en ripe såret ble laget. Bilder ble tatt ved 0 og 24 timer, og den% til lukking av sår ble beregnet ved å sammenligne størrelsen av såret på 24 timer til 0-timerstidspunktet for hver tilstand. Overekspresjon av PG undertrykker motilitet i disse to cellelinjene. B. ARCaP
E og C4-2B celler ble sådd ut i 24-brønners plater og lov til å feste og spredning. Cellene ble så transfektert med kontroll siRNA eller PG siRNA basseng, og 72 timer etter transfeksjonen ble skrape sår laget. Undertrykkelse av PG fører til en økning i motilitet i ARCaP
E og C4-2B celler. Scratch såret analyse gjort i tre eksemplarer i prostata kreft cellelinjer etter overekspresjon eller knockdown av PG. C. ARCaP
M, C4-2B, DU145 og PC3-M-celler ble transdusert med GFP holdig adenovirus eller PG-inneholdende adenovirus, og etter 24 timer sådd ut på Matrigel belagt Transwell-membraner til en invasjon assay. Overekspresjon av PG undertrykker invasjon i disse fire cellelinjer. D. ARCaPE, LNCaP, C4-2B, DU145, PC-3 og PC3-M-celler ble transfektert med kontroll siRNA eller PG siRNA basseng, og 72 timer etter transfeksjon, sådd ut på Matrigel belagt Transwell-membraner til en invasjon assay. Undertrykkelse av PG fører til en økning i invasjon i disse seks cellelinjer.
