Abstract
Bakgrunn
Serum markører representerer potensielle verktøy for påvisning av tykk- og endetarmskreft (CRC). Målet med denne studien var å få proteomikk uttrykk profiler og identifisere serummarkører for tidlig deteksjon av CRC.
Metoder
proteomikk profiler av serumprøver samlet inn fra 35 friske frivillige, 35 pasienter med avansert kolorektal adenom (ACA), og 40 pasienter med CRC ble sammenliknet med Clinprot teknologi. Ved hjelp av enzymbundet immunosorbentanalyser (ELISA), ble 366 seraprøver i tillegg analysert, og immunhistokjemi studier av 400 vev ble brukt til å bekrefte uttrykk for kininogen-en og dens verdi i tidlig deteksjon av CRC.
Resultater
Varsling av modellene ble etablert mellom de tre gruppene, og kininogen-en ble identifisert som en potensiell markør for CRC bruker Clinprot teknologi. ELISA også påvist signifikant høyere serum kininogen-1-nivåer i ACA og CRC pasienter sammenlignet med kontroller (
P
0,05). Videre er området under mottakeren opererer karakteristiske kurve (AUC) for serum kininogen-1 i diagnosen av ACA var 0,635 (p = 0,003), og for serum-carcinoembryonic antigen (CEA) var 0,453 (p = 0,358). Sensitiviteten, spesifisitet og nøyaktighet av serum kininogen-1 for diagnostisering av Dukes fase A og B CRC var 70,13%, 65,88% og 67,90%, henholdsvis, mens serum CEA var 38,96%, 85,88% og 63,58%, henholdsvis. Videre immunhistokjemi viste at uttrykket av kininogen-en var signifikant høyere i CRC og ACA vev enn i normal slimhinne (48.39% vs 15,58% vs. 0%,
P
0,05).
Konklusjoner
Disse resultatene tyder på at Clinprot teknologien gir et nyttig verktøy for diagnostisering av CRC, og kininogen-en er en potensiell serum biomarkør for tidlig deteksjon av avansert kolorektal adenom og CRC.
Citation: Wang J, Wang X, Lin S, Chen C, Wang C, Ma Q, et al. (2013) Identifisering av kininogen-en som en Serum biomarkør for tidlig deteksjon av avansert kolorektal Adenom og tykktarmskreft. PLoS ONE 8 (7): e70519. doi: 10,1371 /journal.pone.0070519
Redaktør: Mitsunobu R. Kano, Okayama University, Japan
mottatt: 14 november 2012; Godkjent: 25 juni 2013; Publisert: 23.07.2013
Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Science and Technology Planning Project i Guangdong-provinsen (2010B031600098) og Science and Technology Development Program for Guangzhou kommune (2.060.402). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
det er anslått at mer enn 143.000 mennesker i USA vil bli diagnostisert med tykktarmskreft (CRC) i 2012, og mer enn 50.000 personer vil dø av denne sykdommen [1]. Ved screening gjennomsnittlig risiko individer, er det en hypotese at CRC kunne påvises i en tidlig fase, og dermed redusere dødelighet assosiert med CRC [2] – [4]. Foreløpig kan CRC screening inkludere en fekal okkult blod test, sigmoidoskopi og koloskopi [5]. I mange ressurs begrenset land, fekal skjult blod først og fremst brukes, til tross for den manglende følsomhet av denne analysen [6], [7]. Dessuten, med sigmoidoskopi og koloskopi være invasiv og upraktisk prosedyrer, søknad om CRC screenings har vært begrenset [8]. Derfor er mindre invasive og ikke-invasive metoder for å forbedre følsomheten og pasientens etterlevelse i CRC screenings.
Identifiseringen av serologiske biomarkører spesifikk for CRC kunne gi en relativt ikke-invasiv og økonomisk fordelaktig metode for påvisning av CRC i forhold til dagens screening alternativer. Imidlertid er serum et kompleks av kroppsvæske som inneholder mange forskjellige proteiner. For eksempel har mer enn 10.000 forskjellige proteiner blitt påvist i humant serum, og mange proteiner som utskilles eller skur av celler under forskjellige fysiologiske eller patologiske prosesser [9], [10]. Derfor er det vanskelig å identifisere en sykdomsspesifikt serum markør. På grunn av fremskritt i proteomikk metoder, er det nå mulig å raskt identifisere nye kandidat markører for kreft. For eksempel har mange studier demonstrert kapasiteter for matriks-assistert laserdesorpsjon /ionisering time-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF-MS) for å separere komplekse blandinger av proteiner, for derved å lette en sammenligning av variasjoner i proteinekspresjon for normal og kreftserumprøver [11] – [13]. Spesielt Clinprot teknologi, som er basert på MALDI-TOF-MS, har mange fordeler for klinisk anvendelse, herunder dets følsomhet, enkel bruk, og kapasiteten for high-throughput-analyse [14], [15].
Ved hjelp av MALDI-MS, Seraglia
et al.
[16] tidligere rapportert kininogen-en for å være en potensielt ny plasma markør for CRC. Kininogen-1 er et multifunksjonelt protein som spiller en viktig rolle i mange patofysiologiske prosesser [17], inkludert fibrinolyse, trombose og inflammasjon, så vel som å ha en rolle i onkogenesen [18]. For å bekrefte disse resultatene, og for å identifisere ytterligere roman plasmamarkører for CRC, sera fra pasienter med CRC ble pasienter med avansert kolorektal adenom (ACA), og friske individer analysert ved hjelp Clinprot teknologi, enzym bundet immunosorbentanalyser (ELISA), og immunhistokjemi.
Materialer og metoder
pasient~~POS=TRUNC
Alle prøvene ble samlet inn fra Nanfang Hospital. Sera ble samlet mellom 1 oktober 2009 og 31. desember, ble 2010. parafininnstøpte vev samlet mellom 1 april 1999 og 31. desember 2007. Pasienter med en kjent historie med familiær adenomatøs polypose, arvelig nonpolyposis tykktarmskreft, høyt blodtrykk, noe annet svulster, og åpen inflammatoriske sykdommer, ble ekskludert. Følgende faktorer ble registrert for hver vev: pasientens alder, pasientens kjønn, tumorstørrelse, tumor sted for CRC og ACA, vev histologi og svulst klasse for intraepitelial neoplasi for ACA, differensiering, Duke etappe, og Tumor-Node-metastaser (TNM) stadium (7. utg) for CRC. Kolorektal adenom pasienter som har minst ett adenom ≥10 mm, eller å ha en villøse struktur eller carcinoma
in situ
, ble klassifisert som ACA pasienter [19].
Denne studien ble utført i samsvar med institusjonelle etiske retningslinjer og ble godkjent av Medical Ethics Committee of Southern Medical University (# 2011119). Skriftlig samtykke skjemaer ble innhentet fra alle pasienter.
Prøvepreparering
Sera ble samlet fra friske frivillige, ACA pasienter, preoperative CRC pasienter (innhentet før noen klinisk behandling), og postoperative CRC pasienter (oppnådd syv dager etter kirurgi). For Clinprot analyse, ble totalt 110 seraprøver hentet fra friske frivillige (n = 35), ACA pasienter (n = 35), og preoperative CRC pasienter (n = 40). For ELISA, ble totalt 366 sera hentet fra ytterligere 85 friske frivillige 80 ACA pasienter, 143 preoperative CRC pasienter, og 58 postoperative CRC pasienter. Asymptomatiske og tilsynelatende friske frivillige ble valgt som ikke har en tidligere historie av kreft. Alle prøver ble samlet opp i 5 ml serum separator-rør, og deretter ble inkubert ved romtemperatur i 30 minutter. Etter sentrifugering ved 3000 rpm i 10 min, ble sera fordelt i 50 pl aliquoter og lagret ved -70 ° C inntil behov.
I alt 400 parafininnstøpte vev ble analysert ved hjelp av immunhistokjemi, inkludert 75 normal tykktarmsslimhinne vev som ble samlet fra friske frivillige som gjennomgikk en endoskopisk slimhinnebiopsi. I tillegg ble 77 ACA vev oppsamlet fra ACA pasienter som gjennomgikk endoskopisk reseksjon, og 248 CRC vev ble samlet fra CRC-pasienter som gjennomgikk kirurgi. Alle prøver ble fiksert i 10% formalin løsning og innstøpt i parafin. Seksjoner (4 mikrometer) ble kuttet og forberedt for hematoksylin-eosin flekker og immunhistokjemi analyser.
Utvinning av Peptider fra Serum Ved hjelp av magnetiske kuler, etterfulgt av MALDI-TOF-MS analyse
Serum peptider var separeres og renses ved hjelp av en magnetisk kule-baserte svak kationebytterkromatografi rensesett (Bruker Daltonics GmbH). Totalt 110 seraprøver ble fraksjonert i henhold til standardprotokollen foreslått av produsenten. Streng kvalitetskontroll ble opprettholdt for å sikre nøyaktighet og reproduserbarhet av resultatene oppnådd. Serum peptid profiler ble deretter analysert ved hjelp av en Ultraflex MALDI-TOF /TOF-MS (Bruker Daltonik, Bremen, Tyskland). Spektra ble kjøpt i masse /ladning (m /z) spekter av 1000 til 10000 hjelp FlexAnalysis programvare (Bruker Daltonics).
Clinpro Tools programvare 2.2 (Bruker, Daltonik) ble benyttet for analyse av alle data avledet fra serumprøver. Dette inkluderte rådata innhentet før behandling, baseline subtraksjon av spektra, normalisering av spektra, intern peak justering ved hjelp av fremtredende topper, og en topp plukking prosedyre. Videre ble forbehandlet data visualisert og statistisk analysert ved hjelp av t-test og genetiske algoritmer (GA). I tillegg ble prediksjonsmodeller etablert ved hjelp av GA. For å bestemme nøyaktigheten av prediksjonsmodeller generert, ble kryssvalidering utført. Kort sagt ble alle prøver valgt som et treningssett i klassen prediktor-algoritmen, da de samme prøvene med unntak av en tilfeldig valgt prøve ble anvendt som et testsett. En «test» da var utført ti ganger tilfeldig.
Peptide Identifikasjon av MALDI-TOF /TOF
Etter fullført statistisk analyse, forskjellig uttrykt peptider ble identifisert. Til å begynne med ble de mono-isotopisk masser av peptider i m /z området 1000 til 3000 bestemt ved anvendelse av et reflekterende modus. Etter MS /MS spektra av forløperionene ble kjøpt i TOF /TOF-modus, ble MS /MS-data utsatt for en Mascot database søk for å identifisere de tilsvarende full-lengde protein kampene.
Enzyme-linked immunosorbent assay ( ELISA)
Alle sera ble analysert på en blindet måte, og standarder og prøver ble kjørt i tre eksemplarer. Kininogen-1-konsentrasjonene ble kvantifisert ved hjelp av en menneskelig kininogen ELISA Kit (No. EK2001-1, Assaypro, MO, USA). I korte trekk: (1) 25 ul standard eller prøve og 25 ul biotinylert kininogen ble tilsatt til 96-brønners polystyren-mikroplater belagt med et polyklonalt antistoff mot humant kininogen. Etter 2 timer ved romtemperatur, ble platene vasket fem ganger, deretter 50 ul streptavidin-peroksydase-konjugat ble tilsatt til hver brønn. Etter 30 minutter ved romtemperatur ble platene vasket fem ganger, og 50 pl kromogen substrat ble tilsatt til hver brønn. Etter en blå farge tilstrekkelig utviklet, ble 50 ul stoppløsning tilsatt til hver brønn og absorbans-verdiene ved 450 nm ble registrert ved anvendelse av en mikroplateleser. En standardkurve ble generert og anvendt for å bestemme konsentrasjoner av kininogen-1 til stede i de analyserte prøvene.
å påvise serumnivåer av CEA, et kommersielt tilgjengelig enzym-immunoassay kit (Whiga, Guangzhou) ble anvendt i henhold til produsentens instruksjoner.
Immunohistochemistry
kininogen-1 antistoff ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (sc-25799, CA, USA). En tidligere publisert protokoll ble anvendt for analysene immunhistokjemi [20], med kininogen-1-antistoff fortynnet 1:150. Alle delene ble blindt og uavhengig vurdering mikroskopisk av to veltrente patologer. Intensiteten av farging ble vurdert ved hjelp av en semikvantitativ scoring system som følger: 0, negativ farging; 1, svak flekker; 2, moderat farging; og 3, sterk farging. Fordelingen av farging ble også gradert i henhold til den prosentandel av fargede celler til stede i området av interesse: 0, positive celler utgjøres 10% av tumorceller; 1, positive celler utgjorde 10-50% av tumorceller; 2, positive celler utgjorde 50-75% av tumorceller; eller 3,-positive celler som utgjøres 75% av tumorcellene. Skår for intensitet og fordeling ble tilsatt for å gi en total poengsum for hver prøve. Kort fortalt ble prøver som fikk null poeng anses negative (0), ble tilfeller mottar 1-3 poeng anses svakt positiv (1+), saker som fikk 4-7 poeng ble ansett som moderat positive (2+), og saker som får en endelig poengsum 7 ble vurdert sterkt positiv (3+)
Statistical Analysis
statistiske analysene ble utført ved hjelp av SPSS 13.0.. For å teste forskjeller mellom gruppene ble Chi-square test anvendt, med unntak av at t-test ble anvendt for å alder. Korrelasjoner mellom immunhistokjemiske score fastsatt for kininogen-en og clinicopathological parametere for kohorten ble evaluert ved bruk av Spearman rank-order korrelasjonskoeffisient. Konsentrasjoner av kininogen-1 og CEA ble funnet å ha en normalfordeling. Derfor ble disse data sammenlignes ved hjelp av en enveis variansanalyse test. I motsetning til dette, ble multiple sammenligninger analysert ved anvendelse av LSD-metoder. Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM). Mottaker bruksegenskap (ROC) kurver ble anvendt for å bestemme verdiene av serum kininogen-1 og CEA for diagnostisering av kolorektale tumorer. Kaplan-Meier (Log-rank test) ble brukt for overlevelsesanalyse. For alle analysene ble en P-verdi mindre enn 0,05 ansett som signifikant.
Resultater
proteomikk Profiler av ACA og CRC Pasient Serum
En totalt 110 seraprøver hentet fra 35 friske frivillige (kontroller), 35 ACA pasienter, og 40 preoperative CRC pasienter ble utsatt for Clinprot analyse. De viktigste klinisk-patologiske kjennetegn ved pasientene er vist i tabell S1. Representative spektra for hver av disse gruppene er vist i fig. 1A, og forskjeller i topp-posisjon og toppintensitet kan observeres. Ved hjelp av MALDI-TOF-analyse, ble 70 skjelnes topper i 1000 til 10000 m /z området, definert mellom seraprøver fra kontroller og ACA-pasienter, og 43 av disse toppene var statistisk signifikant (P 0,01, detaljer i Materials S1). I tillegg 61 toppene var skilles mellom kontrollsera og CRC pasientserum med 54 av disse toppene være statistisk signifikant (P 0,01, detaljer i Materials S2)
A:. Representative massespektra av kontrollserum (en ), serum fra en pasient med ACA (b), og serum fra en pasient med CRC (c). B: MALDI /MS /MS-spektrene av ioner ved m /z 1943,95 (a) og m /z 2081,01 (b). Panel c gir resultatene fra Mascot database-søk, som indikerte begge toppene tilsvarer kininogen-en.
Ved hjelp av hver femte topp, GA var i stand til å generere kryss-validerte klassifiseringsmodeller for de ulike gruppene. De beste prediksjonsmodeller (detaljer i tabell 1) oppnådd en anerkjennelse kapasitet på 98,96%, 100,00%, og 100,00% for sammenligninger av CRC og kontroll, ACA og kontroll, og ACA og CRC, henholdsvis. Videre kryss gyldighet estimater var 95,49%, 100,00%, og 98,19%, henholdsvis.
Identifikasjon av CRC Markers
En høyere konsentrasjon av peptider med m /z verdier av 1943 og 2081 var tydelig i CRC spektra, men ikke kontroll spektra (
P
0,01). Ved hjelp av MALDI-TOF /TOF-MS og Mascot database (Fig. 1B), MS /MS fragmentering av disse to peptider identifisert følgende sekvenser, henholdsvis NLGHGHKHERDQGHGHQ og HNLGHGHKHERDQGHGHQ,. Videre ble disse peptidene funnet å representere regioner i samme kininogen-en forløper, a2-tiol proteinase inhibitor.
serumkonsentrasjoner av kininogen-1 og CEA for de ulike Sera grupper
For å validere ekspresjon av kininogen-1 detektert i sera fra pasienter med CRC, ble serum ELISA-analyser utført ved anvendelse av 366 sera erholdt fra 85 friske frivillige, 80 ACA pasienter, 143 preoperative CRC-pasienter, og 58 postoperative pasienter CRC. Alder, kjønn, serum kininogen-en konsentrasjoner og CEA konsentrasjoner mellom ulike grupper ble vist i Tabell 2. Gjennomsnittlige konsentrasjoner av kininogen-1 oppdaget i kontrollene og preoperative CRC pasientene var 153,22 ± 8,43 mg /ml og 215.62 ± 7,63 mikrogram /ml, henholdsvis med den sistnevnte er signifikant høyere (
P =
0,000). I tillegg nivåer av kininogen-en var signifikant lavere hos CRC pasienter etter kirurgi (188,04 ± 11,70 mg /ml;
P =
0,044). For ACA pasienter var gjennomsnittlig kininogen-1-konsentrasjonen detektert var 194,26 ± 10,14 pg /ml, som var signifikant høyere enn i kontrollgruppen (
P =
0,003). I kontrast, var det ingen signifikant forskjell mellom kininogen-1-konsentrasjonene oppdaget for preoperative CRC pasienter og ACA pasienter (
P =
0,082).
For serum CEA konsentrasjoner, nivåer for preoperativ CRC pasienter, postoperative CRC pasienter, ACA pasienter og kontroller var 14,66 ± 2,25 ug /l, 4,48 ± 0,72 ug /l, 3,10 ± 1,15 ug /l, og 2,43 ± 0,28 pg /l, henholdsvis (ACA
vs.
sunn kontroll,
P =
0,797;.. CRC
vs
sunn kontroll,
P =
0.000)
diagnostisk verdi av Serum kininogen -1 og CEA for tykktarmssvulster
for å evaluere den diagnostiske verdien av kininogen-1, ble en ROC kurve analyse utført. Som vist på fig. 2 Aa, arealet under ROC-kurven (AUC) for serum kininogen-1 i assosiasjon med en diagnose av ACA var 0,635 (95% CI: 0,551 til 0,719, p = 0,003), mens AUC forbundet med en diagnose av CRC var 0.706 (95% KI:. 0,635 til 0,777, p = 0,000; figur 2 Ac). Basert på disse ROC-kurver, et serum kininogen-en konsentrasjon på 162,99 mg /ml ble valgt som den optimale verdien cutoff for å differensiere ACA pasienter og kontroller, med følsomhet, spesifisitet, positiv og negativ prediktiv verdi, og nøyaktighet priser er 51,25%, 63,53 %, 56,94%, 58,06% og 57,58%, henholdsvis. Tilsvarende er en serum kininogen-en konsentrasjon på 173.96 mikrogram /ml ble valgt som den optimale verdien cutoff for å differensiere CRC pasienter og kontroller, med tilhørende sensitivitet, spesifisitet, positiv og negativ prediktiv verdi, og nøyaktighet prisene blir 63,64%, 65,88%, 75,83%, 51,85% og 64,47%, henholdsvis
A.: ROC-kurve for serum kininogen-1 (a) og CEA (b) for en diagnose av ACA, og ROC-kurven for serum kininogen- 1 (c) og CEA (d) for en diagnose av CRC. B: En sammenligning av følsomheten (Se), spesifisitet (Sp), positiv prediktiv verdi (PV +), negativ prediktiv verdi (Pv-), og nøyaktighet (AC) satser for påvisning av kininogen-1 og CEA for en diagnose av Duke trinn A og B CRC (a) eller Dukes fase C og D CRC (b)
AUC for serum CEA som en diagnose av ACA var 0,459 (95% KI:. 0,370 til 0,547, P . = 0,358; figur 2 Ab), og som en diagnose av CRC var 0,695 (95% KI: 0,627 til 0,767, P = 0,000; figur 2 Ad).. Den allment akseptert cutoff-verdi på 5 ug /l for serum CEA ble anvendt i denne studien ettersom den grenseverdi beregnet fra ROC-kurven var 5,095 ug /l. Derfor, ved bruk av denne grenseverdi for å differensiere CRC pasienter og kontroller, sensitivitet, spesifisitet, positiv og negativ prediktiv verdi, og nøyaktighet rater ble funnet å være 38,46%, 85,88%, 82,09%, 45,34% og 56,14%, henholdsvis. Dermed CEA var assosiert med lavere forekomst av følsomhet og nøyaktighet sammenlignet med kininogen-en.
De nevnte fem parametere ble også brukt til å vurdere kininogen-1 og CEA deteksjon for Dukes fase A og B CRC pasienter. For kininogen-en, ratene var 70,13%, 65,88%, 65,06%, 70,88% og 67,90%, henholdsvis. For CEA, ratene var 38,96%, 85,88%, 71,43%, 60,83% og 63,58%, henholdsvis. Med unntak av spesifisitet og de positive prediktiv verdi, verdien av de andre parametere i forbindelse med kininogen-1 var bedre enn de for CEA (fig. 2 G). Når Dukes fase C og D CRC pasienter ble analysert, de nevnte fem parametrene for kininogen-1 var 72,73%, 65,88%, 62,34%, 75,68% og 68,87%, henholdsvis, og for CEA, var 34,85%, 85,88%, 65,71 %, 62,93% og 63,58%, henholdsvis. I likhet med Dukes fase A og B CRC pasienter, parametrene for kininogen-1, med unntak av spesifisitet og positive prediktiv verdi, var bedre enn de for CEA (fig. 2 Bb). I tillegg ble følsomhet, negative prediktive verdier og nøyaktighet priser forbedret når CRC pasienter hadde et positivt resultat for serum kininogen-en og /eller serum CEA. I kontrast, spesifisitet priser assosiert med disse positive testene vesentlig redusert (tabell 3).
uttrykk nivåer av kininogen-en i Normal Colorectal slimhinner, ACA vev, og CRC Vev
kininogen -1 kan påvises i blodet under fysiologiske betingelser. Imidlertid er det uklart om høyere nivåer av kininogen-1 detektert i serumet til pasienter med kolorektal tumor avledet av kolorektal tumor selv. Derfor ble immunhistokjemi analyser utført for å vurdere ekspresjon av kininogen-1 in colorectal vev. Totalt 75 normale tykktarmsslimhinnen vev, 77 ACA vev, og 248 CRC vev ble undersøkt. Ingen signifikant forskjell i uttrykket av kininogen-en ble funnet mellom menn kontra kvinner blant de tre gruppene (
P
0,05). Videre immunreaktivitet for kininogen-1 ble funnet i cytoplasma i ACA og CRC-celler (Fig. 3 A-C), og ekspresjonsnivået av kininogen-1 var signifikant høyere i CRC vev enn det som i ACA vev eller normale slimhinner (48,39 %
vs
15,58%
vs
0%,
P
. . 0.05 fig. 3D)
Representative immunostainings av kininogen-en. i normal tykktarmsslimhinne (A), ACA vev (B), og CRC vev (C). Både oversikt (20 ×) og forstørrelse (40 ×) bildene er, med sistnevnte leveres som innfelt bokser i øverste venstre hjørne av hvert panel. D: Kvantifisering av kininogen-1-nivå i kontroll, ACA, og CRC grupper. E: Overlevelseskurver for kontroll, ACA, og CRC grupper. Den blå linjen representerer CRC pasienter negative for kininogen-1 uttrykk og den grønne linjen representerer CRC pasienter positive for kininogen-1 uttrykk.
Korrelasjonen av kininogen-1 Expression med Clinicopathological Funksjoner av ACA og CRC Pasienter
Korrelasjon mellom cytoplasmatiske kininogen-1 nivåer og clinicopathological funksjoner i ACA og CRC pasienter ble analysert separat. Mens cytoplasma opphopning av kininogen-en ble funnet å negativt korrelert med vev histologi for ACA pasienter (
r
s
= -0,250, p = 0,029), det gjorde ikke korrelerer med svulst plassering, tumorstørrelse, eller grad av intraepitelial neoplasi (alle
P
0,05, detaljer i tabell S2). I motsetning til cytoplasma opphopning av kininogen-en signifikant korrelert med Duke etappe og lymfeknutemetastase status for CRC (
r
s
= 0,151, P = 0,018 og
r
s
= 0,128, p = 0,045, henholdsvis). Imidlertid gikk det ikke korrelerer med svulst beliggenhet, tumorstørrelse, tumor celledifferensiering, eller fjernmetastaser (alle
P
0,05, detaljer i tabell S3).
Survival Analysis
CRC pasienter (n = 110) ble videre analysert for å vurdere en mulig sammenheng mellom kininogen-en immunoreaktivitets og pasient overlevelse. er vist i figur 3E, overlevelseskurven i henhold til cytoplasmiske kininogen-1-nivå. Gjennomsnittlig overlevelsestid for CRC pasienter med negativ versus positiv kininogen-1 uttrykk var 45.21 ± 3.17 måneder og 38.15 ± 3.07 måneder, henholdsvis. Dermed pasienter med negativ kininogen-1 uttrykk hatt en lengre overlevelse periode enn de med positive kininogen-1 uttrykk, selv om forskjellen var ikke signifikant (
P =
0,166).
Diskusjoner
Screening for adenomer og tidlig stadium CRC har redusert forekomst og dødelighet for CRC i USA de siste tiårene [3]. Men ikke dagens screeningmetoder ikke gir god følsomhet. Derfor arbeides fortsatt være rettet mot å utvikle nye diagnostiske eller screening serummarkører for CRC. I tillegg har utviklingen innen proteomikk teknologi muliggjort identifisering av nye biomarkører. Spesielt har Clinprot teknologi blitt funnet å tilveiebringe meget nøyaktige og reproduserbare resultater, et godt nivå av følsomhet, og er forenlig med en høy gjennomstrømning format for rask identifisering av proteiner [21]. Følgelig har proteomic profiler for forskjellige humane sykdommer har blitt oppnådd ved bruk av metoden som er Clinprot [22] – [24]. I den foreliggende studien, Clinprot protokollen gitt forutsi modeller for CRC og ACA versus friske kontroller, og også mellom ACA og CRC. Videre gjenkjennelses kapasiteten til disse modellene var 98,96%, 100,00%, og 100,00%, henholdsvis. Dermed kininogen-en ble identifisert som en potensiell markør for CRC og ACA, og disse resultatene ble validert ved hjelp av ELISA. Samlet utgjør disse resultatene bekrefter riktigheten av Clinprot teknologi.
Samler bevis fortsetter å vise en rolle for kininogen-1 i kreftutvikling [25]. For eksempel, har betydelig reduserte nivåer av kininogen-1 er påvist i urinen hos pasienter med ovarialcancer, sammenlignet med kontrollpersoner [26]. Tidligere studier har også vist at kininogen-1 oppviser antiangiogene egenskaper, og medierer inhiberende virkninger på formeringen av endotelceller [27]. Videre i kreftpasienter, lavere nivåer av kininogen-1 uttrykk er påvist i blodprøver, og disse nivåene kan bidra til overlevelsen av kreftceller til stede [28]. Imidlertid er rollen til kininogen-1 i karsinogenese, særlig i CRC, har forblitt uklart. I denne studien, serum kininogen-1-nivåer hos pasienter med ACA eller CRC ble funnet å være signifikant høyere sammenlignet med friske kontroller. Det er allment akseptert at ACA er en forstadier lesjon i CRC [29]. Således vil en betydelig økning i serum kininogen-1-nivåer i disse pasientene kan representere en markør for tidlig deteksjon av CRC, og dette er i overensstemmelse med resultatene av Qiu
et al.
[30]. Selv om, i en studie av kininogen-1-ekspresjon detektert i 118 plasmaprøver oppnådd fra pasienter med gastrointestinal kreft, betydelig lavere nivåer av kininogen-1 ble detektert [31]. Selv om dette er i kontrast til resultatene av denne undersøkelsen, kan denne forskjellen være på grunn av forskjeller i prøvestørrelse, eksempel ressurser, og påvisningsmetode benyttes.
Målinger av CEA-nivåer er blitt funnet å være uegnet for populasjons screenings på grunn av mangel på sensitivitet av denne analysen i de tidlige stadier av CRC [32], [33]. Et panel av American Society of Clinical Oncology har også anbefalt mot CEA testing for CRC screening [34]. Tilsvarende CEA analyser utført i denne studien viste ingen diagnostisk verdi for ACA (AUC = 0,453), og også viste en lavere følsomhet (38,96%
vs.
70,13%) og nøyaktighet (63,58%
vs.
67,90%) for Dukes fase A og B CRC, sammenlignet med kininogen-en. Disse resultatene indikerer at overvåkingen serumnivåer av kininogen-en er mer verdifull enn detektere CEA i de tidlige stadier av CRC. Dessuten, når begge serumnivåer av kininogen-en og nivåer av CEA ble overvåket i CRC pasienter, spesifisitet og positiv prediktiv verdi av disse resultatene forbedres. Derfor er påvisning av kininogen-1 i kombinasjon med andre tumormarkører anbefalt. I tillegg, hvis en pasient er funnet å være positive for kininogen-1 og CEA, men negativ for alfa fosterprotein, så er det mulig at han /hun lider av CRC stedet for leverkreft. Videre studier vil være nødvendig for å bekrefte denne hypotesen.
I postoperative CRC pasienter, serumnivåer av kininogen-en var lavere enn de av preoperative CRC pasienter. Selv om det fortsatt uklart hvorfor dette ble observert, er det en hypotese at økt produksjon av kininogen-1 stammer fra tumorvev. Dette understøttes av immunhistokjemi resultatene som ble oppnådd som viste kininogen-1 akkumuleres i cytoplasma av kolorektale svulstceller. Men mekanistiske detaljer om denne prosessen forblir uklar. I tillegg cytoplasmisk akkumulering av kininogen-en signifikant korrelert med lymfeknutemetastase status hos pasienter med CRC. Men en overlevelse analyse av CRC pasienter i henhold til kininogen-1 uttrykk fant ingen signifikant forskjell mellom negativ og positiv kininogen-1 uttrykk gruppe, noe som indikerer prognosen verdien av kininogen-en er begrenset.
Så vidt vi vet, dette er den første studien som rapporterer påvisning av kininogen-en i ACA og CRC pasienter med validering av ELISA og immunhistokjemi. Basert på disse resultatene, synes kininogen-en for å være en potensiell CRC markør, som kan være verdifulle for tidlig deteksjon av CRC, særlig i kombinasjon med andre biomarkører i befolknings screenings for CRC. En analyse av ytterligere pasienter, inkludert standardisert behandling av prøvene som ble oppnådd, er nødvendig for å bekrefte og utvide dagens resultater. Videre er mekanistiske studier av kininogen-en i kolorektal tumorer garantert.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1. Bedrifter Den viktigste clinicopathological kjennetegn ved pasientene i de funn og validering kohorter
doi:. 10,1371 /journal.pone.0070519.s001 plakater (DOC)
Tabell S2. .
Sammenheng mellom kininogen-1 uttrykk og clinicopathologic funksjoner i ACA pasienter
doi: 10,1371 /journal.pone.0070519.s002 plakater (DOC)
tabell S3. .
Sammenheng mellom kininogen-1 uttrykk og clinicopathologic funksjonene CRC pasienter
doi: 10,1371 /journal.pone.0070519.s003 plakater (DOC)
Materialer S1.
ClinProt Peak statistikk mellom sunn kontroll og ACA pasienter
doi:. 10,1371 /journal.pone.0070519.s004 plakater (XLS)
Materialer S2.
ClinProt Peak statistikk mellom sunn kontroll og CRC pasienter
doi:. 10,1371 /journal.pone.0070519.s005 plakater (XLS)
bekreftelser
Forfatterne takker profs . Yali Zhang og Yadong Wang, for deres forslag om patologi.
