Abstract
Vi forsøkte å undersøke den kliniske betydningen av uttrykket av romanen scaffoldprotein CARMA3 i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og den biologiske funksjon av CARMA3 i NSCLC-cellelinjer. Vi har observert moderat til høy CARMA3 farging i 68,8% av 141 NSCLC-prøvene sammenlignet med tilsvarende normale vev. Overekspresjon av CARMA3 var signifikant korrelert med TNM stadium (P = 0,022) og tumorstatus (P = 0,013). CARMA3 oppregulering også korrelert med en kortere overlevelse av pasienter med lymfeknutestatus N0 (P = 0,042), så vel som ekspresjon av epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR) (P = 0,009). I EGFR mutasjonspositive tilfeller CARMA3 uttrykk var mye høyere (87,5%) sammenlignet med ikke-mutasjon tilfeller (66,1%). I tillegg observerte vi at knockdown av CARMA3 hemmer tumorcelleformering og invasjon, og induserer cellesyklus-stans ved grensen mellom G1 og S-fasen. Vi viste videre en direkte kobling mellom CARMA3 og NF-kB aktivering. Endringen av biologisk oppførsel i CARMA3 knockdown celler kan være NF-kB-relatert. Våre funn viste, for første gang, ble det CARMA3 overuttrykt i NSCLC og korreleres med lungekreft progresjon, EGFR-ekspresjon, og EGFR mutasjon. CARMA3 kan tjene som en potensiell partner narkotika mål, sammen med NF-kB og EGFR i EGFR-mutant lungekreft
Citation. Li Z, Qu L, Dong Q, Huang B, Li H, Tang Z, et al. (2012) Overuttrykte CARMA3 i Non-småcellet lungekreft er knyttet til tumorprogresjon. PLoS ONE 7 (5): e36903. doi: 10,1371 /journal.pone.0036903
Editor: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hong Kong
mottatt: 15 november 2011; Godkjent: 09.04.2012; Publisert: May 15, 2012 |
Copyright: © 2012 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (nr 30972967) og forskningsfond for doktorgradsstudiet for Higher Education of China (No. 20092104110018). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
CARMA3 (også kjent som CARD10 eller Bimp1) tilhører Carma familie og inneholder tre medlemmer, carma1 (også kjent som CARD11), CARMA2 (CARD14), og CARMA3. Disse tre proteiner dele lignende strukturelle motiver, inneholde et kort domene, et Src-homologi 3 (SH3) domene, ett eller flere PDZ domener, og en Guk domene. Men viser de forskjellige uttrykk profiler; Carma1 er uttrykt i hematopoetiske celler, CARMA2 i morkaken, og CARMA3 i alle ikke-hematopoetiske celler [1] – [4]. Nylige studier har vist at CARMA3, som et stillas protein, spiller en kritisk rolle i GPCR-ligander og PKC-indusert NF-kB-aktivering [5] – [8]. Det har tidligere blitt vist at NF-kB-aktivering er involvert i tumordannelse og i utviklingen av nevrale, hjerte, og immun-sykdommer [9] – [13]. CARMA3 aktiverer NF-kB ved å rekruttere Bcl10 og malt1, to uunnværlig proteiner som er nødvendige for GPCR og PKC-indusert NF-kB-aktivering [6], [14] – [16]. Den PKCa-CARMA3 signale aksen spiller en avgjørende rolle i LPA-indusert eggstokkreft celle in vitro invasjonen [17]. En ny studie viste at CARMA3 mangel nedsatt kreftcelleformering in vitro og in vivo, og hemmet overlevelse, migrering og invasjon i humane brystcancercellelinjer MDA468 og A431 [18]. CARMA3 knockdown forårsaket markert hemming av SDF-1α mediert invasjon av muntlig plateepitelkarsinom TB2-T4-celler [7]. Imidlertid har protein uttrykk for CARMA3 i lungekreft vev og potensielle rolle CARMA3 i den biologiske oppførsel av lungekreftceller ikke blitt utforsket. Derfor undersøkte vi uttrykket av CARMA3 i lungekreft vev og dens forhold til ulike clinicopathological parametere. I tillegg vurderes vi foreningen av CARMA3 uttrykk med spredning og metastatisk potensial av flere NSCLC cellelinjer.
Materialer og metoder
Pasienter og Prøvene
Denne studien ble godkjent av Etisk komité i Kina Medical University, og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver pasient. 141 tilfeller av NSCLC prøvene ble innhentet danne den første Affiliated Hospital of China Medical University i perioden 2008 til 2011. histologisk diagnose og grad av differensiering av svulstene ble definert ved evaluering av hematoxylin og eosin-farget vevssnitt, ifølge Verdens helseorganisasjon retningslinjer for klassifisering. Alle 141 prøvene ble vurdert på nytt med hensyn til deres histologiske subtyper, differensiering status, og kreft etapper. For NSCLC-prøvene, ble SCC og adenokarsinom identifisert i 65 og 76 av de 141 tilfellene, respektivt. Lymfeknutemetastaser ble observert i 68 av de 141 pasientene. P-TNM taging system av International Union mot kreft (7. utgave) ble anvendt for å klassifisere arter som trinn I (n = 64), II (n = 41), III (n = 30) og IV (n = 6) .
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP
A549, H1299, HBE og H460 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA), LK2 ble hentet fra den japanske Cancer Research Resources Bank (Tokyo, Japan), SPC ble hentet fra CCTCC (kinesisk Center of Typisk Kultur Spar, Wuhan, PRChina), H157 ble kjøpt fra Cell Bank, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina), The BE1 og LH7 var gaver fra Dr. Jie Zheng (College of Medicine, Beijing University, Kina) .De celler ble dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) som inneholder 10% føtalt kalveserum (Invitrogen), 100 IE /ml penicillin (Sigma, St. Louis, MO , USA), og 100 ug /ml streptomycin (Sigma). Cellene ble dyrket på sterile vev kultur retter og ble passert hver 2 dager med 0,25% trypsin (Invitrogen).
Immunohistochemistry
Kirurgisk skåret vevsprøver ble fiksert med 10% nøytral formalin, innstøpt i parafin og 4 um tykke seksjoner ble fremstilt. Farging ble utført ved hjelp av avidin-biotin-peroksidase kompleks metode (Ultra Sensitive TM, Maixin, Fuzhou, Kina). Seksjonene ble deparaffinized i xylen, rehydratisert i gradert alkohol serie og kokt i 0,01 M citratbuffer (pH 6,0) i 2 minutter i en autoklav. Endogen peroksidaseaktivitet ble blokkert ved bruk av hydrogenperoksid (0,3%), som ble etterfulgt av inkubasjon med normalt geiteserum for å redusere ikke-spesifikk binding. Vevssnitt ble inkubert med CARMA3 kanin polyklonalt antistoff (1:80 fortynning) (Sigma). Mus immunoglobulin (ved samme konsentrasjon av antigen spesifikke antistoff) (Maixin, Fuzhou, Kina) ble anvendt som en negativ kontroll. Farging for alle primære antistoffer ble utført ved romtemperatur i 2 timer. HRP-Polymer konjugert anti Mus /Rabbit IgG (klar til bruk) (Maixin, Fuzhou, Kina) ble brukt som sekundære antistoff. Etter vasking, ble seksjonene inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugert streptavidin-biotin, etterfulgt av 3, 3′-diaminobenzidin tetrahydroklorid å utvikle peroksidase-reaksjonen. Kontra av delene ble gjort med hematoksylin, som var så dehydrert i etanol før mounting.Two uavhengige etterforskere undersøkte alle kreft lysbilder tilfeldig. Fem visningene ble undersøkt per lysbilde, og 100 celler ble observert per view på 400 × forstørrelse. Normal bronkialepitelet tilstede i tumorsnitt ble anvendt som negativ kontroll. Farging av CARMA3 ble scoret etter en semi-kvantitativ skala ved å evaluere i representative tumorområder, intensiteten og prosentandel av celler som viser høyere farging enn kontrollcellene. cytoplasmisk farging av tumorcellene ble betraktet som positiv farging. Intensiteten av CARMA3 cytoplasma farging ble også scoret som 0 (ingen flekker), en (svak), 2 (merket). Prosent skår ble tildelt som 1- 1-25%, 2- 26-50% og 3 51-100%. Stillingen til hver tumorprøve ble multiplisert for å gi en sluttresultatet fra 0 til 6, og den totale ekspresjon av CARMA3 ble bestemt som enten negativ eller lav uttrykk (-): stillingen 3 eller positivt uttrykk eller høy ekspresjon (+): stillingen ≥3.
(A) Sterk CARMA3 uttrykk i lunge adenokarsinom (400 ×). (B) Svak CARMA3 uttrykk i lunge adenokarsinom (400 ×). (C) Sterk CARMA3 uttrykk i lunge plateepitelkarsinom (400 ×). (D) Svak CARMA3 uttrykk i lunge plateepitelkarsinom (400 ×). (E) Normal bronkialepitelet viser svak farging for CARMA3 (400 ×). (F) Negative kontroller for CARMA3 farging med ikke-immun mus IgG antistoff (400 ×).
Immunhistokjemisk farging for CARMA3 og EGFR i to representative NSCLC prøvene. En viste sterk uttrykk for CARMA3 (A) og sterk EGFR uttrykk (400 ×) (B). Den andre viste svak ekspresjon av CARMA3 (400 x) (C) og svak EGFR uttrykket (400 x) (D). (E, F) Korrelasjonen av CARMA3 og EGFR uttrykk i NSCLC prøver med EGFR mutasjon (400 ×).
Analyse av EGFR mutasjon
Parafin deler av 75 NSCLC prøver for EGFR mutasjon ble oppnådd analyse fra First Affiliated Hospital of China Medical University mellom 2009 og 2011. i korte trekk DNA ble ekstrahert fra parafininnstøpte vevssnitt bruker Takara DEXPAT Easy Kit (TAKARA Biotechnology, Dalian, Kina) i henhold til produsentens protokoll. EGFR mutasjoner ble oppdaget ved hjelp av EGFR mutasjonsdeteksjon kit (GP Medical Technologies, Beijing, Kina) på 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, California).
Kvantitativ Real-time PCR (SYBR Grønn metode)
Kvantitativ real-time PCR ble utført ved anvendelse av SYBR grønn PCR masterblanding (Applied Biosystems) i et totalvolum på 20 ul på 7900HT Fast real-Time PCR System (Applied Biosystems) som følger: 95 ° C i 30 sekunder, 40 sykluser av 95 ° C i 5 sekunder, 60 ° C i 30 sekunder. En dissosiasjon trinn ble utført for å generere en smeltekurve for å bekrefte spesifisiteten til forsterkning. β-aktin ble benyttet som referanse-genet. De relative nivåer av genekspresjon var representert som ΔCt = Ct-genet -Ct referanse, og folden endring av genekspresjon ble beregnet ved hjelp av 2-ΔΔCt metode. Primersekvensene er vist i tabell S1, ble eksperimenter gjentatt i triplikat.
Western Blot analyse
Totale proteiner fra primær vev og cellelinjer ble ekstrahert i lyseringsbuffer (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) og kvantifisert ved anvendelse av Bradford-metoden. Femti mikrogram protein ble separert ved SDS-PAGE (12%). Etter overføring, ble det polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner (Millipore, Billerica, MA, USA) inkubert over natten ved 4 ° C med følgende antistoffer CARMA3 (1:200; Sigma), Bcl-10 og β-aktin (1:500 ; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-fosfo-ERK, anti-fosfo-IKK, anti-fosfo-IkB, anti-fosfo-Rb, anti-P27, anti-syklin A, anti-Cyclin D1, anti -Cyclin D3, anti-CDK4 og anti-CDK6 (1:1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Etter inkubering med peroksidase-koblet anti-mus eller kanin IgG (Santa Cruz Biotechnology) ved 37 ° C i 2 timer, ble bundne proteiner visualisert ved bruk av ECL (Thermo Fisher Scientific) og påvist ved å bruke Bioimaging Systems (UVP Inc., Upland, CA, USA). De relative proteinnivåer ble beregnet på grunnlag av β-actin som lasting kontroll.
Små interfering RNA Behandling
Dharmacon siGENOME SMARTpool siRNA for CARMA3, Bcl10 og Dharmacon siGENOME Non-måls siRNA # 1 var kjøpt fra Dharmacon (ThermoFisher Scientific). For transfeksjoner ble cellene sådd ut i en 24-brønners plate 24 timer før forsøket. Cellene ble transfektert med siRNA ved hjelp av DharmaFECT 4 (0,20 pl /brønn; ThermoFisher Scientific) i henhold til produsentens protokoll. Etter transfeksjon ble mRNA og proteinnivåer vurderes 48 timer senere.
Cell Proliferation Test
Celleproliferering Analysen ble utført ved hjelp av Cell Counting Kit-8® løsning (Dojindo, Gaithersburg, MD) i henhold til produsentens protokoll. I korthet ble cellene sådd ut i en konsentrasjon på 5 x 10
3 celler /100 ul /brønn i 96-brønners kulturplater og behandlet med 10 ul /brønn av celletellingsleder-8® løsning i løpet av de siste 4 timene av kultur. Optisk tetthet av brønnene ble målt ved 450 nm ved anvendelse av en mikroplateleser.
Colony Forming Assay
For kolonidannelsen analysene ble celler dyrket på 6 cm skåler i en tetthet på 5000 celler /skål og transfektert med CARMA3, Bcl10 eller negativ kontroll sirnas. Kolonier ble vasket to ganger med PBS, fiksert og farget med formaldehyd-krystallfiolett 13-15 dager etter transfeksjon. Alle forsøk ble gjentatt uavhengig av hverandre minst tre ganger under like betingelser.
(A) Western blot-analyse av CARMA3 ekspresjon i lungecancerceller transfektert med siRNA. (B) Relative CARMA3 uttrykk profiler i et panel av humane luftveier avledet cellelinjer bestemt ved sanntids-PCR.
(A) Celleveksthastigheten ble bestemt ved CCK-8-analysen, som beskrevet i § 2. dataene er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige forsøk. (B) (Øvre panel) H1299 og A549-celler transdusert med siRNA for kontroll, ble CARMA3, eller Bcl10 utsettes for kolonidannelse analysen. (Nedre panel) Histogram kvantifisering. Feilfelt angir ± SD (* p 0,05, ** p 0,01)
(Øvre) CARMA3 og Bcl10 siRNA behandling hemmet målbar celle invasjon i begge cellelinjene (200 ×).. (Lower) Søylediagrammet viser gjennomsnittet og forskjellen i celle nummer blant fotografier, og standard avledning ble beregnet ut fra gjennomsnittet av celler i de 10 feltene (**, P 0,01)
Matrigel Invasion assay
celle invasjon analysen ble utført ved anvendelse av en 24-brønns Transwell kammer med en porestørrelse på 8 um (Costar, Cambridge, MA). Innleggene ble belagt med 20 ul Matrigel (1:03 fortynning, BD Bioscience, San Jose, CA, USA). Førti-åtte timer etter transfeksjon ble cellene trypsinert og 3 x 10
5-celler i 100 ul serumfritt medium ble overført til den øvre Matrigel kammeret og inkubert i 16 timer. Etter inkubering ble de ikke-invaderte celler på den øvre membranoverflaten fjernes med en bomullstupp, og cellene som passerte gjennom filteret ble fiksert med 4% paraformaldehyd og farget med hematoksylin. Antallet invaderte celler ble tellet i løpet av 10 tilfeldig utvalgte høyeffekt felt under mikroskopet. Dette eksperimentet ble utført i tre eksemplarer.
Cell Cycle Analysis
Cells (500.000) ble sådd i 6-cm vev kultur retter. Etter 12 timer inkubering ble cellene transfektert med angitte mengder av siRNA. Celler ble fiksert med 75% etanol i 48 timer etter transfeksjon, vasket med fosfat-bufret saltvann (PBS), og farget i 5 mg /ml propidiumjodid i PBS supplert med RNase A (Roche, Indianapolis, IN) i 30 minutter ved romtemperatur . Data ble samlet inn ved hjelp av BD systemer
Luciferase Assay
Celler ble opprinnelig transfektert med CARMA3, Bcl10 eller negative kontroll sirnas for 24 timer.; Cellene ble så ko-transfektert med 500 ng PNF-kB-Luc reporter plasmid, og 100 ng Renilla luciferase-plasmid i 24 timer. Cellene ble behandlet i 30 minutter med eller uten EGF (100 ng /ml), og deretter lysert; luciferase-aktivitet ble bestemt med en dual-luciferase reporter analysesystemet (Promega, Madison, WI, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. NF-kB aktivitet ble undersøkt ved normalisering av ildflue luciferase-aktivitet for å Renilla luciferase-aktivitet. Forsøk ble utført in triplo i tre uavhengige eksperimenter.
Statistical Analysis
SPSS versjon 16.0 for Windows ble brukt for alle analyser. The Chi-squared test ble brukt for å undersøke mulige sammenhenger mellom CARMA3 uttrykk og clinicopathologic faktorer. Kaplan-Meier-kurver ble brukt for overlevelsesanalyse, og log-rank ble fastsatt basert på forskjellene. Den t-test ble brukt til å sammenligne andre data. p-verdier var basert på tosidig statistisk analyse, og p. 0,05 ble ansett for å indikere statistisk signifikans
(A) (Øvre) H1299 og A549 celler ble behandlet med CARMA3 spesifikke siRNA i 48 timer . Deretter ble cellene høstet og behandlet med RNase, og farget med PI. Cellesyklusfordelingen ble analysert ved flow-cytometri. (Nedre) Prosentandelen av celler i G1, S, G2 fase i histogrammene. (* P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001) versus kontrollgruppen. Resultatene er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. (B) H1299 og A549-celler ble behandlet med CARMA3-spesifikk siRNA i 48 timer. Cellelysater ble utsatt for immunblotting analyse ved bruk av angitte antistoffer.
(A) H1299 og A549-celler ble transfektert med kontroll eller CARMA3-spesifikk siRNA i 24 timer, deretter behandlet med NF-kB-luciferase og styre
Renilla
reporter plasmider i 24 timer. Cellene ble behandlet med eller uten EGF (100 ng /ml) før høsting, og den resulterende NF-kB-induksjon ble målt ved å beregne luciferase /
Renilla
forhold. Data (mean_S.E.) Er fra minst tre separate bestemmelser. (** P 0,01) (B) H1299 og A549-celler ble transfektert med et siRNA basseng målretting CARMA3 i 48 timer, deretter behandlet med EGF (100 ng /ml) for de angitte tidsperioder. Totalt cellelysater ble preparert fra disse cellene, og deretter utsatt for immunblotting analyse med angitte antistoffer.
Resultater
kliniske betydningen av CARMA3 Protein Expression i NSCLC Vev
analyserte protein ekspresjonsnivåene av CARMA3 ved hjelp av immunohistokjemi av 91 NSCLC-prøver og deres tilsvarende normale vev. CARMA3 ble funnet å være hovedsakelig uttrykt i cytoplasma rommet. Normal bronkial epithelia utstilt negativ eller svak CARMA3 farging (Fig. 1E), mens CARMA3 farging var vesentlig sterkere i lungekreft vev. Vi har funnet moderat til høy CARMA3 farging i 69% av lungekreft prøver (fig. 1A og C). Vi bruker også western-blotting å analysere uttrykk for CARMA3 i 18 saker.Ferie Resultatene viser at 56% av lungekreft prøvene viser moderat til høy CARMA3 uttrykk (Figur S2, S3).
Sammenhengen mellom CARMA3 uttrykket og clinicopathologicfactors av NSCLC er vist i tabell 1. CARMA3 overekspresjon oppviste en signifikant korrelasjon med TNM trinn (P = 0,022) og tumorstatus (P = 0,013), men ingen korrelasjon ble observert vedrørende alder, kjønn, differensiering, lymfeknutemetastaser og tumorhistologi. For bedre å kreve korrelasjonen av CARMA3 med lungekreft progresjon, evaluerte vi forholdet mellom ekspresjonen av CARMA3 og total overlevelse av N0 trinn NSCLC (38 CAMRA3 + og 16 CAMRA3 -). Etter Kaplan-Meier overlevelsesanalyse, fant vi at pasienter med lav uttrykk for CARMA3 hadde en statistisk signifikant lengre overlevelse (median overlevelse = 32 ± 3,80 måneder, 95% konfidensintervall 24.56-39.44 måneder) enn de med høyt uttrykk for CARMA3 (median overlevelse = 20 ± 3.91months; 95% konfidensintervall 12,33 til 27,67 måneder; p = 0.042;. Figur S4)
En nylig rapportert studie viste at CARMA3 uttrykk er nødvendig for EGFR indusert NF-kB aktivering [15]. EGFR overekspresjon har blitt vist i mange humane kreftformer, inkludert lunge, tykktarm, bukspyttkjertel, bryst, ovarier, blære, nyre, og nervesystemet [19], [20]. Derfor undersøkte vi sammenhengen mellom CARMA3 uttrykk og EGFR status i NSCLC. Vi fant at EGFR ble uttrykt i cellemembranen og cytoplasmisk. En signifikant korrelasjon mellom CARMA3 ekspresjon og ekspresjon av EGFR ble observert (p = 0,009) i de NSCLC-prøver (tabell 1 og fig. 2A-D). For å avgjøre om EGFR mutasjon er korrelert med forhøyede CARMA3 uttrykk, undersøkte vi sammenhengen mellom CARMA3 uttrykk og EGFR mutasjon. Vi brukte en EGFR mutasjon deteksjon kit, og fant 16 av 75 kreft prøvene var positive for EGFR mutasjon (tabell S2). Blant de 16 tilfellene 87,5% viste positiv CARMA3 uttrykk, en mye høyere rente sammenlignet med ikke-mutasjon tilfeller (66,1%). Vi fant at 86,67% EGFR positiv mutasjon tilfeller også utstilt positive CARMA3 uttrykk (Fig. 2E og F).
CARMA3 Bidrar til Lung Cancer Cell Vekst og Invasion
Vi først undersøkt uttrykk for CARMA3 i flere lungekreft cellelinjer, slik som vist i fig. 3B, H1299, A549, BE1 utstilt høye uttrykk nivåer av CARMA3 mens normale bronkialepitelet (HBE) celler, LK2, og LH7 viste lavere nivåer av CARMA3 uttrykk. SPC, H157 og H460 viste moderate nivåer av CARMA3 uttrykk.
Vi neste ansatt en RNA interferens tilnærming for å avgjøre om CARMA3 og CBM kompleks (CARMA3-Bcl10-malt1) spiller en rolle i kreftcellevekst. De CARMA3 og Bcl10 ekspresjonsnivåene var uendret ved transient transfeksjon med den negative kontrollen siRNA, mens CARMA3- eller Bcl10-spesifikk siRNA undertrykte betydelig både mRNA og protein ekspresjonsnivåene i H1299 og A549 cellelinjer (Fig. 3A og fig. S1 ). Deretter undersøkte vi cellevekst. Med CARMA3 eller Bcl10 siRNA, vises H1299 cellene redusert vekstrater i forhold til den negative kontrollen (Fig. 4A). I likhet med H1299 celler, fant vi at knockdown av CARMA3 eller Bcl10 også redusert vekst på A549 celler (fig. 4A). Vi utnyttet en selvstendig metode, kolonidannelse analyser, å validere anti-proliferative effekter av CARMA3 eller Bcl10 hemming i lungekreftceller. CARMA3- eller Bcl10-målretting sirnas ført til en klar reduksjon av kolonidannelse kapasiteten på to testede lunge kreft cellelinjer i forhold til å kontrollere siRNA-behandlede celler (Fig. 4B). Disse tap-av-funksjon studier vist at CARMA3 og CBM sirnas kunne hemme tumor celleproliferasjon i forhold til irrelevant sinc. For ytterligere å undersøke om CARMA3 og Bcl10 bidra til invasive egenskapene til ikke-småcellet lungekreft celler, gjennomførte vi Matrigel invasjonen analysene. Våre resultater viser at de invasive egenskapene til CARMA3- og Bcl10-knockdown H1299 kreftceller ble redusert i forhold til de negative kontrollcellene (Fig. 5). Tilsvarende knockdown av CARMA3 eller Bcl10 i A549-celler også redusert invasive egenskapene til disse cellene (fig. 5). Samlet utgjør disse resultatene viser at CARMA3 og CBM komplekset er positive regulatorer celle invasjon.
CARMA3 Sletting Resultater i G1 arrest og vekst Hemming av lungekreft celler
Cellesyklus analyser av fluorescens aktivert celle sortering (FACS) ble utført i kreftceller med eller uten CARMA3-knockdown, og vi har funnet at prosentandelen av celler i G1 fase ble øket, og celler i S-fasen ble redusert i celler med CARMA3-knockdown sammenlignet med kontroll-celler (fig. 6 A). Disse resultatene tyder på at CARMA3 delesjon induserer cellesyklus-stans ved G1 /S-grensen. For å undersøke mekanismen bak induksjon av cellesyklus-stans, testet vi effekten av CARMA3-knockdown på syklin A, Cyclin D1, cyklin D3, CDK4, CDK6, P27 og P-Rb nivåer. Som vist i (Fig.6 B), Western blot analyse viste at knockdown av CARMA3 reduserte protein nivåer av Cyclin D1, CDK4, CDK6, og P-Rb men økte nivåene av p27. Samlet utgjør disse resultatene indikerer at hemming av CARMA3 uttrykk induserer cellesyklus arrest i G1 fasen og undertrykker kreft celle lunge vekst.
Undertrykkelse av CARMA3 Hemmer p-IKB og NF-kB aktivering
For å avgjøre om CARMA3 formidler EGF-stimulert NF-kB aktivering i lungekreftceller, brukte vi H1299 og A549 celler. Cellene som hadde gjennomgått CARMA3 siRNA behandling oppviste NF-kB-inhibering i nærvær eller fravær av EGF. Tilsvarende resultatene viste at siRNA-mediert Bcl10-knockdown hemmet NF-kB luciferase-ekspresjon (Fig.7 A). Våre studieresultater viser tydelig den avgjørende rolle CARMA3-Bcl10-malt1 signale kompleks i EGF-indusert NF-kB aktivering i lungekreftceller. For ytterligere å bekrefte rollen CARMA3 uttrykk i EGF-indusert NF-kB aktivering i kreftceller, H1299 celler og A549 celler transduced med CARMA3 siRNA ble stimulert med EGF. Vi observerte en blokade i evnen til å indusere EGF p-IkB samtidig med knockdown av CARMA3, men EGF-indusert fosforylering IKK ble ikke påvirket i CARMA3-manglende celler. Videre gjorde CARMA3 knockdown ikke svekke EGF-indusert fosforylering av ERK (figur 7 B). Til sammen våre resultater viser at CARMA3, via IKB fosforylering, formidler EGF-indusert NF-kB aktivering i lungekreftceller.
Diskusjoner
I denne studien har vi evaluert uttrykket mønster og biologisk rolle i romanen scaffoldprotein CARMA3 i menneskelig NSCLC. Våre resultater viser at CARMA3 protein uttrykk i lungekreft vev er høyere sammenlignet med tilsvarende normale lungevev. På proteinnivå, ble CARMA3 ekspresjonen begrenset til cytoplasma i alle prøver. Vi fant en signifikant korrelasjon mellom CARMA3 oppregulering og både TNM stadium og tumorstatus. I tillegg demonstrerte vi at CARMA3 oppregulering også korrelert med en kortere overlevelse av pasienter med lymfeknutestatus N0 samt EGFR status. CARMA3 er tidligere blitt påvist å spille en avgjørende rolle i EGFR-indusert aktivering av NF-kB [18]. EGFR mutasjon er signifikant korrelert med forhøyet EGFR uttrykk, sin nedstrøms signalering, og klinisk respons på gefitinib terapi [21]. Dermed vi videre undersøkt forholdet mellom CARMA3 uttrykk og EGFR mutasjon. Vi har funnet at ekspresjonen av CARMA3 er vesentlig høyere i EGFR mutasjon tilfeller sammenlignet med ikke-mutasjonstilfeller. Disse resultatene antydet at CARMA3 kan spille en viktig rolle i EGFR-mutant lungekreft. En fersk rapport viste at knockdown av flere komponenter av NF-kB veien spesifikt forbedrede celledød indusert av EGFR TKI erlotinib i EGFR-mutant lungekreftceller [22]. Som overekspresjon av CARMA3 proteiner induserer robust NF-kB-aktivering [3], [4], CARMA3 og NF-kB kan tjene som potensielle følge drug targets sammen med EGFR i EGFR-mutant lungekreft.
CARMA3 har vært rapportert å fremme eggstokkreft celle progresjon [17], for å øke human brystkreft cellevekst og invasjonen [18], indusere invasjon av muntlig plateepitelkarsinom (OSCC) [23]; CARMA3 spiller også en viktig rolle i aterogenese [24] og NF-kB-aktivering i luftveis-epitel-celler [25]. Men fortsatt er funksjonelle rolle uklar. For å belyse den biologiske funksjon av CARMA3 i lungekreft, benyttet vi siRNA til knockdown CARMA3 ekspresjon i både A549 og H1299 cellelinjer som uttrykker høye nivåer av CARMA3. Vi observerte nedsatt spredning kapasitet både A549 og H1299 celler etter CARMA3 knockdown. Knockdown av Bcl10, som er en annen komponent av CBM kompleks, også nedsatt celleformering. Dermed CARMA3 siRNA knockdown potensielt svekker ondartet cellevekst gjennom ødeleggelsen av CARMA3-Bcl10-malt1 kompleks. De proliferative faktorer påvirker cellevekst ved å påvirke cellesyklusprogresjon. I denne studien analyser cellesyklus viste at prosentandelen av celler i G1 fase ble øket, mens prosentandelen av celler i S-fasen ble redusert i CARMA3-knockdown-celler sammenlignet med kontrollceller. Knockdown av CARMA3 hemmet G1 til S overgang i cellesyklusutvikling, noe som antyder den rollen CARMA3 i kreftcellelunge spredning. Cellesyklusprogresjon moduleres av et antall molekyler. For å bestemme den potensielle mekanisme CARMA3 om cellesyklusregulering, undersøkte vi effekten av CARMA3 knockdown på cellesyklusrelaterte molekyler. Vi analyserte innholdet av cyklin A, cyklin D1, cyklin D3, CDK4, CDK6, p-Rb, og P27 og fant at knockdown av CARMA3 reduserte protein nivåer av Cyclin D1, CDK4, CDK6, og P-Rb men økte nivåene av p27. Cyklin D1, som driver progresjon av celler inn i de proliferative stadier av cellesyklusen, spiller en viktig rolle i tumorgenese. Cyklin-D /CDK4, 6 /pRB veien har tidligere blitt vist å bli forandret i over 80% av humane tumorer [26], [27]. Det er en viktig regulator av den kritiske G1 til S-fase overgang av cellesyklusen. Under G1 fasen blir pRB inaktivert ved sekvensiell fosforylering hendelser som medieres ved hjelp av forskjellige cyklinavhengige kinaser (CDK), som fører til frigivelse av E2F-transkripsjonsfaktorer, aktivering av mange gener, og progresjonen av cellesyklusen [28]. Den cyclin-avhengig kinase inhibitor p27 (også kalt Kip1) er en vekst hemmende protein som blokkerer cellesyklusprogresjon på G1 /S overgang [29]. Til sammen tyder disse resultatene på at CARMA3 styrer cellesyklus ved å regulere cyclin D1, CDK4, CDK6, p-Rb og p27.
Det har blitt stadig klarere at NF-kB signalering spiller en avgjørende rolle i kreft utvikling og progresjon [30] – [34]. Våre resultater viser videre en direkte kobling mellom CARMA3 og NF-kB aktivering. Endringen av cellesyklusprogresjon etter CARMA3 knockdown er potensielt relatert til NF-kB. NF-kB er gjenstand for en rekke farmasøytiske forskningsstudier som et mål for anti-kreft terapi. Blokkering av NF-kB potensielt arresterer tumorcelle-proliferasjon og fører til apoptose, eller øker følsomhet for virkningen av anti-tumormidler. Denne studien viste at CARMA3 knockdown hemmer NF-kB aktivering, og dermed blokkerer lungekreft progresjon og foreslå potensielle betydningen av dette funnet for nye kreftbehandlingen.
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall i USA og på verdensbasis. Den viktigste formen for lungekreft er NSCLC [35] .Despite fremskritt i tidlig oppdagelse og standard behandling, er NSCLC ofte diagnostisert på et avansert stadium og har en dårlig prognose. Oppdage verdifull biomarkør for deteksjon av NSCLC på et tidlig stadium kan forbedre overlevelse betydelig. Nå er det mange potensielt nyttige biomarkører for lungekreft er blitt verifisert, slik som CEA, CA-125, Cyfra 21-1, TPA [35] – [39]. Flere og flere nye potensielle biomarkører for lungekreft har blitt oppdaget, for eksempel SAA, DDH, EGFR, Mig-6 [40] – [43]. I denne undersøkelsen ser vi CARMA3 som et annet potensielt nyttig biomarkør for lungekreft. Identifikasjoner av biomarkører som fører til mer forståelse for de molekylære stier involvert i lungekreft og bidra til å redusere lidelse og tap av liv forårsaket av den dødelige sykdommen [44].
I konklusjonen, vår studie viste at CARMA3 er overexpressed i NSCLC og korrelerer med lungekreft progresjon. CARMA3 fremmer lungekreft spredning gjennom cellesyklus regulering og NF-kB regulering.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
CARMA3 mRNA knockdown ble vurdert av kvantitativ RT-PCR
doi:. 10,1371 /journal.pone.0036903.s001 plakater (JPG)
Figur S2.
TheCARMA3 uttrykk i en normal (92 #) og 17 NSCLC vev prøver (400 ×)
Doi. 10,1371 /journal.pone.0036903.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
CARMA3 protein uttrykk i NSCLC. Like mengder av totalt protein (60 ug) fra normale (92 #) og NSCLC-vev ble analysert ved hjelp av Western blotting med et anti-CARMA3 antistoff eller et anti-β-actin-antistoff som lasting kontroll. Hver søyle representerer middelverdi ± SD fra tre uavhengige eksperimenter, sammenlignet med kontroll (92 #) prøvestykker benyttet i forsøket var de samme prøver som benyttes i fig S2
doi:. 10,1371 /journal.pone.0036903.s003
