Abstract
Bakgrunn
Flere data favorisere androgen reseptor innblanding i prostata kreft initiering gjennom induksjon av flere genaktivering programmer. Målet med studien er å identifisere potensielle biomarkører for tidlig diagnostisering av prostatakreft (PCA) blant androgen-regulerte gener (ARG) og å vurdere komparativ uttrykket av disse genene i normal prostata og normal prostata-relaterte androgen-sensitive vev som ikke (eller sjelden) gi opphav til kreft.
Metoder
ARG ble valgt i ikke-neoplastisk voksne menneskelige prostata epitel RWPE-1 celler som stabilt uttrykker en eksogen menneskelig androgen reseptor, ved hjelp av RNA-mikromatriser og validering av QRT-PCR. Uttrykk av 48 forhåndsvalgte gener ble kvantifisert i vevsprøver (sædblærene, prostata overgangssoner og prostatakreft, benign prostatahyperplasi hentet fra kirurgiske prøver) med TaqMan® low-density arrays. De diagnostiske forestillinger av disse potensielle biomarkører ble sammenlignet med gener som er forbundet med PCa (dvs. PCA3 og DLX1).
Diskusjon
Ved å krysse uttrykk studier i 26 matchet PCa
Resultater og og normal prostata overgangssone prøver, og 35 matchet sædvæske og PCA prøvene ble 14 gener identifisert. På samme måte ble 9-gener overuttrykt i 15 benign prostatahyperplasi prøver, sammenlignet med PCA prøver. Samlet, valgte vi 8 gener av interesse å vurdere sine diagnostiske forestillinger i forhold til at av PCA3 og DLX1. Blant dem, 3 gener: CRYAB, KCNMA1 og SDPR, ble overuttrykt i alle tre referanse ikke-kreft vev. Arealene under ROC-kurver av disse genene nådd de av PCA3 (0,91) og DLX1 (0,94).
Konklusjoner
Vi identifiserte ARG med redusert uttrykk ved PCA og med betydelige diagnostiske verdier for å skille mellom kreft og ikke-kreft prostata vev, tilsvarende som for PCA3. Gitt deres ekspresjonsmønster, kan de betraktes som potensielt beskyttende mot prostatakreft. Videre må de kunne være komplementær til kjente gener overuttrykt ved PCA og inkludert sammen med dem i multipleks diagnostiske verktøy
Citation. Altintas DM, Allioli N, Decaussin M, de Bernard S, Ruffion A, Samarut J, et al. (2013) uttrykt forskjellig Androgen-regulerte gener i Androgen-følsomme vev avsløre potensielle biomarkører for tidlig prostatakreft. PLoS ONE 8 (6): e66278. doi: 10,1371 /journal.pone.0066278
Redaktør: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia
mottatt: 14 februar 2013; Godkjent: 03.05.2013; Publisert: 28 juni 2013
Copyright: © 2013 Altintas et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra den franske League Against Cancer under «Equipe Labellisée» program, av National Cancer Institute (INCA) og de nasjonale og regionale Cancer programmer. DA var en mottaker av en PhD stipend fra det franske departementet for National Education, Research and Technology (MENRT Grant). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Bakgrunn
Prostatakreft (PCA) er i menn den vanligste kreftsykdommen og den nest største dødsårsaken [1]. Dagens diagnostisering er basert på histologisk undersøkelse av prostata nål-core biopsier. Økt serum PSA (prostataspesifikt antigen) er mye brukt av leger, men ikke bestemt, for å avgjøre prostatabiopsier og detektere prostatakreft [2]. Faktisk kan benign prostatahyperplasi (BPH) og andre ikke-cancerous prostata forhold, slik som akutt eller kronisk prostatitt, heve PSA nivåer. Dette fører til unødvendige prostatabiopsier siden mer enn 60% av biopsier slått av PSA-test til slutt vise seg negativt. Videre gjør PSA-test ikke skille klinisk signifikant fra lat svulster, noe som resulterer i overdiagnostikk og noen ganger overbehandling. Det er derfor et behov for nye biomarkører som hjelper kliniske beslutningsprosesser om biopsi og første behandling.
Den vanlige strategien for kreft biomarkører er å sammenligne prostatakreft med benign prostata vev. Dermed ble identifisert lovende biomarkør PCA3 (prostatakreft gen 3) av differensial skjerm sammenligne kreft med normale og hyperplasi prostataprøver [3]. Høy throughput teknologier, for eksempel microarray analyse og massespektrometri, har økt innen prostatakreft biomarkører. Siden de første publikasjonene i slutten av 90-tallet og begynnelsen av 2000 s, mange biomarkører eller «signatur» profiler som er spesifikke for hver patologisk tilstand, f.eks normal
versus
kreft, er blitt foreslått for prostata kreftdiagnostikk (revue i [4], [5]). Hvorvidt disse potensielle nye biomarkører er alle klinisk relevante restene likevel usikre siden ingen kommer til utviklingsfasen av PCA3 [6].
Prostata er en av androgen-sensitive vev. Mer spesifikt, begge embryonal utvikling av prostata og prostata holdt ved voksen er avhengig av et normalt vev impregnering av androgener. Androgener virker gjennom en spesifikk reseptor, AR (androgen reseptor), som tilhører den nukleære reseptor superfamilien. AR er involvert i PCa vekst [7], [8], men også i dens initiering [9], gjennom induksjon av flere gener [10], [11], [12], [13]. Hvorvidt disse genene kan betraktes som potensielle biomarkører for tidlig diagnose av prostatakreft fortjener å bli vurdert. Vi foreslo derfor en to-trinns strategi for formålet med prostatakreft diagnose biomarkører. Vi først en hypotese om at potensielle biomarkører for tidlig diagnose av prostatakreft kan bli identifisert blant androgen-regulert gener (args). Vi valgte args i udødelig RWPE-1 epithelial prostata celler som stabilt uttrykker AR [14], ved hjelp av RNA-mikromatriser og validering av QRT-PCR. For det andre, evaluert vi sammen uttrykk for disse args i normal prostata og normal prostata-relaterte androgen-sensitive vev som ikke (eller sjelden) gir opphav til kreft. Vi brukte matchet prøver av sædblærene, prostata overgangssoner og prostatakreft fra pasienter operert for radikale prostatectomies og validerte sine diagnostiske forestillinger ved å demonstrere sin evne til å skille mellom normal prostata, BPH og kreft vev, og sammenligner det med at kjente biomarkører av prostatakreft (PCA3, DLX1).
Metoder
Transcriptomic analyse på RWPE-en-AR celler stimulert av R1881
Vi brukte stabil cellelinje RWPE-en-AR som konstitutivt uttrykker et eksogent AR som beskrevet andre steder [14]. Celler ble opprettholdt i keratinocytt-vekstmedium (Invitrogen 17005-042) supplert med rEGF (rekombinant epitelial vekstfaktor) og BPE (bovint hypofyse-ekstrakt) (Invitrogen 37000015), antibiotika og antimykotika. RWPE-1-AR-celler ble stimulert med ikke-omsettelig androgen, R1881 (10-9 M), i vekstmediet fratatt BPE. Tre uavhengige cellekultur eksperimenter for hver behandling tilstand (kjøretøy eller R1881 i 3 timer og 24 timer) ble utført for microarray analyse. Total RNA ble ekstrahert ved bruk av RNeasy® mini kit (74104, Qiagen). RNA-konsentrasjonen ble målt ved OD lesing ved hjelp av en Nanodrop spektrofotometer.
For å sjekke responsen på R1881 i stimulerte celler, uttrykk for et panel av kjente mål AR gener ble analysert ved kvantitativ polymerase chain reaction (qPCR) for hver tilstand. Den fås fra 1 mikrogram cDNA retrostranscribed RNA (Promega M1701) ble forsterket ved hjelp QuantiTect SYBR® Grønn PCR Kit (Qiagen 204145). Primere gitt fra Qiagen:. Hs_KLK3 /PSA (QT00027713), MME (QT00048755), Hs_TMPRSS2 (QT00058156), Hs_MMP2 (QT00088396), Hs_MCM10 (QT00030338), og Hs_TPB (QT00000721) som husholdningsgenet
Kvaliteten på ekstrahert RNA ble vurdert ved hjelp av en Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). RNA integritet numrene til alle prøvene var 10 år Revers transkripsjon, merking og hybridisering på Affymetrix Menneskelig 133 pluss 2,0 Arrays ble utført av ProfileXpert tjeneste (Bron, Frankrike) i henhold til Affymetrix ™ protokoller (Expression analyse Teknisk håndbok, 2008, Affymetrix). Ett pg av total RNA ble benyttet for fremstilling av biotinylert cRNA og 15 ug av cRNA ble hybridisert. Den Affymetrix lufthåndtering Station 450 ble brukt til vask og farging. Arrays ble skannet med Genechip Scanner 3000 (Affymetrix). Affymetrix CEL filene ble analysert i R bruker Bioconductor pakke med pakker. Rå sondesignaler var bakgrunnen korrigert, normalisert og oppsummert med RMA prosedyre. Lineære modeller ble brukt med limma pakningen for å identifisere gener med potensielt betydelige endringer i uttrykk som svar til annen effekt eller R1881 behandling på hver varighet (modell formel: ~ Varighet + Varighet: R1881). Det empiriske Bayes metode ble brukt til å beregne modererte p-verdier som deretter ble korrigert for multiple sammenligninger ved hjelp av Benjamini og Hochberg falske funnrate (FDR) kontrollerende prosedyre. Microarray data er blitt deponert og beskrevet i samsvar med MIAME retningslinjer, i Gene Expression Omnibus under sjonsnummer GSE29232 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE29232 ).
for å vurdere at de relative RNA uttrykk nivåer av 14 regulerte-transkripsjoner var i samsvar med microarray data, RT-qPCR ble utført i tre paralleller fra samme RNA som i microarray eksperimenter ved hjelp QuantiTect SYBR® Grønn PCR Kit (Qiagen 204145). Primere gitt fra Qiagen: Hs_EGFR (QT00085701), SOX2 (QT00237601), Hs_NDRG1 (QT02290232), Hs_MME (QT00048755), Hs_TFPI2 (QT00062804), Hs_CDK5R1 (QT00231644), Hs_SCNN1G (QT00063217), Hs_RHOB (QT00227409), Hs_PRDM1 (QT00060494) Hs_IL7R (QT00053634), Hs_SERPINB2 (QT00077497), Hs_PAX9 (QT00023317), Hs_FST (QT01665853), Hs_ADAMTS1 (QT00098588) og Hs_TPB (QT00000721) som husholdningsgenet for å normalisere rådata. Sammenhenger mellom microarray og qPCR resultatene ble utført ved hjelp av Spearman test og lineær regresjonsanalyse
Identifikasjon av kandidat biomarkør gener
potensiell kandidat gener ble valgt med følgende kriterier:. 1) androgen regulert: vurderer log2 fold-endring avskåret verdi til 1,2 og FDR (falske funnraten) med
P
0,05; 2) uttrykt ved betydelig høyere nivåer etter behandling (3 h og /eller 24 timers varighet); 3) Gene ontogeny kategorier og relevante baner ved hjelp av oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA®) programvare (oppfinnsomhet Systems). Totalt 36 genet målene ble valgt for bekreftelse av (differensial) uttrykk i pasientprøver.
Vevsprøver
Etikk uttalelse.
Ikke-intervensjons biomedisinsk forskning protokoll for vev prøvene bevaring etter en prostataoperasjon er satt opp ved Senter Hospitalier Lyon-Sud og etikkomiteen i Lyon (CPP Sud-Est 2) godkjent det spesielt for denne studien. Derfor ble pasientene innlagt på avdelingen for urologi i Centre Hospitalier Lyon-Sud informert og ga frivillig signerte informert samtykke før eventuelle vevsprøve bevaring og for forskningsbruk.
Vevsprøver.
prostatakreft (PCA), prostata overgangssone (PTZ) og sædvæske (SV) frosset vev ble hentet fra radikale prostatectomies. Den Gleason score (GS) brukes for prostatakreft vev gradering. PTN patologisk tumor oppsetningen ble bestemt i henhold til UICC TNM klassifikasjon 2002 (6
th edition). Frosne vev fra pasienter med BPH ble oppnådd fra transuretral reseksjon av prostata. Fraværet av kreft i BPH prøver ble undersøkt av en patolog erfaren i feltet av prostatalidelser. Patologiske kjennetegn ved kreft pasienter inkludert i studien er oppsummert i tabell 1.
For sammenlignende uttrykk studier i PCA SV og PTZ matchet vevsprøver, som er hentet fra de samme kirurgiske prøver, jo fraværet av kreftceller i SV og PTZ ble kontrollert av strenge histologisk undersøkelse av vev ved siden av disse brikkene er reservert for frossen og RNA ekstraksjon. For diagnostiske formål, ble brukt 50 PCA vevsprøver: GS 6 (
n = 1
), GS 7 (3 + 4) (
n = 12
), GS 7 (4 + 3 ) (
n = 24
), GS 8 (
n = 6
), og GS 9 (
n = 7
).
RNA ekstraksjon og revers transkripsjon
Frosset vev ble lagret i flytende nitrogen inntil RNA ekstraksjon Total RNA ble ekstrahert fra homogeniserte vev av Trizol® (Invitrogen) og ble bedømt for integritet ved hjelp av 2100 Bioanalyzer® (Agilent). 1 ug total RNA ble omdannet til cDNA ved anvendelse av First-Strand cDNA Synthesis Kit® (Invitrogen). Den resulterende cDNA ble brukt umiddelbart for sanntids qPCR
TLDA sanntid qPCR
Den Applied Biosystems TaqMan teknologi (TaqMan® low-density arrays: TLDAs). Brukes for kvantitativ analyse av genuttrykk. Prinsippet for high-throughput sanntids qPCR systemet er basert på den 384-brønners mikrofluid kort (8 separate lastende porter, hver med 48 separate brønner) [15]. Hver to-ul brønn inneholder spesifikke, brukerdefinerte primere og prober, i stand til spesifikt å oppdage et enkelt gen. Hver cDNA-prøve (100 ng cDNA ekvivalent) ble tilsatt til et like stort volum av 2 x TaqMan Gene. Ekspresjon Master Mix® (Applied Biosystems) for en total på 100 ul per port. Etter forsiktig blanding og sentrifugering, ble blandingen overført til en lastehavn på et TLDA kort. Matrisen ble sentrifugert to ganger i 1 minutt, hver på 1200 rpm, for å fordele prøvene fra lastehavnen til hver brønn. Kortet ble deretter forseglet og PCR-amplifisering utført ved å bruke en 7900HT Fast real-time PCR System® (Applied Biosystems) ved å følge protokollen beskrevet av produsenten.
I denne studien, mRNA-nivåene av 48 gener ble målt. Hver plate hadde 18S-spesifikke primer /probe som en endogen kontroll. I tillegg HMBS, RPL13A, ACTB, TBP, og UBB ble målt som potensielle housekeeping gener. To tekniske duplikater ble utført for hver enkelt prøve.
Statistisk analyse
Real-time data.
Terskelen syklus (Ct) ble automatisk gitt av SDS2.2® programvarepakke (Applied Biosystems). Relative mengder (RQ) ble bestemt ved hjelp av ligningen: RQ = 2-ΔΔCt. Alle data ble samlet inn i duplikat for hvert gen ekspresjon per prøve. De TAQMAN Array kort data ble samtidig analysert for differensial uttrykk ved hjelp av Integromics Realtime StatMiner 4.0® pakke som integrerer BioConductor R programvare. De forskjellige trinn i arbeidsflytprosessen av PCR-dataanalyse: kvalitetskontroll, velge den mest stabile endogene kontroll, data normalisering og relative mengdebestemmelse, ble oppnådd med denne bioinformatiske verktøyet. Som kontroller for tilstedeværelsen av prostataceller i den prostatiske prøver, to prostata-spesifikke markører, medlemmer av familien kallikrein, dvs. KLK2 og KLK3 /PSA, ble anvendt for å normalisere. Fold endringer i genekspresjon ble presentert av Log10RQ (Log10RQ = 0 dersom ingen ekspresjon endring; Log10RQ = 1 dersom prøven er uttrykt 10 ganger større enn i kalibratoren prøven; Log10RG = -1 dersom prøven er uttrykt 10 ganger mindre enn i kalibrator prøve). The Student t paret test ble brukt for sammenligninger mellom matchet prøvene. Den parametrisk Wilcoxon test ble brukt for sammenligninger mellom ikke-matchet prøvene. Den Benjamini og Hochberg False funnraten ble tatt som nivået av betydning. Betydning ble ansett som
P
. 0,01
Evaluering av diagnostiske forestillinger
Receiver ende karakteristiske (ROC) kurver ble beregnet for å vurdere den diagnostiske makt. hver enkelt variabel univariately ved arealet under kurven (AUC) av ROC-kurven. Verdier for ROC kurver var -ΔCt normalisert ved hjelp av geometriske gjennomsnittet av TBP, KLK2 og KLK3. Den 95% konfidensintervall (95% IC) av AUC-verdiene ble beregnet som beskrevet (13). For dette uttrykket studien ble potensielle biomarkører anses verdifullt hvis AUC ≥0.9 (13). Alle disse statistiske beregninger ble utført ved hjelp STATA®11.0 programvare (College Station, Texas).
Diskusjon
Androgen-regulerte gener uttrykk profiler og identifisering av potensielle mRNA biomarkører
Resultater og
Vi forsøkte å identifisere androgen-avhengige genet aktiviseringsprogrammer potensielt involvert i de tidlige stadier av prostata kreftutvikling. Vi har derfor valgt å bruke en cellemodell så nær som mulig til normale prostataceller heller enn prostatakreftcellelinjer, hvori molekylære hendelser som er egnet til å representere sene stadier av prostatakreft utvikling. Vi brukte ikke-kreft RWPE-1 celler tidligere oppnådd ved immortalization av ikke-neoplastisk voksent menneske prostata epitelceller med humant papillomavirus 18 [16]. Til tross immortalization, disse cellene viste seg å oppføre seg som nesten normale prostataceller: bevaring av Y-kromosom, normal uttrykk for cytokeratins og E-cadherin, vekst stimulering samt PSA og AR uttrykk som svar på androgener [17], [18]. De har også beholdt evnen til å utvikle seg, særlig i Matrigel 3D-kulturer, vel-polariserte hule kuler gjennomgå og til slutt acinar differensiering som en respons på vekstfaktorer og som et resultat av interaksjon med ekstracellulære matriks [17], [18], [ ,,,0],19].
For å forsterke androgen-avhengige genet aktivering programmer, brukte vi stabilt transfektert RWPE-1 celler med villtype AR genet [14]. Den resulterte RWPE-I-AR celler ble sterkt androgen-sensitive som kontrolleres av spredningsanalyser. Disse cellene ble behandlet av den ikke omsettelig syntetisk androgen R1881 i 3 timer og 24 timer. Androgen- induserte stimulering ble først undersøkt ved kvantitativ RT-PCR fra et panel av kjente mål-AR gener inkludert KLK3 /PSA, MME (makrofag metalloelastase), og TMPRSS2 (data ikke vist). Hentet cDNA fra celler behandlet eller ikke med R1881 ble deretter hybridisert på Affymetrix Menneskelig 133 pluss 2,0 arrays.
Transcriptomic profilering identifisert ved hjelp av en log2 fold-endring avskåret verdi på 1,2, 75 gener som viser oppregulering og 33 gener utviser ned-regulering i R1881-behandlede RWPE-en-AR cellene under 3 timer i forhold til kontroller (kjøretøy behandlet), med tanke på FDR (falske funnraten) med
P
0,05. Transcriptomic profilering identifisert 208 gener stiller opp regulering og 116 gener som utviser ned-regulering i R1881-behandlede RWPE-en-AR cellene under 24 timer i forhold til kontrollene, med tanke på FDR med
P
. 0,05
Validerings eksperimenter ble utført for å bekrefte nøyaktigheten av matrisen genuttrykk målinger på utvalgte transkripsjoner forskjellig uttrykt i 3 timer og /eller 24 timers varighet R1881 behandling (7 oppregulert og 7 nedregulert) med LightCycler sanntid qPCR : EGFR, SOX2, NDRG1, MME, TFPI2, CDK5R1, SCNN1G, RHOB, PRDM1, IL7R, SERPINB2, PAX9, FST, og ADAMTS1. Resultatene bekreftet at de relative RNA uttrykk nivåer var i samsvar med microarray data (tabell S1).
For å identifisere og prioritere biomarkør kandidater blant gener funnet å være forskjellig uttrykt etter 3 timer og /eller 24 timer R1881 behandling, vi basert
i silico
analyser av biologiske egenskaper som anses å være den mest relevante i både litteraturstudie og oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA®). Analyser med denne programvaren returnerte følgende informasjon: 1 /de relevante funksjoner knyttet til datasettet og 2 /berørte signalering og metabolske veier knyttet til datasettet. I tillegg til høy fold-endring i microarray datasettet på 3 timer og /eller 24 timer av R1881 utredning, ble genene utformet som av interesse hvis de har minst ett disse funksjonelle merknader eller sykdoms foreninger i oppfinnsomhet Kunnskapsdatabase: mulig deteksjon i urin , velkjent uttrykk vev og, i særdeleshet, differensiell ekspresjon i prostatakreftcellelinjer, i prostata benigne vev og /eller i prostata cancer, og /eller sterk assosiasjon med kreftfremkallende prosesser. Vi foretrekkes også oppregulert gener til nedregulert seg i et forsøk på å lette eventuell fremtidig bruk i klinisk praksis. Tretti seks gener matchet disse kriteriene (tabell 2) og ble brukt for videre studier.
Kvantitativ RT-PCR analyse av humane kreft og ikke-kreft prostata matchet vev
For ytterligere å undersøke uttrykket nivåer av androgen regulert gener identifisert ved microarray analyse ble utført kvantitativ RT-PCR-analyse på utvalgte mål med humane PCa og prostata overgangssonen (PTZ) matchet vev. PTZ ble valgt fordi den er kjent for å sjelden gi opphav til prostatakreft [20]. Vårt mål var å identifisere biomarkører som kan skille mellom kreft og ikke-kreft prostata vev. Vi valgte storskala RT-PCR RNA kvantifisering på arrays TaqMan® lav tetthet (TLDAs, Applied Biosystems) som tillater, per prøve, samtidige analyser av opptil 48 mål på tilpassede kort. Kvantitativ RT-PCR ble valgt som et utgangspunkt for sammenligning fordi den tillater mRNA kvantifisering, en prosess som tidligere ble brukt for å vurdere vev uttrykk [21], [22], [23], [24], [25], [26] og urin mengder [22] fra PCA3 (prostatakreft gen 3), et gen som vi ønsket å bruke som en kontroll positiv genet. PCA3 er faktisk nå anerkjent som en verdifull biomarkør for prostatakreft (revue i [27], [28]), og har vist seg å være spesielt uttrykt i opp til 95% av PCa [3], [29]. PCA3 ble derfor anvendt som en positiv kontroll, noe som reflekterer PCa- spesifikk ekspresjon panel. TMPRSS2 [30] og DLX1 [31], [32] er også potensielle PCA biomarkører, som vist ved å undersøke microarray data ved hjelp av Oncomine database, og deres uttrykk på samme måte ble vurdert som positive kontroller. I tillegg vurderte vi uttrykk for 6 mulige husholdningsgener: 18S, ACTB, HMBS, RPL13A, TBP, og UBB, samt 2 gener anses som prostata-spesifikt gener: KLK2 og KLK3 /PSA. Som en global markør for androgen-sensitive vev (prostata og sædblære), har vi også valgt AR genet for analyse (tabell 2).
Enten PCA og PTZ vev uttrykke lignende RNA mengder er ukjent. Normalisering av en husholdningsgenet ble derfor berettiget. Nye rapporter viser at housekeeping gener kan faktisk gi alvorlige forskjeller mellom vev, cellelinjer eller kliniske prøver [33]. Vi vil derfor først forsøkt å finne ut hvilke potensial housekeeping gener ble stabilt uttrykt under de ulike forhold fra mellom 6 vi valgte. TBP ble funnet som det mest stabile endogene kontroll ved hjelp av NormFinder algoritme av StatMiner® pakken og ble anvendt som normalisering genet i følgende deler av studien. Prostata-spesifikt gener KLK2 og KLK3 /PSA rives også klart uttrykk stabilitet og ble brukt sammen med TBP som endogen kontroll (geometrisk gjennomsnitt).
Vi sammenlignet uttrykk for alle de utvalgte gener i 26 matchet normal prostata PTZ og PCA vev, hentet fra radikal prostatektomi prøver. Følgelig ble 26 gener funnet å være signifikant (
P
0,01) overuttrykt i normal prostata overgangssonen i forhold til PCa (figur 1A og fig S1). Oppfinnsomhet Pathway Analyser viste at 17 og 21 av disse 26 gener som tilhører 2 betydelig representert biologiske funksjoner: cellebevegelse (migrering av celler spesielt) og kreft (epithelial karsinom spesielt), henholdsvis. Omvendt, ble bare PCA3 og DLX1 gener bestemt til å ha høyere (mer enn 50- og 60-ganger, henholdsvis) i PCA vev sammenlignet med matchede normale vev (PTZ
P
0,01) (figur 1A). Det er verdt å merke seg at ACTB (koding beta-aktin), vanligvis ansett som en potensiell husholdningsgenet, ble også funnet å være overuttrykt i PTZ. Faktisk er ACTB androgen-regulert [34], [35] og har tidligere rapportert å være uttrykt forskjellig mellom kreft og ikke-kreft prostata-vev [36]
Y-akse:. Log10 av RQ (relativ mengder); X-aksen: gener som uttrykk var statistisk signifikant forskjellig mellom. A) 26 matches normal prostata overgangssone og prostatakreft prøver B) 27 prostatakreftprøver og 15 prøver av benign prostatahyperplasi C) 35 matchet sædvæske og prostatakreft prøver
Benign prostata hypertrofi (BPH) er en interessant modell som sammenligning med PCa er relevant. Disse to patologiske tilstander faktisk dele flere punkter, inkludert spesifikke nærmiljø (samme blodtilførsel og utstilling til mitogener), androgen-følsomhet og ukontrollert celledeling. I motsetning til PCA stammer BPH fra PTZ og er tenkt å aldri være kilden til malign transformasjon. Ekspresjon av de utvalgte gener ble derfor sammenlignet i de 26 tidligere testede PCA prøver og i løpet av 15 ubeslektede BPH prøver, hvor fravær av kreftceller ble konstatert ved en patolog ekspert på prostata patologi feltet. Vi brukte de samme 3 normaliserings gener (TBP, KLK2 og KLK3 /PSA), som viste seg å være stabil i henhold til NormFinder algoritme. På denne måten har vi identifisert 9 gener signifikant (
P
0,01) overexpressed i BPH forhold til PCa (figur 1B og figur S2): AR, AUTS2, CDK5R1, CRYAB, FOXA2, KCNMA1, MME, SCEL, og SDPR. CDK5R1 (og bare dette genet) ble også funnet å være overuttrykt i BPH vev når du sammenligner til uttrykk i normal prostata PTZ. Det koder for den såkalte p35-protein, som fungerer som en viktig aktivator av cdk5, en sterk regulator av nevronal migrasjon. Protein p35 er svakt uttrykt i PCA vevsprøver og viste seg å være involvert i prostata celle apoptose [37]. Så langt vi kjenner til, har bestemt uttrykk i BPH aldri blitt rapportert. Fem gener ble identifisert som overexpressed ved PCA i forhold til BPH: Alcam, CLDN7, DLX1, PCA3 og RASD1 (figur 1B). Den PCA3 genet, svært spesifikke for prostata kreft celler, har blitt rapportert å være overuttrykt 66-100 ganger i prostata kreft
versus
normal prostata og 140 ganger i prostata kreft
versus
BPH [ ,,,0],3], [21]. I vår studie ble det observert en sterk overekspresjon i PCa 50-210 ganger, sammenlignet med normal prostata og BPH, respektivt. DLX1 viste samme uttrykksmønster, som tidligere observert [31]. Alcam og CLDN7 både koder for proteiner lokalisert til inter-cellulære veikryssene mangfoldig epitel og har tidligere blitt foreslått som androgen-regulert og overexpressed ved PCA [38], [39]. RasD1 ble opprinnelig beskrevet som et deksametason-induserbar ras-beslektede proteiner og potensiell aktør i å forebygge avvikende cellevekst i flere cellelinjer [40]. Ifølge Oppfinnsomhet Pathway Analysis®, blant de 14 genene dermed funnet å være forskjellig uttrykt i BPH og prostatakreft, alle var involvert i en representert funksjonell nettverk betydelig – cellevekst og spredning – bortsett PCA3 (lite er kjent om dens funksjon, men PCA3 i kontrollen av PCa celleoverlevelse, dels ved modulering av signalisering AR [41]), og CDK5R1 (heller involvert, sammen med 8 andre gener, i en betydelig representert biologisk funksjon:. celledød og overlevelse)
kvantitative RT-PCR analyse av menneskelig kreft prostata og sædvæske matchet vev
De ovennevnte sammenlignende uttrykk studier mulig for oss å identifisere gener overuttrykt i ikke cancerous prostata vev i forhold til prostatakreft. Til tross for deres potensielle diagnostiske verdi, kan disse genene også være av betydning som putative markører for prosesser beskyttende mot kreft transformasjon. Deres høye uttrykk i BPH og normal PTZ kan være relatert til de fattige eller null forekomst av kreft i disse vev, mens deres svake uttrykk i prostata kan tillate kreft initiering med stor frekvens. En slik mekanisme er nylig blitt foreslått i en annen prostata-relaterte vev: sædblæren [42]. Forfatterne brukte en to-trinns strategi ved først å velge gener med vesentlig høyere uttrykk nivåer i sædblærene snarere enn i normal prostata og for det andre ved å krysse denne listen med gener identifisert andre steder fordi deres uttrykk ble brakt til taushet ved PCA av promoter DNA metylering. Åtte gener av interesse ble derfor identifisert [42]. Denne studien er i samsvar med dette utgitt en i at vi også brukt en to-trinns strategi som tillot oss å kunne velge kandidat androgen-regulert gener hvis uttrykk ble målt i PCA prøver og sammenlignet med referanse prostata vev kjent sjelden eller aldri gi opphav til kreft til tross for deres felles embryologic opprinnelse og kreftfremkallende eksponering. Likeledes er det kjent at, til tross for funksjoner delte felles av prostata og sædblærene, inkludert spesielt androgen-avhengige vekst og funksjon, er forekomsten av kreft i sædblærene og prostata er påfallende forskjellig [42]. Viktigere, kunne grunnlag av denne forskjell korreleres med mekanismer som ligger under prostata kreft [42]. Legge vev fra normale sædblærene ble derfor vurdert i denne studien, for å forsterke uttrykket sammenligning mellom prostatakreft og en referanse godartet vev, sterkt beskyttet mot kreft transformasjon.
Vi har derfor undersøkt genuttrykk i 35 matchet sædvæske og PCA vevene ved hjelp av de samme utvalgte gener (tabell 2). Mangelen på sædblæren involvering av prostatacancer ble forsiktig patologisk konstatert før bruk i studien. TBP ble funnet som det mest stabile endogene kontroll ved hjelp av NormFinder algoritme av StatMiner® pakken og ble brukt som normalisering genet. Som forventet ble prostata-spesifikt KLK2 og KLK3 gener underexpressed i sædvæske i forhold til prostatavevet (
P
0,01). Ti andre gener ble også betydelig overuttrykt i PCa i forhold til sædblære: Alcam, LOX, BNIP3, CLDN8, AQP3, FOXA2, og NDRG1, samt den forventede TMPRSS2, DLX1 og PCA3 (figur 1C og fig S3). Til sammenligning var 18 gener funnet å være betydelig overuttrykt i sædvæske i forhold til PCA: CRYAB, KCNMA1, AKR1C1 /2, TFP12, SDPR, CD24L4, SERPINB1, FLRT3, DACT1, SCNN1G, FST, RHOB, SGK1, LAMA3, AKR1C3 , SEPP1, RGS2 og ACTB (
P
0,01).
