Abstract
α-solanin, en steroidal glycoalkaloid i potet, ble funnet å ha spredning-inhiberende og apoptose fremmende effekt på flere kreftceller, slik som kloning, lever, melanom kreftceller. Men antitumor effekt av α-solanine på kreft i bukspyttkjertelen er ikke fullstendig evaluert. I denne studien, spurte vi inn i den anti-kreftfremkallende effekten av α-solanine mot menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler. I denne studien undersøkte vi anti-kreftfremkallende effekten av α-solanine mot menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler. In vitro, α-solanin inhiberte proliferasjon av PANC-1, sw1990, MIA PACA-2-celler på en doseavhengig måte, samt cellemigrering og invasjon med atoksiske doser. Uttrykket av MMP-2/9, ble ekstracellulære induserer matriksmetalloproteinase (EMMPRIN), CD44 Enos og E-cadherin trykkes av α-solanine i PANC-1 celler. Videre har betydelig redusert vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) ekspresjon og rør dannelsen av endotelceller ble bedømmes på følgende α-solanine behandling. Undertrykt fosforylering av Akt, mTOR, og Stat3, og styrke fosforylering av β-catenin ble funnet, sammen med markant redusert tran-atom av NF-kB, β-catenin og TCF-en. Etter administrasjon av α-solanine (6 mikrogram /g for 2 uker) i xenograft modell, ble tumor volum og vekt er redusert med 61% og 43% (p 0,05) henholdsvis som viser redusert MMP-2/9, PCNA og VEGF uttrykk. I konklusjonen, viste α-solanine gunstige effekter på kreft i bukspyttkjertelen in vitro og in vivo, som kan via undertrykke veien spredning, angiogenese og metastase
Citation. Lv C, Kong H, Dong G, Liu L, Tong K, Sun H, et al. (2014) Antitumor Effekt av α-Solanin mot bukspyttkjertelkreft in vitro og in vivo. PLoS ONE 9 (2): e87868. doi: 10,1371 /journal.pone.0087868
Redaktør: Yu-Jia Chang, Taipei Medicine University, Taiwan
mottatt: 02.10.2013; Godkjent: 26 desember 2013; Publisert: 05.02.2014
Copyright: © 2014 Lv et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble sponset fra China National Natural Science Foundation (nr 81070372, nr 81370563), Zhejiang Provincial Program for dyrking av høy level Innovative Helse talenter og et Provincial Administrasjon av tradisjonell kinesisk medisin i Zhejiang-provinsen i Kina (NO. WKJ2012-2 -033, nr 2011ZA072), et distrikt FoU-programmet for Longwan District of Wenzhou, Zhejiang, Kina (No. 2010YS5). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Pankreatisk karsinom er en av de mest aggressive og dødelig kreft på grunn av mangel på et tidlig diagnose, medikamentresistens og dårlig prognose, og som sådan er den fjerde ledende årsak til kreft dødelighet over hele verden [1], [ ,,,0],2]. Foreløpig er standard behandling av bukspyttkjertelkreft avhengig av kirurgi, stråling og narkotika. Men bare ca 25% av kreft i bukspyttkjertelen pasienter diagnostisert med resektabel skjema tillegge invasjonen av sykdommen [3]. Gemcitabin, en standard førstelinjebehandling av metastatisk kreft i bukspyttkjertelen hos president, er mye brukt, men viser dårlig terapeutisk effekt for å anskaffe chemoresistance og en rekke bivirkninger [4]. Således søker nye effektive medisiner contraposing for å øke den anti-angiogene evne og beherske metastase er et desperat behov for kreft i bukspyttkjertelen, rettet mot dets mest høyt vaskulariserte og invasive tumorer.
I tillegg til utvikling av kreft celle apoptose og nekrose inhibering av celleproliferasjon, infiltrasjon og metastase er av største viktighet. Tumormetastase er en meget koordinert prosess som er markedsført av forskjellige proteolytiske enzymer nedbryter ekstracellulær matriks (ECM) og basalmembran (BM). Matriks-metalloproteinaser (MMP) er antatt å dominere delta i tumorcellemigrering, vev invasjon og metastase [5]. MMP-2 og MMP-9 spiller nøkkelroller i ferd med metastasering mellom MMP’er. Celleadhesjonsmolekyl E-cadherin, regulere celle polaritet, differensiering, proliferasjon og migrasjon gjennom sin nære forbindelse til aktin cytoskeletal nettverk [6], viser en lavere uttrykk i bukspyttkjertelkreft enn i normal bukspyttkjertelen vev [7]. I tillegg har Wnt /β-catenin signalkaskade vært relevant for kreft og vaskulær proliferasjon, skjebne spesifikasjon og cellemetastase. Wnt ligand binder seg til sin reseptor frizzled å inaktivere β-catenin ødeleggelse kompleks, noe som fører til ufosforylerte β-catenin akkumulering i både cytoplasma og cellekjernen. I kjernen, danner β-catenin en heterodimere kompleks med TCF /LEF familie av DNA-bindende proteiner og derved aktiverer transkripsjon av Wnt målgener, går på bekostning av c-myc, survivin, cyclinD1, og MMP [8]. Nyere studier har vist at phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) -Akt /mammalian target of rapamycin (mTOR) veien er også involvert i bukspyttkjertelen endokrine svulster (Dyr) tumorigenesis og progresjon [9], [10], celleoverlevelse, celle adhesjon og metastase [11], [12]. Gjennom crosstalk med Wnt, NF-kB og MAPK trasé, Akt /mTOR aktivitet fremmer kreftcelle spredning, hemming av apotosis og metastasering [13], [14]. Videre er konstitutivt aktivert STAT proteiner funnet i flere tumorer [15], [16], [17], [18]. Videre Wnt /β-catenin og Akt /mTOR trasé regulere ekspresjonen av MMP’er av transkripsjonsfaktorer, så som NF-kB [19], [20]. Bevis er montering at NF-kB spiller en sentral rolle i spredning, apoptose hemming og angiogenese av bukspyttkjertelkreft [21]. Dermed blokkerer Wnt /β-catenin og Akt /mTOR veier samt stat og NF-kB gi potensielle mål for kreft terapeutiske strategier.
α-Solanin, et bioaktivt komponent av de viktigste steroide Glykoalkaloider i poteter er godt undersøkt for sin effekt på antitumor egenskaper. Flere rapporter har vist at a-Solanin utstillinger vekstinhibering og apoptose-induksjon i flere kreftceller [22], [23]. Bevis viser også α-solanin har anti-inflammatorisk virkning in vitro ved reduksjon av interleukin-2 og interleukin-8 produksjoner [24]. Effekt og tilknyttede molekylære mekanismer på grunn av a-solanine mot kreft i bukspyttkjertelen er ikke vurdert ennå. Derfor vurderte vi effekten av α-solanine utnytte bukspyttkjertelkreft både in vitro og in vivo i denne studien.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
I denne studien , dyr omsorg og eksperimenter ble utført i samsvar med godkjent protokoll fra Animal Experimental Etisk Inspeksjon av Forsøksdyr Centre, Wenzhou Medical College (Permit Number: wydw2013-0001). Alle operasjoner ble utført under bedøvelse, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
1. Cell Line og reagenser
α-solanine, ble dimetylsulfoksid (DMSO) kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Protein assay kit ble hentet fra Bio-Rad Labs (Hercules, CA, USA). Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) og ble kjøpt fra Gibco /BRL (Gaithersburg, MD, U.S.A.). Matrigel var fra BD Biosciences (Bedford, MA, USA). Total RNA ekstraksjon kit og polymerase kjedereaksjon (PCR) ble kit fra Viogene (Sunnyvale, CA, USA). Antistoffer mot MMP-2, MMP-9, E-cadherin, TCF-en, STAT3 og fosforylert STAT3 ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Antistoffer mot β-aktin, VEGF, PCNA, β-catenin, Akt, mTOR, ble fosforylerte proteiner innkjøpt fra Abcam (Cambridge, MA, USA). PANC-1, sw1990, ble MIA PACA-2 og human navlevene endotelceller (HUVEC) fås fra ATCC (Manassas, VA, USA). Bukspyttkjertelkreft cellelinjer er opprettholdt i DMEM med 10% FBS og inkubert i en 5% CO
2-fuktet inkubator ved 37 ° C, HUVECs ble dyrket i M199 medium med 10% FBS. a-Solanin ble smeltet i DMSO og fortynnet med dyrkningsmedium (sluttkonsentrasjonen av DMSO var mindre enn 0,1%).
2. Levedyktighet Celle-analysen og Colony Assay
Seeding 20.000 celler fra hvert kreftcellelinje i hver brønn av 96-brønns plate og utskifting av kulturmedium inneholdende forskjellige konsentrasjoner av α-solanin (3,6,9,12 ug /pl) etter 24 timer. Fortsetter å utvikle i 24 og 48 timer, og deretter ble mediet erstattet med friskt medium inkludering av 10% CCK8 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan). Etter 1-4 timer ble supernatantene målt spektrofotometrisk ved 450 nm.
Anchorage uavhengig cellevekst blir evaluert ved å utføre colony assay (GENMED SCIENTIFECS INC, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. I korte trekk, blir 1,5 ml Base Agar matrikslaget dispensert i hver brønn av en 12-brønns plate (prøver ble analysert i triplikat). Platen ble kjølt ved romtemperatur inntil solid. Deretter 1,5 ml vekst agar lag bestående av 2500 celler ble tilsatt i hver brønn. Platen ble avkjølt ved romtemperatur igjen før veksten lag stivnet. En ytterligere 500 ul kulturmedium inneholdende forskjellige konsentrasjoner av α-solanin ble tilsatt på toppen av vekstlaget. Inkuber cellene ved 37 ° C og 5% CO
2 i 2 uker og totale kolonier ble tellet.
3. Cell migrasjon og invasjon Analyser
Cell migrasjon ble studert ved å utføre sårheling analyser. 10.000 celler av hver bukspyttkjertelkreft cellelinje ble sådd ut i høy 35 mm-u-retter med dyrkningsinnsatser (Ibidi, Martinsried, Tyskland). Når celler vokste til konfluens, ble innsatser deretter fjernet med sterile pinsetter for å skape et sår felt på omtrent 500 um. Etter fjerning av cellerester med PBS, ble cellene eksponert for forskjellige konsentrasjoner av α-solanin i 24 timer. Cellemigrasjon ble oppfattet av invertert mikroskop og fotografert (100 × forstørrelse). Såret området ble skalert av Image Pro Plus. Den til lukking av sår prosent ble beregnet ved ligningen: lukking av sår% = [1- (viklet område etter 24 h /viklet området etter 0 h) x 100%
Cell invasjons analyser ble gjennomført ved bruk av 6,5 mm av Transwell kamre. utstyrt med 8,0 mikrometer pore-størrelse polykarbonat membraner. I disse analysene ble øvre nippet først belagt med 50 ul av Matrigel ved en 1:05 fortynning, og inkubert ved 37 ° C i 2 timer. Etter å ha behandlet med α-solanin i 24 timer i serum-frie celler (10000 celler /brønn) suspensjon av mellom hver bukspyttkjertelkreft cellelinje ble fylt på toppen av kammeret transwell. De nedre kamre ble fylt med 500 ul DMEM supplert med 10% FBS. Etter inkubering ved 37 ° C i 6 timer, ble ikke-invasive celler fysisk skrapet fra membranen med bomullspinner. De invasive Cellene ble farget med DAPI i 5 minutter og observert med et fluorescerende mikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland). Fluorescerende celler ble telt ved hjelp av Image Pro Plus.
4. In Vitro
Angiogenese Assay
Analyse av kapillær formasjonen ble utført ved hjelp av rør formasjons analyser (Ibidi, Martinsried, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet ble 15-brønns μ-Presentasjoner belagt med 10 ul av Matrigel som ble tillatt å stivne ved 37 ° C. For å evaluere effekten av α-solanin, ble PANC-1-celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av α-solanin i 24 timer, deretter det kondisjonerte medium ble samlet. HUVEC ble satt inn i μ-Slide brønn og inkubert med kondisjonert medium fra PANC-1-celler i 6 timer. Den generasjonen av mobilnettverk ble fotografert og kvantitativt evaluert av Image Pro Plus.
5. Kvantitativ Real-time Polymerase Chain Reaction
Total RNA ble ekstrahert fra PANC-en med TRIzol Reagens (Ambion, Carlsbad, California, USA) etter produsentens anvisninger. Total RNA (1 pg) av hver prøve ble underkastet oligo-dT-primet RT med ReverTra Ace qPCR RT kit (Toyobo, Osaka, Japan). Realtime polymerase kjedereaksjon (PCR) ble utført for en kvantitativ analyse av MMP-2, MMP-9, VEGF, EMMPRIN, E-cadherin og CD44 mRNA-ekspresjon ved hjelp av SYBR grønn real-time PCR Master Mix (Toyobo) på en 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). PCR-betingelsene var som følger: 95 ° C i 1 minutt, 40 sykluser ved 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 60 sek. Primersekvensene for GAPDH, MMP-2, MMP-9, VEGF, ENOS, EMMPRIN, E-cadherin og CD44 ble syntetisert fra Invitrogen og oppført i tabell 1. Analyse av kvantitativ realtime PCR-data ble utført på ΔCt verdier.
6. Protein Extraction og Western Blot analyse
Panc-1 cellene ble lysert i Radioimmun nedbør assay (RIPA) buffer som inneholder protease og fosfatase inhibitor (Roche, Basel, Sveits). Atom og cytoplasmatiske proteiner ble ekstrahert med atom og cytoplasmatiske Utvinning reagenser (Beyotime, Jiangsu, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner. Proteiner ble fraksjonert ved hjelp av natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-geler elektroforese og overført til PVDF-membran (Solarbio). Membraner blokkert med 5% fettfri tørrmelk ble inkubert med relevante antistoff over natten ved 4 ° C. Deretter ble membranene vasket tre ganger med TBST og inkubert med sekundære antistoffer i 1 time ved romtemperatur. Etter vask tre ganger med TBST, ble målet band oppdaget ved hjelp av ECL (Advansta, Menlo Park, California, USA) og eksponert på en film. Tettheten av proteinbånd ble målt ved Kvantum One.
7. Analyse av MMP-2 og MMP-9 Aktiviteter ved Gelatin Zymografi
Aktivitetene MMP-2 og MMP-9 ble analysert av gelatin zymografi. PANC-1-celler ble inkubert med serumfritt medium med forskjellige konsentrasjoner av α-solanin i 24 timer. Det kondisjonerte medium ble deretter samlet og konsentrert. Hver prøve (20 ug) ble blandet med ladningsbuffer og underkastes i 10% SDS-polyakrylamid-gel inneholdende 0,1% gelatin. Elektroforese ble utført ved 100 V i 1,5 timer ved 4. Gelene ble deretter vasket med vaskebuffer (2,5% Triton X-100, 50 mmol /liter Tris HCI, 5 mmol /l CaCl
2, pH 7. 6), fulgt av inkubering ved 37 ° C i reaksjonsbuffer (50 mmol /liter Tris – HCl, 5 mmol /CaCl2, 0. 02% Brij-35, pH 7,6). Etter 42 timer ble gelene farget med Comassie blue (0,05% Comassie blue, 30% metanol, 10% eddiksyre) i 3 timer og avfarget med avfarging-løsning (20% metanol, 10% eddiksyre, 70% ddH2O) inntil klare bånd ble visualisert.
8. Dyr og Svulster
athymic (nu /nu) hann nakne mus ble oppnådd fra Shanghai Lab. Animal Research Center (Shanghai, Kina) og plassert under standard laboratorieforhold (pathogenfree forhold med en 12 timers lys /12 timer mørke tidsplan). For å produsere tumor dyr, 5 x 10
6 PANC-1-celler ble subkutant injisert inn i flankene av fire uker gamle atymiske nu /nu hannmus. Når tumorene var målbar, ble musene delt i to grupper (6 /gruppe) i tilfeldig rekkefølge. Dyr omsorg og eksperimenter ble utført i samsvar med godkjent protokoll fra Animal Experimental Etisk Inspeksjon av Forsøksdyr Centre, Wenzhou Medical College.
9. Behandling Fremgangsmåte og tumorxenografter Study
kontrollgruppen, i hvilke 1 ul /g (vekt av mus) DMSO ble injisert inn i bukhulen hos hver mus; den solanin gruppe, hvori en ul /g (vekt av mus) solanin ble injisert på samme måte. Konsentrasjonen av solanin er 5 ug /ul. Solanin hadde en bemerkelsesverdig sikkerhet ved en dose på 5 pg /g (vekt av mus), og det var ingen kliniske og histologiske forskjeller mellom behandlings- og kontrollgruppene [25]. Hver gruppe ble behandlet med medikamentet en gang per dag i to uker. Kroppsvekt hos mus og deres tumorstørrelsene ble målt hver dag. Mus ble avlivet 2 uker etter legemiddeladministrering, og tumorene ble forsiktig fraskilt og veiet. Tumorvolumet ble beregnet ved formelen: 0,5236 L1 (L2)
2, hvor L1 er lengste diameter, og L2 er kort diameter. En del av tumoren ble benyttet for Western blot og lagret i 4% paraformaldehyd i immunhistokjemi, og resten ble frosset i flytende nitrogen.
10. Western Blot for MMP-2 og MMP-9 og immunhistokjemisk farging for PCNA og VEGF
tumor xenograft-proteinet ekstraksjonsmetode og behandling av prosesser er den samme som den som er nevnt ovenfor. Sammenhengende 4-mikrometer seksjoner ble kuttet fra parafin innebygd tumorvev for immunhistokjemi. Snittene ble blokkert med geit serum og immunostained etter deparaffinization og rehydrering. Seksjonene ble deretter inkubert med en 1/200-fortynning av primært antistoff mot PCNA eller VEGF for over natten ved 4 ° C, etterfulgt av inkubasjon med sekundære antistoffer i 60 minutter ved romtemperatur. Glassene ble utviklet med diaminobenzidine og kontra med hematoksylin. Utbredelsen indeks (per 400 x mikroskopisk felt) ble bestemt som antall PCNA-positive celler /totalt antall celler x 100. Den integrerte optiske tetthet (IOD) ble analysert for VEGF kvantifisering. 6 felt ble valgt tilfeldig fra hver seksjon. Snitt IOD nivåer mellom to grupper ble så sammenlignet. Bilde-Pro Plus 6.0-programvare ble benyttet for analyse.
11. Statistisk analyse
Alle analyser ble utført av SPSS17.0 programvare. Data som vises er representative bilder eller uttrykt som betyr ± SEM i hver gruppe. Forskjellen mellom grupper av celler ble analysert ved anvendelse av ANOVA, og uavhengig Prøve t test ble benyttet for analyse mellom grupper in vivo. P 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
1.. α-solanin påvirke celleviabilitet og hemmer kolonidannelse
Vi har funnet at behandling av α-solanin (3,6,9 ug /ul) i 24 timer eller 48 timer ikke endret levedyktigheten av PANC-1 , sw1990 og MIA PACA-2 celler signifikant (fig. 1a). Celleviabilitet ble betydelig redusert etter behandling av α-solanine på 12 ug /ul. Resultatene viste at cytotoksisiteten av celler av hver cellelinje ikke var forårsaket av α-solanin i 3, 6, 9 ug /ul i 24 timer og 48 timer. Vi brukte ikke-toksiske doser av α-solanin for eksperimenter in vitro.
(A) Celler av hver kreftcellelinje ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av α-solanin i 24 timer og 48 timer. (B) Bilder av forankringsuavhengig cellevekst av PANC-1 (100 × forstørrelse). (C) Kolonien tall ble kvantifisert og data ble beregnet ut fra tre uavhengige eksperimenter. Hver søyle representerer gjennomsnitt ± SEM (N = 3). ** P. 0,01, sammenlignet med kontroll
For å belyse funksjonene til α-solanine i forankringsuavhengig vekst av kreft i bukspyttkjertelen celler, benyttet vi en myk agar assay. Celler uten α-solanin behandlet dannes flere og større kolonier enn a-solanin behandlede celler (Fig. 1B, C), noe som indikerer at forankrings-uavhengig vekst av kreft i bukspyttkjertelen celler ble inhibert med α-solanin i en doseavhengig måte.
2. α-Solanin hemmer cellemigrasjon og Invasion
Sårtilheling analyse og transwell invasjon analysen ble utført for å observere effekten av α-solanine på celle maigratoin og invasjon. Resultatene viste at α-solanin trykkes migrering og invasjon av kreft i bukspyttkjertelen celler på en doseavhengig måte (fig. 2).
Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av α-solanin i 24 timer. (A) Cellene ble fotografert (100 x forstørrelse). (B) Den sårområdet ble kvantifisert i fire felt i hver behandling og data ble beregnet ut fra tre uavhengige eksperimenter. (C) Cellene ble fotografert (100 x maginfication). (D) De invaderte celler ble kvantifisert ved å telle fo DAPI-farget celler. Hver søyle representerer gjennomsnitt ± SEM (N = 3) * p. 0,05, ** p 0,01, sammenlignet med kontroll
3.. α-Solanin hemmet Tube Dannelse av PANC-1 Induced egenkapitalbevis og ekspresjon av VEGF
Vi fant at betinget media av PANC-1 celler indusert tube dannelsen av HUVEC, mens kondisjonert medium fra PANC-en behandlet av α-Solanin trykt rør dannelse av HUVEC i en doseavhengig måte (fig. 3A, 3B). VEGF, som en angiogen faktor, fremmer angiogenese. Våre resultater viste også at α-Solanin (3, 6 og 9 ug /ul) ble redusert markant mRNA og protein ekspresjon av VEGF i PANC-1-celler på en doseavhengig måte (fig. 3C, 3D og 3E). Data viste at α-Solanin inhiberer angiogenese i ved tilbakeholdende VEGF-ekspresjon.
(A) Representative mikrofotografier (100 x) av røret etter behandling av kondisjonert medium i 6 timer. HUVECS ble utsådd på Matrigel -precoated brønner og dyrket i kondisjonert medium fra PANC-1-celler behandlet med i 24 timer. (B) tube lengder ble målt av Image-ProPlus 6.0. (C) Et mRNA-ekspresjon av VEGF ble presentert som gjennomsnitt ± S.E.M. av tre uavhengige eksperimenter. (D) Western blot analyse av ekspresjonen av VEGF. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. (E) Kvantifisering av western blot resultat ble utført ved å beregne forholdet mellom verdien til kontrollgruppen. * P 0,05, ** p. 0,01, sammenlignet med kontroll
4. α-Solanin Utøver Expression of metastaser Associated Molecule
Uttrykk av gener assosiert med kreft progresjon og metastasering ble utført av kvantitativ real time PCR (fig. 4A). Aktivering av MMP er et viktig skritt for ECM degradering, som induserer celle invasjon. Resultatene viste at α-Solanin trykkes mRNA ekspresjon av MMP-2, MMP-9, ENOS, EMMPRIN og CD44 på en doseavhengig måte. Protein ekspresjon av MMP-2 og MMP-9 ble også undertrykkes på en doseavhengig måte (fig. 4B, 4D). Gelatin zymografi analysen viste også at MMP-9 og MMP-2 aktiviteter ble markert redusert med 6 og 9 ug /ul α-Solanin (fig. 4E, 4F). Videre α-Solanin uregulert ekspresjon av E-cadherin (fig. 4C, 4D), som kan øke adhesjonen mellom cellene. Således kunne α-Solanin hemme metastase ved å påvirke den proteolytiske aktiveringen og klebeevne.
(A) mRNA-ekspresjon av MMP-2/9, EMMPRIN, CD44, ENOS og Ecadherin ble presentert som gjennomsnitt ± S.E.M. av tre uavhengige eksperimenter. (B) Et uttrykk for MMP-2 og MMP-9-protein ble analysert ved hjelp av Western blot. (C) Et uttrykk for Ecadherin protein ble utført ved Western blot. (D) Kvantifisering av Western blot resultatene ble utført ved å beregne forholdet mellom verdien til kontrollgruppen. (E) aktiviteten til MMP-2 og MMP-9 ble analysert ved Gelatin Zymografi. (F) Kvantifisering av gelatinen zymografi resultatene ble utført ved å beregne forholdet mellom verdien til kontrollgruppen. * P 0,05, ** p 0,01, sammenlignet med kontrollen. GAPDH ble brukt som en lasting kontroll.
5. α-Solanin regulert Associated Melde Proteiner
Forskning indikerer at Wnt /β-catenin blir Akt /mTOR og JAK /STAT pathways involvert i uttrykket av MMP og indusere metastasering. α-Solanin indusert ekspresjon av fosforylering av β-catenin og inhiberte fosforylering av STAT3 i en dose- og tidsavhengig måte (fig. 5). Dataene viste også at α-Solanin redusert fosforylering av Akt og mTOR i en dose- og tidsavhengig måte (fig. 6). I tillegg α-Solanin nedregulert nivået av β-catenin og TCF-1 i kjernen (fig. 7). Dermed kunne α-Solanin undertrykke celle invasjon og MMP-2/9 uttrykk dels gjennom å hemme Wnt /β-catenin, Akt /mTOR og JAK /STAT trasé.
PANC-1 celler ble behandlet med ulike doser av α-solanin i 24 timer, eller 9 ug /ul av α-solanin for 6,12,18,24 timer. Fosforyleringen nivået av β-catenin (A, B), Stat3 (C, D) ble bestemt ved Western blot. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. (E, F, G, H) Kvantifisering av Western blot resultatene ble utført ved å beregne forholdet mellom verdien til kontrollgruppen. * P 0,05, ** p. 0,01, sammenlignet med kontrollen
PANC-1-cellene ble behandlet med forskjellige doser av α-solanin i 24 timer, eller 9 ug /ul av α- solanine for 6,12,18,24 h. (A, C) Fosforyleringen nivået av Akt og mTOR ble bestemt ved Western blot. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. (B, D) Kvantifisering av Western blot resultatene ble utført ved å beregne forholdet mellom verdien til kontrollgruppen. * P 0,05, ** p. 0,01, sammenlignet med kontrollen
PANC-1-cellene ble behandlet med forskjellige doser av α-solanin i 24 timer. (A, C) Nivået av NF-kB /p65, β-catenin og TCF-1 i kjernen ble bestemt ved Western blot. Laminb1 ble brukt som en kjernefysisk protein lasting kontroll. (B, D) Kvantifisering av de densitometriske resultatene ble utført ved å beregne forholdet mellom verdien til kontrollgruppen. * P 0,05, ** p. 0,01, sammenlignet med kontroll
6. α-Solanin redusert ekspresjon av NF-kB /p65 i Nucleus av PANC-1-celler
relative atom nivået av NF-kB /p65 i PANC-1-celler ble bestemt ved hjelp av Western blot-analyse. Vi har funnet at behandling med α-Solanin vesentlig decreasd ekspresjonen av NF-kB /p65 i PANC-1-celler (fig. 7A, 7B). Konstitutiv aktivering av NF-kB kan fremme celleproliferasjon, inhibere celle apoptose, og regulere ekspresjonen av gener assosiert med angiogenese. Således α-Solanin kunne forbedre inhiberingen av cellevekst og proliferasjon og markedsbukspyttkjertelkreft celle apoptose ved å inhibere ekspresjonen av NF-kB.
7. a-solanine undertrykker in vivo Vekst av kreft i bukspyttkjertelen Cell PANC-1 tumorxenotransplantater
Administrasjon av solanine til hårløse mus hemmet xenograft vekst av PANC-en svulst (fig. 8). På slutten av 14 dager av studien i PANC-en xenograft, redusert solanine tumor volum /mus fra 701.97 ± 157,86 mm
3 i kontrollgruppen til 273.54 ± 57,27 mm
3, tilsvarende en 61% (P 0,05, sammenlignet med kontroll
8. α-Solanin undertrykker metastaser, celleproliferasjon og Angiogenese i xenografter Modell
MMP-2 og MMP-9 spiller sentrale roller i prosessen med metastasering blant MMP. Vi undersøkte pankreatisk tumor xenograft ved Western blot og funnet α-Solanin i betydelig grad kan redusere ekspresjonen av MMP-2 og MMP-9 (fig. 9A, 9B). Spredning og angiogenese er de to som benyttes mye biomarkører, som har vært ansatt for å måle aggressivitet av solide tumorer. Derfor tumorer ble analysert for anti-proliferasjon og anti-angiogenese av α-Solanin av PCNA og VEGF-farging ved immunohistokjemiske metoder. Den PCNA farging og VEGF farging av tumorer viste dårlig immunreaktivitet i solanin-behandlede gruppe sammenlignet med kontrollgruppen (fig. 9B, 9C). Kvantifiseringen viste 78 ± 4% PCNA-positive celler i kontrollgruppen sammenlignet med 29 ± 3% i solanin-behandlede gruppen og står for 63% reduksjon (p 0,01), og den gjennomsnittlige IOD av VEGF-farging utføres 70% reduksjon (p 0,01) i solanine behandlede gruppen sammenlignet med kontrollgruppen. Denne studien bekreftet in vivo antitumor mekanisme av solanine effekt mot PANC-en tumorvekst.
Når tumorxenotransplantater ble skilt, deler av tumor ble brukt for Western blot og Immunohistochemistry. (A) Et uttrykk for MMP-2 og MMP-9-proteinet ble analyzede ved Western blot. (B, C) Tumor Tissus ble innunohistochemically analysert for PCNA-positive celler og VEGF farging tetthet. Representative fotografier av IHC farging av PCNA og VEGF er vist 400 × forstørrelser. Skala: 50 mikrometer. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SE. * P 0,05, ** p. 0,01, sammenlignet med kontroll
Diskusjoner
α-Solanin er en slags steroide alkaloider som produseres av planter av sloanaceae familien . Høy konsentrasjon av α-Solanin kan generere cytotoksiske effekter som induserer hurtig skade av plasma membran forårsaker dødelig lidelse av metabolisme [26]. Flere studier viser at α-Solanin inhiberer pre-implantation embryo utvikling [27], [28], normale humane leverceller [22]. Dessuten har α-Solanin blitt vist å redusere cytokin og nitrogenoksid produksjoner i Con A-indusert Jurkat-celler og LPS-stimulerte makrofager Rå [24], hemme tumor nekrose faktor-α (TNF-α) og interleukin (IL) -6 i mus peritoneal makrofager på grunn av undertrykkelse av p38, JNK og ERK1 /2 [29]. Nylige studier har vist at α-Solanin utfører anti-tumor effekt, slik som tilbakehold proliferasjon av cancercellelinjer og indusering av apoptose og reduksjon av mutasjon av p53 av magecancercellelinjer [22], [23], [30]. I den foreliggende undersøkelse har vi brukt ikke-toksisk konsentrasjon av α-Solanin (3, 6 og 9 ug /ul) og fant at α-Solanin hemmer metastasering in vitro, slik som invasjon, migrering og angiogenese, noe som indikerer at den inhiberende effekt av α-Solanin på metastaser var ikke ved sin cytotoksiske funksjon. Vi først evaluert effekten av α-Solanin in vivo og fant α-Solanin kan hemme spredning, angiogenese og metastase i tumor xenograft i atymiske nakne mus.
Kreft metastasering er en mangefasettert prosess som genetisk ustabile kreftceller utvikle tilpasning og ecesis til en vev mikromiljø som er fjernt fra den primære svulsten [31], som innebærer tap av mobilnettet vedheft, økt migrasjon og invasjon, sirkulasjon gjennom de vaskulære /lymfesystemet og spiring av koloni svulster i fjerne områder [32], [33] . Nedbrytning av ECM og BM av proteolytiske enzymer og etter invasjonen er uunnværlig for metastasering [34]. MMP er viktige proteolytiske enzymer som bryter ned ECM og BM. Blant dem, er MMP-2 og MMP-9 sterkt uttrykt i bukspyttkjertelkreft [35]. Inhibering av bukspyttkjertelkreft cellemetastase mediert av downregulating ekspresjon av MMP-2 og MMP-9 [36], [37]. EMMPRIN, stimulerende peritumoral fibroblaster å produsere MMP, utført med særlig høyt uttrykk i bukspyttkjertelkreft celle [38]. Kreft i bukspyttkjertelen celle invasjon og metastasering kan bli undertrykt gjennom anti-EMMPRIN terapi [39]. CD44, et trans glykoprotein med bindende domener for hyaluronsyre som er viktig del av ECM, er sterkt uttrykt i bukspyttkjertelkreft [40].
