Abstract
Utviklingen av motstand til konvensjonelle kreft narkotika kompromitterer effekten av kreft behandlinger. I tilfellet med DNA-rettet mot kjemoterapeutiske midler, kan kreftceller vise toleranse til de medikament-induserte DNA-lesjoner og /eller forbedrede DNA-reparasjon. Men rollen som DNA skade respons (DDR) og DNA-reparasjon i denne chemoresistance har ennå ikke definert. Å gi innsikt i dette utfordrende område, analyserte vi DNA reparasjon signaturen til syv kreftcellelinjer behandles av 5 cytotoksiske medikamenter ved hjelp av en nyutviklet multiplekset funksjonelle DNA reparasjon analysen. Denne omfattende tilnærming anses kompleksiteten og redundans av de ulike DNA-reparasjon veier. Data ble analysert ved bruk av clustering metoder og statistiske tester. Dette DNA reparasjons profilering Fremgangsmåte som angitt relevante grupper basert på likheter mellom ulike medikamenter, og dermed gi informasjon relatert til deres dominerende virkningsmekanisme på DNA-nivå. Tilsvarende likheter mellom forskjellige cellelinjer antagelig identifisert identisk funksjonell DDR til tross for et høyt nivå av genetisk heterogenitet mellom cellelinjer. Vår strategi har kaste nytt lys over bidraget fra bestemte reparasjonsunder veier til legemiddelindusert cytotoksisitet. Selv om ytterligere molekylære karakteristikker er nødvendig for å fullt avdekke mekanismene bak våre funn, vår tilnærming viste seg å være svært lovende å avhøre kompleksiteten i DNA-reparasjon respons. Faktisk kan det brukes til å forutsi effekten av et gitt legemiddel og kjemosensitivitet av den enkelte pasient, og dermed til å velge riktig behandling for individualisert kreftomsorg
Citation. Stier A, Sarrazy F, Caillat S, Vandenbrouck Y, Sauvaigo S (2012) Funksjonell DNA Repair underskrift Kreftcellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP utsatt for et sett med cytotoksisk Drugs Ved hjelp av en multiplekset Enzymatisk Repair analysen på biochip. PLoS ONE 7 (12): e51754. doi: 10,1371 /journal.pone.0051754
Redaktør: Abdelilah Aboussekhra, King Faisal Specialist Hospital Research Center, Saudi-Arabia
mottatt: 24 juli 2012; Godkjent: 05.11.2012; Publisert: Per 31. desember 2012 |
Copyright: © 2012 Stier et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne takke transversale CEA program Technologies for Health for støtte samt GRAVIT for sin økonomiske akkompagnement. Dette arbeidet ble også delvis støttet av Europakommisjonen (Contract LSHB-CT-2006-037575) – prosjektet «Comet assay og cellegruppe for rask og effektiv gentoksisitet testing «(TEGNESERIER). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
til tross for aktiv forskning og utvikling av mål-spesifikk behandling, motstand mot vanlige cytotoksiske legemidler representerer fortsatt en utfordring i kreftbehandling. Mange konvensjonelle anticancermedikamenter slik som alkyleringsmidler, antimetabolitter og topoisomerase-inhibitorer indusere DNA-lesjoner som en del av deres cytotoksiske effekt. En viktig faktor som påvirker den cytotoksiske effekten av disse stoffene er evnen av tumorceller for å avføle en rekke DNA-lesjoner, og fremkalle en koordinert respons inkludert aktivering av transkripsjon, cellesyklus-stans, apoptose og DNA-reparasjonsprosesser [1], [2] . Denne globale DNA-skade respons (DDR) kan føre til toleranse til de medikament-induserte DNA-lesjoner eller for forbedret reparasjon [3], [4], og hindrer en perfekt resultat for pasienter etter kjemoterapi. Den avgjørende betydning av de DDR er demonstrert ved tilstedeværelsen av mutasjoner i p53, K-RAS, PIK3CA veier assosiert med resistens overfor behandling [5], [6]. DNA reparasjonsmekanismer er en viktig del av DDR, som representerer et sett av svært organiserte trasé som har utviklet for å håndtere ulike typer DNA-skader [7] – [9]. Reparasjon av base /sukker modifikasjoner – med unntak av trådbrudd – er basert på fjerning /syntese mekanismer. Base excision reparasjon (BER) kan håndtere små ødelagte baser og abasic områder [10], mens nucleotide excision reparasjon (NER) håndterer helix-forvrenge lesjoner [11]. Nylig har nukleotid innsnitt reparasjon (NIR) blitt beskrevet som et alternativ til både BER og NER [12]. Noen proteiner har overlappende funksjoner innen og mellom BER og NER trasé [13] og proteiner tilskrevet en reaksjonsvei kan samhandle med proteiner fra de andre reaksjonsveier [14] – [16]. Endelig interstrand kryssbindinger (ICLs) er reparert gjennom flere mekanismer, enten rekombinasjon avhengig eller rekombinasjon uavhengig, med mulig samarbeid med proteiner fra NER og mismatch reparasjon (MMR) trasé [17], [18].
Proteiner som tilhører disse DNA-reparasjonsbaner og til DNA-skade signal /transducere klasser har blitt identifisert som potensielle terapeutiske mål [19], [20]. Tumorspesifikke defekter i DDR faktorer, slik som BRCA1 /BRCA2, p53, ATM, er nå utnyttes for å utvikle nye spesifikke terapier [19]. Tatt i betraktning den rolle DDR og de forskjellige DNA-reparasjons baner i motstand, er viktig for en bedre forståelse av mekanismene som utløses av direkte eller indirekte DNA-målretting kjemoterapeutiske medikamenter som det vil bidra til å forutsi effekten av medikamentene, samt kjemosensitivitet av individuelle pasienter.
cellelinjer avledet fra humane tumorer representerer eksperimentelle modeller av kreftformer som tillater determinanter av kjemosensitivitet som skal undersøkes [21], [22]. Nylig, genekspresjon profilering og andre arraybaserte tilnærminger identifisert bestemte mønstre forbundet med kjemoterapeutisk følsomhet [23], [24]. Disse globale strategier avslørte også noen aspekter av mekanismene for narkotika handling [25]. Under klassifisere kreftformer i henhold til disse nye storstilt data er nå et sterkt voksende konsept som øker håpet om å finne mer egnede medikamenter for skreddersydde behandlinger [26].
En stor begrensning som har hindret forståelsen av rollen av DNA-reparasjonsmekanismer er kompleksiteten av DNA-reparasjonsbaner. Inntil nå har forsøk på å bestemme rollen til DNA-reparasjon undersøkt en reparasjon protein ved et tidspunkt [27], [28] som fortsatt er av begrenset kraft. Det er nå klart, som det fremgår av Sander og Van Houten [29], må det DNA-reparasjon inngå i nettverket biologi og protein interactome alder. Faktisk er reparasjonsresponsen regulert gjennom adaptive og koordinerte mekanismer, inkludert protein posttranslasjonelle modifikasjoner og trans [30], [31]. Derfor synes en omfattende funksjonell tilnærming mer passende enn transcriptomic eller genomiske tilnærminger for analyse av effektive DNA-reparasjon effektivitet som svar på cellegifter.
I denne studien har vi brukt en bestemt multiplekset enzymatisk DNA reparasjon analysen på biochip å samtidig undersøke flere reparere veier. Relevansen og fordeler av dette konseptet har blitt vist i aldring studier og i en undersøkelse av konsekvensene av sol photoexposure med humane hud celleprøver [32] – [34]. Vi vurderte de DNA-reparasjon signaturer av et panel av 7 kreft cellelinjer avledet fra 4 tumortyper, behandlet med 5 cytotoksiske kreft narkotika. Spesielt eksisjon /syntese reparasjonsvirksomhet som tilhører BER, NER, NIR, og dels ICLs reparasjon ble kvantifisert. En streng strategi tillatt oss å presentere en ny effektiv måte å klassifisere modell kreft celle svar på cellegifter. Det ga nye indikasjoner på virkningsmekanismen av cytotoksiske medikamenter, på evnen til cellelinjer til å reagere og om mulig involvering av spesifikke reparasjonsvirksomhet i chemoresistance. Vår opprinnelige tilnærming er en interessant funksjonelt supplement til molekylære farmakologiske strategier for å forstå DDR og kan vise seg å være svært effektive som en del av å velge riktig behandling for optimal behandling av kreftpasienter.
Materialer og metoder
cellekultur
Seven kreftcelle linjer representerer ulike kreftformer ble valgt og levert av Oncodesign (Frankrike). HCC-1937 og MCF-7 (bryst kreft cellelinje), OVCAR-8 /ADR (eggstokk-kreft cellelinje, først feilidentifisert som MCF-7 /ADR [35] (Oncodesign)), HCT-15 og HCT-116 (colon kreftcelle linjer), RPMI 8226 (myelom), T24 (blærekreft cellelinje). Alle cellelinjene ble dyrket i RPMI-1640 inneholdende 2 mM L-glutamin og supplert med 10% føtalt kalveserum (Lonza) ved 37 ° C i en CO
2 inkubator (5%). Cellekultur, ble celle behandlinger og toksisitetsstudier utført av Oncodesign.
kjemosensitivitet analysen
Følsomhet for cellelinjer til 5 kreft narkotika (cisplatin (CDDP (Sigma), oxaliplatin (OHP (Eloxatine®, DebioPharm)), adriamycin (ADR (doxorubicin, Sanofi Aventis)), 5-fluor-uracile (5-FU (Sigma)), og karmustin (BCNU (Sigma)) ble vurdert ved MTS (3- (4,5-dimetyltiazol -2-yl) -5- (3-karboksymetoksy fenyl) -2- (4-sulfofenyl) -2H-tetrazolium), Promega) assay. absorbansen ble målt ved 490 nm ved anvendelse av en Victor 3 ™ 1420 multi-merket teller ( Wallac, PerkinElmer) (Se Metoder S1).
de virkningsmekanismer av narkotika er indisert som tilleggsinformasjon, ble Tabell S1. Den medikamentkonsentrasjon fører til 20% dødelighet beregnet (IC20) og er gitt i.
behandlinger og fremstilling av cellekjerneekstrakter
hver cellelinje, sådd ut i en 75 cm
2-kolbe (Nunc) ble behandlet ved IC20 med hver av de 5 prøvestoffer. En styrings kolbe for hver cellelinje ble også fremstilt i parallell. Etter 48 timer behandlinger ble cellene trypsinisert, telles og pelletert ved sentrifugering ved 550 g i 10 min. Pelletene ble suspendert i RPMI-1640 medium suppleres med 10% FCS og 10% DMSO og frosset ved -80 ° C til fremstilling av celleekstrakter. Om 3 10
6 celler var tilgjengelig per pellet.
Celleatom ekstrakter ble fremstilt som allerede beskrevet [32], [36]. Typisk proteininnhold var 1 mg /ml.
Modifisert plasmid microarray
Det modifiserte plasmidet microarray har blitt beskrevet andre steder [33], [36] og presenteres som saksdokumenter (Methods S1).
DNA-utskjæring /syntesereaksjonen
excision /syntesereaksjonen ble gjennomført på de modifiserte plasmidet matriser som beskrevet i [33] til en sluttproteinkonsentrasjon på 0,2 mg /ml for alle prøver (se Methods S1 for eksperimentelle forhold). Hver side omfattet 12 identiske modifiserte plasmidet matriser: 9 matriser ble brukt til reparasjonsreaksjoner som utføres med cancercellelinje ekstrakter og tre for kontrollreaksjoner ble utført med standard kommersielle HeLa-ekstrakter (HeLa_Com; CilBiotech). Hver kreftcellelinje ekstrakt ble testet i duplikat (tekniske replikater).
To uavhengige sett med reparasjon reaksjoner (kalt Set_1 og Set_2) ble utført på celle pellets innhentet uavhengig og utarbeidet flere måneder fra hverandre. Dermed ble utført analysen på data fra to uavhengige studier (to eksperimentelle replikat).
Mikromatrise skanning, fluorescens kvantifisering, data behandling og normalisering
Bilder ble ervervet ved 635 nm bølgelengde på 10 mikrometer oppløsning ved hjelp av en GenePix 4200A skanner (Axon Instrument). Total sted fluorescens intensitet (FI) ble bestemt ved hjelp av GenePix Pro 5.1 software (Axon Instrument). Innenfor hvert sett av reaksjoner, ble like data samlet inn fra kreftcellelinje eksperimentene normalisert ved hjelp NormalizeIt programvare [36]. Deretter, for hver testprøve, bestemt vi en intensitetsverdi for de 6 modifiserte plasmider som svarer til summen av intensitetene av A, B og C fortynninger fra hvilken verdien for CTRL ble subtrahert. Denne verdien tilsvarer intensiteten av den umodifiserte kontroll plasmidet multiplisert med 3, for konsistens med hensyn til summen av tre plasmid fortynning intensiteter. Derfor hver prøve ble preget av 6 verdier, tilsvarende reparasjon av de 6 DNA lesjoner representert i biochip.
Som de to separate forsøk (Set_1 og Set_2) ble utført på ulike plasmid microarray grupper på forskjellige dager måtte vi korrigere for inter-apparatet og inter dag fluorescens variasjoner tilskrives dels endringer i ozonnivå [37]. Strategien brukes for data behandling og normalisering er gitt som saksdokumenter (eksperimentelt arbeid Flow fig. S1).
Data uttrykk
Effekt av behandling på de ulike enzymatisk DNA reparasjonsvirksomhet ble undersøkt gjennom beregning av forholdet mellom FI oppnådd for hver lesjon og hver behandling tilstand, mellom behandlede (T) og ikke-behandlede (NT) prøver. Forhold ble forvandlet til log2, slik at stimulert og hemmet reparasjon med hensyn til ikke-behandlede celler ble sentrert på null og utstilt verdier av motsatt fortegn. Disse verdiene er rapportert som log2 (T /NT). Merk at i Set_2, 4 behandlede cellelinjer (RPMI8226_5-FU, HCT-116_ADR, HCT-116_BCNU og MCF7_OHP) present reparasjon intensiteter ikke signifikant over bakgrunnen. De tilsvarende log2 forhold ble satt til minimum av hele datasettet (minus 1)
Analyse av data -. Clustering metoder – Resultater skjerm
Unsupervised hierarkisk clustering ble brukt til å utforske strukturen i datasettet, for å beskrive og visualisere forholdet mellom de forskjellige behandlingene og de forskjellige cellelinjer. Analysen ble utført ved hjelp av fri programvare miljø for statistisk databehandling og grafikk, R (https://r-project.org/). Den hierarkiske gjennomsnittlig kobling clustering algoritmen ble kjørt med to forskjellige ulikhet tiltak (1) Euklids avstand, som samler profiler med både lignende intensitetsnivåer og samvariasjon, (2) korrelasjonen ulikheten tiltaket (1 – r), der r angir Pearson korrelasjon koeffisient, som samler profiler med tilsvarende samvariasjon uavhengig av deres intensitetsnivåer. Dermed to komplementære klassifikasjoner ble oppnådd som utforske dataene annerledes, en vurderer både co-regulering av reparasjons stier og intensitetsnivået og den andre vurderer bare co-regulering av reparasjons trasé uavhengig av intensitetsnivå (Se Metoder S1).
Undersøkelse av forholdet mellom DNA Repair Response (DNA-Rep-Res) og kjemosensitivitet
for å utforske sammenhengen mellom IC20 oppnådd for hvert medikament og DNA-Rep-Res, utførte vi unsupervised hierarkisk clustering hjelp Euklids ulikhet tiltaket og gjennomsnittlig kobling tettbebyggelse metode. IC20 ble valgt som, på dette mild grad av toksisitet, blir cellene forventes å være i stand til å indusere en spesifikk DDR, gir stoff-spesifikke eksponering signaturer. Den midlere log2 (T /NT) FI av de 2 sett med eksperimenter for hver lesjon-behandlingskrets ble plottet mot log10 (IC20) av den tilsvarende behandling. Verdier langs hver akse ble standardisert innenfor hver cellelinje serie (gjennomsnitt = 0 og standardavvik = 1). Det optimale antallet av klynger ble bestemt ved å kutte klynge dendrogrammer ved agglomerering av kriteriene inflexion punkt (fig. S2). Partisjonene av behandlings lesjoner som oppnås for hver cellelinje som en funksjon av IC20 kunne lett visualisert på todimensjonale fargede diagrammer.
Statistiske tester for å vurdere graden av likhet
Vi brukte » pvclust «R pakke for å vurdere usikkerheten i hierarkisk klyngeanalyse (https://www.is.titech.ac.jp/~shimo/prog/pvclust/). Klynger med AU
P
verdi 95% ble betraktet som signifikant (Se Metoder S1 for detaljer)
Resultater
Følsomhet for cellelinjer til kreft narkotika: klassifisering etter IC20. (fig. 1)
Vi ønsket å indusere DNA-skade uten å indusere overdreven apoptose eller nekrose i de 7 cellelinjer som ble testet, som apoptotiske og nekrotiske celler inneholder høye nivåer av nukleaser. Disse nukleaser ville forstyrre nedstrøms analyse. IC50 er vanligvis brukes i farmasøytiske studier for å teste forbindelser og deres toksisitet overfor celler, men vi foretrukket å anvende et mildere grad av toksisitet, IC20, for derved å utløse en respons fra cellene uten å indusere overdreven celledød. De 7 cellelinjer og de 5 behandlinger ble gruppert i henhold til log10 (IC20) under anvendelse av den euklidiske ulikheten tiltaket. I den første dimensjonen, ble cellelinjer gruppert ved likheten av deres log10 (IC20) profil på tvers av de 5 behandlinger. I den andre dimensjon, ble behandlingene gruppert ved likheten av deres log10 (IC20) profil på tvers av de 7 cellelinjer. I fargekodet grid, har cellelinjer og behandlinger blitt oppført i to dimensjoner, og hver grid blokk viser log10 (IC20) verdi for hver cellelinje og behandling. Lysstyrke på farge er korrelert med log10 (IC20), med rød for høyere IC20 og grønt for lavere IC20 (Fig. 1a). Cellelinjer ble separert i to grupper representert av de to store dendrogram grener: MCF7 og OVCAR-8 /ADR på en side med en meget lav IC20 for 5-FU og meget høye for andre behandlinger (med unntak av BCNU for OVCAR-8 /ADR og ADR for MCF7). På den annen side ble de andre cellelinjene gruppert sammen, med en høyere IC20 for BCNU enn for de andre behandlinger, som alle hadde en mellomliggende IC20. Inne i denne klyngen, HCT-116 var betydelig nærmere HCT-15, og viser en lignende følsomhet av de to tykktarmskreftcellelinjer for de forskjellige behandlinger (Fig. 1B). Behandlingene kan være delt inn i 3 grupper: på den ene side, ble CDDP, ADR og OHP gruppert sammen, med IC20 for MCF7 og OVCAR-8 /ADR høyere enn for de andre cellelinjer. 5-FU var imot denne gruppen, med IC20 for MCF7 og OVCAR-8 /ADR mye lavere enn for de andre cellelinjer. Til slutt, BCNU ble klassifisert separat, med en mye høyere IC20 for hver cellelinje, bortsett OVCAR-8 /ADR (Fig. 1C).
basert på den log10 (IC20), clustering brukte euklidske ulikheten tiltaket. A. Heat kartvisning av klyngene. Lysstyrken på fargen er korrelert med log10 (IC20), med rød farge for høyere IC20 og grønt for lavere IC20. B. Cellelinjer dendrogram med klynger betydning verdier. C. Behandlinger dendrogram med klynger betydning verdier.
P
-verdier (AU (Omtrent Saklig) i rødt og BP
P
verdier (Bootstrap sannsynlighet) i grønn rapporteres på dendrogrammer.
DNA Repair Response profilering: (fig. 2) klassifisering av cellelinjene i henhold til effekten av behandlingen på DNA-reparasjonsvirksomhet
Vi brukte hele datasettet (log2 (T /NT) verdier fra Set_1 og Set_2) til cluster DNA-Rep-Res (representert ved reparasjon av de 6 lesjoner) og få en oversikt over likheter på tvers av cellelinjer og behandlinger. Viktigere, dette også tillatt oss å vurdere samsvar mellom de to uavhengige sett med eksperimenter.
gruppering med korrelasjon ulikhet tiltaket ble anvendt for å gruppere 7 cellelinjer fra de to eksperimenter og de 5 behandlinger av lesjon type (tilsvarende reparere-veien), i to dimensjoner. i den første dimensjonen, ble cellelinjer gruppert etter likheten av deres DNA-Rep-Res samvariasjon over 5 behandlinger med de seks lesjonstyper. i den andre dimensjonen, ble behandlinger forbundet med de 6 lesjonstyper gruppert etter likhet i deres samvariasjon mønster over de 7 cellelinjer fra de to forsøkene (fig . 2A). Heatmap tilbudt en omfattende oversikt over klassifiseringen der forskjellene mellom behandlingsutløst fenotyper med hensyn til identiteten til cellelinjene kan lett bli visualisert.
A. Heatmap ble konstruert ved hjelp av de transformerte log2 prosenter av fluorescensintensiteten oppnådd for reparasjon av hver lesjon mellom behandlet og ikke-behandlet cellelinjer (log2 (T /NT)). Hierarkisk clustering algoritmen med korrelasjon ulikhet tiltaket ble brukt til å gruppere i et fargekodet grid de syv cellelinjer fra de to forsøkene og de fem behandlinger av lesjon typen reparasjon, i to dimensjoner. I den første dimensjonen, ble cellelinjer gruppert ved likheten av deres DNA-reparasjonsrespons-profil kovariasjon over virkningen av de fem behandlinger av lesjon typen reparasjon. I den andre dimensjon, ble behandlinger av lesjon typen reparasjon gruppert ved likheten av deres mønster samvariasjon over de syv cellelinjer fra de to eksperimentene. For å evaluere konsistens mellom de to uavhengige forsøk, ble Set_1 og Set_2 data holdt atskilt og analysert samtidig (merket _1 og _2 henholdsvis). I fargekodet rutenett, verdier større enn 0, er skyggelagt i rødt indikerer stimulering av reparasjonsvirksomhet, mens verdier under 0 er farget i grønt indikerer en hemming av reparasjonsvirksomhet, sammenlignet med NT celler. Verdier større enn 0 ble skyggelagt i rødt indikerer stimulering av reparasjonsarbeid, mens verdier under 0 ble skyggelagt i grønt indikerer hemming av reparasjon aktivitet. Verdier rundt 0 ble farget i svart som indikerer ingen påvist effekt. Lysstyrke av fargen ble korrelert med størrelsen av effekten av behandling på de DNA-reparasjonsvirksomheten. B. dendrogram av de fem behandlinger av lesjon typen reparasjon med klynger betydning verdier. C. dendrogram av de syv cellelinjer fra de to forsøkene med klynger betydning verdier. P-verdier (AU (Omtrent Saklig)
P
verdi i rødt og BP (Bootstrap Sannsynlighets)
P
verdi i grønt) er rapportert på dendrogrammer.
Dendrogrammet av behandlingene ved lesjonstyper (fig. 2B) viste at lesjoner forble gruppert etter behandling typen, noe som indikerer at hvert legemiddel hadde en tydelig effekt på alle reparasjonsbaner samtidig. Denne analysen videre avdekket tre klasser av narkotika: en altomfattende BCNU og ADR behandling (AU p-verdi 95%) og en annen som omfatter OHP og CDDP behandling (AU p-verdi 93%). 5-FU var fra hverandre, selv om det hadde en tendens til å klynge med den andre gruppen. Videre, som et generelt trekk, når de 6 lesjonstyper ble gruppert på settet av cellelinjer ved behandling, mellom de to sett av eksperimenter det konsekvent viste seg at 8oxoG (8oxoG), alkylerte baser (AlkB) og AP områder (ABAS), alle reparert av BER, pleier å være gruppert sammen; mens Glycol og fotoprodukter (CPD-64) gruppert uavhengig. Cisplatin (CISP) dannet en gruppe alene (Fig. S3). Når hver behandling ble vurdert separat, ble denne trenden opprettholdes for BCNU og ADR behandling, om enn med noen forskjeller (Fig. 2B). Tvert imot betydelige forskjeller først etter behandling med 5-FU. Interessant, i tilfelle av CDDP og OHP behandling, CISP reparasjon veien var signifikant forskjellig.
I cellelinjene dendrogram ble cellelinjene arrangert i 3 store hovedgrupper (Fig. 2C). En separat gren inneholdt RPMI8226, en myelom-avledet hematopoetisk cellelinje som, i motsetning til alle de andre cellelinjer, ikke er avledet fra et carcinom. De to brystkreft cellelinjer, MCF7 og HCC1937, tilhørte den samme klynge, sammen med HCT-15. I denne undergruppen, de replikater for hver cellelinje ble blandet opp. De replikater av den andre tykktarmskreft cellelinje HCT-116 utgjorde en undergruppe av en klynge innehold OVCAR-8 /ADR og blærekarsinom-cellelinjen T24.
Viktigere, observerte vi at de to uavhengige replikater for hver celle linje var hovedsakelig nært knyttet, reflekterer repeterbarhet av eksperimentet, og følgelig påliteligheten av tilnærmingen. Korrelasjonen ulikhet tiltaket er avhengig bare på co-regulering og er uavhengig av enhver batch effekt mellom eksperimenter. Dette tiltaket var mer robust enn den euklidske avstand når demonstrere nær likhet mellom replikater
Virkningen av medikamentell behandling på DNA Repair trasé. Stimulering eller hemming
For å skille klasser av svar på behandlinger med hensyn til de forskjellige DNA-reparasjonsunderveier, de gjennomsnitt og standardfeil for data (log2 (T /NT) for hver reparasjon pathway) innenfor de 3 største cellelinje klynger identifiserte ble representert i samme diagram. Dette tillot lett visualisering av de 3-profiler (fig. 3). For å karakterisere hver klynge, betydelig stimulering eller hemning av de forskjellige reparasjons sub-trasé ble deretter undersøkt. For dette formål anvendes vi statistisk hypotesetester til hvert av de 2 klyngene som inneholder 3 cellelinjer. Etter hvert som data fordelingen kan være ikke-gaussisk, ble ikke-parametrisk Wilcoxon test anvendt. For hver gruppe og behandling av lesjon typen, bestemt til Wilcoxon test om medianverdien av log2 forholdet fordeling var signifikant forskjellig fra 0, fremhever stimulerende (hvis midtlinje 0) eller inhibering (hvis midtlinje 0) effekter. For den klyngen som bare inneholder en cellelinje (RPMI8226), ble stimulering eller hemning ansett som signifikant når | bety | 3 x standard feil. Resultatene er vist i tabell 1.
Verktøy og standardavvik for de tre identifiserte klasser av cellelinje svar på tvers av de fem behandlinger og de seks lesjonstyper ble beregnet ved hjelp av log2 (T /NT) data (sort linje: HCC1937, HCT-15, MCF7-, rød linje: HCT-116, OVCAR-8 /ADR, T24, grønn linje. RPMI8226)
Avhengig av arten av stoffet, den antall berørte reparere veier variert. Blant funksjonene som fremkom, observerte vi at 5-FU drastisk betydelig hemmet CPD-64, AlkB og Abas reparasjon i RPMI8226 cellelinje. CDDP, OHP og ADR alle syntes å hemme CISP reparasjon sti RPMI8226 cellelinje i forhold til de andre reparere veier undersøkt. Ved opposisjon, med OHP behandling, andre reparasjons veier av RPMI8226 (Glykol, 8oxoG og AlkB) var signifikant oppregulert. BCNU utøves en hemmende effekt på alle reparasjonsvirksomhet i [HCT-116, OVCAR-8 /ADR, T24] klynge med
P
verdi 0,1. Interessant, ADR hemmet reparasjon av 8oxoG bare innenfor denne klyngen (
P
verdi 0,1). De to platinabaserte legemidler mot kreft, CDDP og OHP, påvirket ikke reparasjonsvirksomhet i [HCT-116, OVCAR-8 /ADR, T24] cluster bortsett fra å stimulere reparasjon av AlkB og ABAS for CDDP (
P
verdi 0,1). Noen reparasjonsvirksomhet i [HCC1937, HCT-15, MCF7-] klyngen ble litt oppregulert med 5-FU behandling (signifikant for 8oxoG, Abas, CISP med
P
verdi 0,1) og tydelig nedregulert av den platinabaserte stoffer (se tabell 1 for signifikans). Omvendt, gjorde ADR og BCNU behandlinger ikke har noen innvirkning på DNA reparasjon veier av denne klyngen
Virkningen av medikamentell behandling. Analyse av respons behandling cellelinje ved behandling
Når vi fokusert uavhengig på hver behandling, ble ytterligere særegenheter uthevet. Dette bekymret, særlig de to tykktarmskreft cellelinjer HCT-15 og HCT-116 behandlet av 5-FU. Begge cellelinjer som vises stimulert DNA reparasjonsvirksomhet, uansett bane vurderes (Ensidig Wilcoxon test;
P
verdi = 0,065) (fig S4A.). En ny cellelinje klynge delt likheter når behandlet av BCNU: HCC1937, RPMI8226, og HCT-15 som reparasjon av 8oxoG og CPD-64 ble stimulert (Ensidig Wilcoxon test;
P
verdi = 0,05) ( fig. S4B).
Undersøkelse av forholdet mellom DNA Repair Response og kjemosensitivitet
de grafiske fremstillinger av log2 (T /NT) data som funksjon av log10 (IC20) tillatt menings visualisering av klyngene som representerte co-regulert under trasé for hvert medikament-indusert DNA-Rep-Res (fig. 4 A-G). For praktisk visualisering av dataene i hvert diagram, ble DNA-reparasjons sub-trasé som tilhører den samme klynge innrammet sammen. Avhengig av cellelinjen i betraktning, antall klynger varierte fra 6 til 13 timer. Innenfor hver graf, kan reparere sub-trasé i forbindelse med en behandling enten gruppert (f.eks HCT-116, fig. 4C og MCF7-, fig. 4E) eller spredt (f.eks HCC1937, Fig. 4B, HCT-15, fig. 4D) . Vi kan anta at denne siste funksjonen avslørte tydelige regler i de ulike reparasjonsunder veier i sin tur er ansvarlig for økningen av klyngen antall.
Vi rapportert, for hver cellelinje, midlene log2 (T /NT ) data (Y-akse) ufarlig for hver behandling av de 2 sett med eksperimenter som en funksjon av det tilsvarende log10 (IC20) (X-aksen). Data ble standardisert innenfor hver cellelinje serie (gjennomsnitt = 0 og standardavvik = 1). Innenfor hvert diagram ble de lesjon behandlings assosiasjoner som tilhører samme klynge innrammet sammen. De tilsvarende klynge dendrogrammer vises i Tilleggs fig. S2 (bokstavene foran lesjoner refererer til behandling: A = adriamycin; B = BCNU; C = cisplatin; F = 5-FU; O = oksaliplatin).
i betraktning dimensjonen av data, i denne artikkelen kan vi fokusere bare på åpenbare assosiasjoner, slik som lav reparasjon /lav IC20 og høy reparasjon /høy IC20, mottakelige for å reflektere en årsakssammenheng mellom reparasjon effektivitet og kjemosensitivitet. Dette utelukker ikke at andre foreninger kan være biologisk relevant.
For eksempel vises HCC1937 diagrammet en lavere reparasjon av abasic områder i respons til ADR behandling (ADR-ABAS) assosiert med en lavere IC20 sammenlignet med andre behandlinger (fig. 4B). Motsatt, ble en BCNU drevet høyere nivå reparasjon av alle lesjoner assosiert med forhøyet IC20 (Fig. 4B). HCT-116 viste en sammenheng mellom hele ADR-drevet reparasjon respons og IC20, begge er lav (fig. 4C). En annen funksjon verdt å nevne bekymret HCT-15, der lav reparasjon av CISP følgende OHP behandling var forbundet med lav IC20 (fig. 4D). I tilfellet med RPMI8226, ble den høye BCNU-drevet respons forbundet med en høy IC20 (fig. 4G).
Etter motstand, inverterte forbindelser ble også notert for eksempel for T24 hvor ADR-behandling var den mest cytotoksisk ( lav IC20) og likevel forbundet med høyest DNA-Rep-Res (fig. 4A). Viktigere, gjorde at ADR DNA-Rep-Res og lav ADR-IC20 ble omvendt assosiert ikke at de var formelt anti-korrelert og ingen hypotese kan formuleres for øyeblikket om den biologiske betydningen av en slik potensiell anti-sammenheng. Den samme observasjon ble funnet i tilfellet med MCF7 behandlet med 5-FU (fig. 4E). Til slutt, de to tykktarmskreft cellelinjer HCT-116 og HCT-15 viste en tilsvarende reaksjon på 5-FU, med heller svak toksisitet, men kan bli diskriminert av minst ADR og OHP behandlinger (fig. 4C og 4D henholdsvis).
Diskusjoner
i denne studien har vi benyttet en multiplekset funksjonell tilnærming som kvantifiserer DNA reparasjonsvirksomhet for å utforske DDR og forholdet mellom narkotikainduserte cytotoksisitet og DNA-reparasjonsunder veier. Vi brukte statistiske metoder og privilegerte visuelle representasjoner som tydelig viste våre funn.
