Abstract
Motor protein kinesin super proteiner (KIFS) er involvert i kreft progresjon. Uttømming av en av de KIFS, KIF14, kan forsinke metafase-til-anaphase overgang, noe som resulterer i en binucleated status, som forbedrer tumorprogresjon; imidlertid nøyaktig korrelasjon mellom KIF14 og progresjon av kreft forblir tvetydig. I denne studien ble ved hjelp av tap av heterozygositet og matrisen sammen genomisk hybridisering analyser, ble det observert en 30% tap i de områder som omgir KIF14 på kromosom 1q i lunge adenokarsinomer. I tillegg har proteinkinase uttrykk nivåer av KIF14 i 122 lunge adenokarsinomer også angitt at omtrent 30% av adenocarcinomer viste KIF14 ned-regulering i forhold til uttrykk i de bronkiale epitelceller av tilstøtende normale motstykker. I tillegg ble redusert ekspresjon av KIF14 mRNA eller protein korrelerer med dårlig total overlevelse (p = 0,0158 og mindre enn 0,0001, henholdsvis), og proteinnivåer ble også inverst korrelert med metastaser (P 0,0001). Overekspresjon av KIF14 i lunge adenokarcinomceller hemmet forankringsuavhengig vekst
in vitro Hotell og xenograft tumorvekst
in vivo
. Overekspresjon og stanse all KIF14 også hemmet eller forbedret kreft celle migrasjon, invasjon og adhesjon til ekstracellulære matrix proteiner laminin og kollagen IV. Videre, vi har oppdaget at adhesjonsmolekyler cadherin 11 (CDH11) og føflekkreft celleadhesjonsmolekyl (MCAM) som last på KIF14. Overekspresjon og stanse all KIF14 forsterket eller redusert rekruttering av CDH11 i membranfraksjonen, noe som tyder på at KIF14 kan fungere gjennom rekruttering adhesjonsmolekyler til cellemembranen og modulerende celle lim, trekkfugl og invasive egenskaper. Således KIF14 kan hemme tumorvekst og kreft metastase i lungene adenokarsinomer
relasjon:. Hung P-F, Hong T-M, Hsu Y-C, Chen H-Y, Chang, Y-L, Wu C-T, et al. (2013) Motoren Protein KIF14 hemmer tumorvekst og kreft metastaser i Lung Adenocarcinoma. PLoS ONE 8 (4): e61664. doi: 10,1371 /journal.pone.0061664
Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA
mottatt: 18 oktober 2012; Godkjent: 12 mars 2013; Publisert: 23 april 2013
Copyright: © 2013 Hung et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet gjennom tilskudd fra National Science Council of republikken Kina (NSC98-2628-B-002-086-My3, NSC100-2321-B-002-071, og NSC100-3112-B-006-005) og National Taiwan University (NTU101R7601-2 og NTU102R7601-2). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kinesin (Kif) består superfamilien av motor proteiner som transportorganeller, proteiner og mRNA i en adenosin-5′-trifosfat (ATP) – og mikrotubuli-avhengig måte [1], [2]. Det er mer enn 45 medlemmer av KIF super, som er delt inn i 13 underfamilier i henhold til deres orientering, domene og funksjon [3]. KIF14, et medlem av kinesin-3 familien, inneholder en motor og en gaffelhode-assosiert domene, og dette proteinet spiller en viktig rolle i cytokinese og i den segregering, congression og innretting av kromosomer [4] – [6]. Uttømming av KIF14 kan forårsake en tidsforsinkelse i metafase-til-anaphase overgang, hemmer cytokinese og produsere en binucleated status [7], [8]. Videre studier har vist at KIF14 kan fremme effektiv cytokinese gjennom samhandling med citron kinase (CIK) og protein regulator av cytokinese 1 (PRC1) [7].
cytokinese er den siste fasen av cellesyklus der to datterceller helt egen [9]. Økende bevis tyder på at avvikende cytokinese kan generere ustabile tetraploide celler, noe som fører til Aneuploidy, som etterhvert utvikler seg til karsinogenese [9] – [11]. Mange komponenter som regulerer cytokinese har blitt identifisert, og noen molekyler, inkludert KIFS, har vært klart assosiert med kreft. For eksempel har KIF2 og KIF15 blitt identifisert som tumor-antigener i brystkreft [12], [13]; KIF13A er overuttrykt i noen retinoblastomer [14]; KIF20A er oppregulert i bukspyttkjertelkreft [15]; KIF3 og KIF4 har blitt identifisert som tumor supres gener i magekreft [16], [17]; og ekspresjonen av KIF10 er redusert i leverkreft [18]. I tillegg har det blitt rapportert at enkelte KIF familiemedlemmer, inkludert KIF3, KIF4 og KIF22, ha motstridende roller i tumorigenesis [16], [17], [19] -. [23]
Lungekreft er den vanligste årsaken til kreftdød, spesielt i Asia, og står for 17% av den totale kreftdødsfall på verdensbasis [24], [25]. Nyere studier har fokusert på rollen av kinesin proteiner, slik som KIF3, KIF5B og KIF14, i kreft progresjon lunge; imidlertid er de detaljerte mekanismene bak funksjonene til disse proteinene forblir uklar [16], [26] – [28]. Derfor er målet med denne studien var å undersøke hvilken rolle kinesin motor proteiner i lunge adenokarsinom.
I denne studien har vi undersøkt hvilken rolle KIF14 i lunge adenokarsinom hjelp tap av heterozygositet (LOH) og rekke sammenlignende genomisk hybridisering (CGH) analyser av 138 lunge adenokarsinomer i kromosom 1Q, som er der KIF14 ligger. I tillegg har vi også undersøkt protein uttrykk for KIF14 i vevsprøver fra 122 lunge adenokarsinom pasienter som bruker immunhistokjemisk farging. Den KIF14 mRNA og protein uttrykk ble korrelert med total overlevelse og metastase priser hos disse pasientene. Vi har også dissekert den molekylære mekanisme av KIF14, som formidler undertrykkelse av kreft celle invasjon, migrering og adhesjon. Disse resultatene tyder på at KIF14 kan hemme tumorvekst og kreft metastase i lunge adenokarsinom.
Resultater
KIF14 Expression i lungekreftpasienter
For å evaluere potensielle rolle kinesin i lunge adenokarsinom, vi først undersøkt frekvensen av LOH i kromosomet ved hjelp av mikrosatellittmarkører, og observert at LOH skjedde mellom markørene D1S1660 (40,0% LOH og 86,7% mikro ustabilitet (MI)) og D1S213 (31,6% LOH og 60,5% MI), som er ligger i nærheten KIF14 på kromosom 1Q (figur 1A). For å bekrefte disse resultatene, har vi gjennomført høy tetthet matrise CGH i en uavhengig kohort av 138 lungekreft adenokarsinomer [29]. Dataene indikerte at nesten 25% (22,5% og 26,8%) tap av de to probene i KIF14 lokalisering og 5% (2,9% og 6,5%) forsterkning forekom hos pasientene (figur 1B og tabell 1).
(A) Tap av heterozygositet (LOH) og mikro ustabilitet (MI) analyserer nærheten av plasseringen av KIF14 i primær lunge adenokarsinom. Kromosom 1 ideogram viser mikro markører kartlagt på 1q henhold til plasseringen database; pasienten antall og prosent er indikert. (B) De kopinummer endring profiler av kromosom 1. KIF14 posisjonen angis innenfor kromosom 1q32.1. (C) Proteinet uttrykk mønster av KIF14 ble undersøkt ved hjelp av immunhistokjemi med anti-KIF14 antistoffer i normal bronkial slimhinne (venstre panel) og primær vevsprøver (midtre og høyre panel). Original forstørrelse 200 ×.
Vi neste undersøkt uttrykk for KIF14 i vevsprøver og tilstøtende normalt vev fra 122 lungekreft adenokarsinomer bruker immunhistokjemi. Spesifisiteten av den KIF14 antistoffet ble bekreftet gjennom KIF14 antigen konkurranse ved hjelp av immunblotting og immunhistokjemi (figur S1), og de kliniske karakteristika for disse pasientene er oppsummert i tabell 2. Disse resultatene viste at KIF14 ble sterkt uttrykt i normale bronkiale epitelceller (figur 1C ). Videre analyse indikerte at 30,3% av adenocarcinomer viste KIF14 ned-regulering i tumorer sammenlignet med de bronkiale epitelceller i tilstøtende normale motstykker, og at 18,0% av adenocarcinomer viste en høyere KIF14 uttrykk enn i den normale bronkiale mucosa (tabell 1). Samlet utgjør disse resultatene tyder på at KIF14 kan ha et større tap (~ 30%) enn gevinst (3-6%) i lunge adenokarsinomer.
Lav Uttrykk for KIF14 ble assosiert med dårlig Total overlevelse i lungeadenokarsinom pasienter
for ytterligere å undersøke om uttrykk for KIF14 i lunge adenokarsinom er korrelert med kliniske resultater, de mRNA nivåer av KIF14 i vevsprøver fra 53 lunge adenokarsinom pasienter ble bestemt ved bruk av sanntids kvantitativ revers transkriptase polymerase kjedereaksjon. De kliniske karakteristika for disse pasientene er oppsummert i tabell S1. Pasienter med lav KIF14 uttrykk utstilt verre total overlevelse enn de med høy KIF14 uttrykk (figur 2A, P = 0,0158). Multivariat Cox proporsjonal hazard regresjonsanalyser viste at KIF14 uttrykk (hazard ratio [HR] = 0,341, 95% konfidensintervall [CI] = 0,179 til 0,652; P = 0,0011) og sykdom stadium (HR = 1,962, 95% KI = 1,311 til 2,936 ; P = 0,0010) var uavhengige faktorer assosiert med total overlevelse av lunge adenokarsinom pasienter (tabell S2)
(A) lav KIF14 mRNA uttrykk var assosiert med dårlig total overlevelse hos pasienter med lunge adenokarsinom.. De KIF14 mRNA nivåer ble målt ved hjelp av sanntids kvantitativ RT-PCR av primære vevsprøver. Medianverdien ble brukt til å dele pasientene inn i lav (rød linje) og høye (blå linje) KIF14 uttrykk grupper (log rank, P = 0,0158). (B) Lav KIF14 protein uttrykk var assosiert med dårlig total overlevelse i en uavhengig kohort av lunge adenokarsinom pasienter. Pasientene ble delt i to grupper i samsvar med immunreaktiviteten av KIF14 antistoffer. Cut-off-verdien var 70% i tumorsnitt som viser immunoreaktiviteten til antistoffene. Kaplan-Meier-analyser ble brukt for å estimere total overlevelse i lunge adenokarsinom pasienter i henhold til KIF14 uttrykk (log rank, P 0,0001). (C) Prosent analyse av metastatiske status i høye og lave KIF14 uttrykk grupper. Pasienter i både høye og lave KIF14 uttrykk grupper ble ytterligere delt basert på tilstedeværelse av metastase; og tallene for hver undergruppe vises som en prosentandel ved hjelp av statistisk analyse (chi-kvadrat test, P 0,0001). (D) KIF14 uttrykk i menneskelig lunge adenokarsinom spådd forekomst av metastaser. Metastasefrie overlevelseskurver av 122 lunge adenokarsinom pasientene stratifisert ved lav (rød linje) og høy (blå linje) KIF14 protein uttrykk (log rank, P 0,0001)
For å utvide vår analyse til protein. uttrykk nivåer, brukte vi immunhistokjemi å undersøke uttrykk for KIF14 i vevsprøver fra 122 lunge adenokarsinom pasienter i en uavhengig kohort. I samsvar med våre tidligere resultater, pasienter med lave nivåer av KIF14 uttrykk hadde dårligere total overlevelse enn pasienter med høye nivåer av KIF14 uttrykk (P 0,0001, figur 2B). Den multivariate Cox proporsjonale hazard regresjonsanalyser viste at de uavhengige prognostiske faktorer var KIF14 uttrykk (HR = 0,37, 95% CI = 0,18 til 0,76; P = 0,0006) og sykdom stadium (HR = 5,38, 95% CI = 2,82 til 9,88; P . 0,0001) (tabell 3)
KIF14 var negativt korrelert med metastaser i lunge adenokarsinom Pasienter
Vi videre undersøkt om protein uttrykk nivåer av KIF14 i vevsprøver var negativt korrelert med kreft metastaser hos pasienter. Resultatene fra 122 lunge adenokarsinomer viste at 29 av de 63 pasienter med lav KIF14 protein uttrykk hadde kreft metastasering. Men bare seks av de 59 pasienter med høyt KIF14 uttrykk utviklet kreft metastase (figur 2C, P 0,0001). Kaplan-Meier estimat av metastase-free-overlevelse viste også at pasienter med lav KIF14 uttrykk hatt en vesentlig dårligere metastase-fri overlevelse enn de med høy KIF14 uttrykk (figur 2D, P 0,0001). Disse resultatene indikerer at KIF14 kan være tumorigent og metastatisk suppressor i lunge adenokarsinom.
Overuttrykte KIF14 i Lung adenokarcinomceller blokkeres Anchorage uavhengig vekst in vitro og Xenotransplantat tumordannelse
in vivo
Våre observasjoner støttet hypotesen om at KIF14 fungerer som en tumor suppressor i lunge adenokarsinom. For å undersøke denne hypotesen videre, må vi først vurderte endogene KIF14 protein uttrykk i lav-invasiv CL1-0 og høy-invasiv CL1-5 lunge adenokarsinom celler (Figur S2A). Vi observerte at KIF14 protein i CL1-0 cellene var høyere enn i CL1-5 celler. For å undersøke endringer i kreft progresjon
in vitro Hotell og
in vivo product: [30], vi etablert stabile Flag-taggede KIF14-uttrykke cellelinjer fra CL1-5 celler og KIF14-silenced CL1- 0-celler, og proteinet uttrykksmønster ble bekreftet ved immunblotting (figur 3A og 3B). I påvisning av celleproliferasjon sats, observerte vi ingen signifikante forskjeller mellom vektor bare kontroller og KIF14-overekspresjon cellelinjer (figur 3C), men redusert spredning ble observert i KIF14-forstummet celler sammenlignet med shLacZ kontroll (figur 3D, P 0,0001). På grunnlag av bevis som viser at forankringsuavhengig cellevekst kan være assosiert med karsinogent potensial [31], [32], vi videre undersøkt veksten av stabile cellelinjer i bløt agar. Resultatene indikerte at det antall kolonier dannet ble redusert når KIF14 ble overuttrykkes i CL1-5 celler (figur 3E), og øker når KIF14 ble stille i CL1-0 celler (figur 3F). Deretter ble de stabile cellelinjer ble subkutant transplantert inn i SCID-mus for å utforske virkningen av KIF14 på tumorvekst
in vivo
. Overekspresjon av KIF14 reduseres betraktelig tumorveksten sammenlignet med kontrollene (figur 3G, rett; p = 0,0021). De representative bilder av CL1-5 /vektor- og KIF14 # 2-inokulerte mus er vist (figur 3G, venstre).
(A) Cellelinjer konstitutivt uttrykker KIF14 ble etablert gjennom transfeksjon av pCMV-7.1- 3-3 × Flag-KIF14 inn CL1-5 celler. Enkeltkolonier ble valgt ved hjelp Geneticin, og KIF14 protein uttrykk ble vurdert gjennom immunoblotting med anti-Flag antistoffer; aktin ble benyttet som en intern kontroll. Stjernen og pilspiss indikerer uspesifikke bånd og flagg-KIF14, henholdsvis. (B) KIF14 uttrykk ble slått ned i CL1-0 celler ved hjelp shRNA lentiviral infeksjon. Etter valget med puromycin i to uker, ble KIF14 protein uttrykk mønstre vurderes gjennom immunoblotting med anti-KIF14 antistoffer; aktin ble benyttet som en intern kontroll. (C og D) Effekter av KIF14 overekspresjon og stanse på dyrkede tumorcelleformering. Celletallet ble beregnet til de angitte tider etter planting. Feilstolpene representerer standardavvik av gjennomsnittet. Ingen signifikante forskjeller ble observert i de spredningshastigheter mellom forskjellige cellelinjer ved en-veis ANOVA-analyse (C). (E og F) krings-uavhengig vekst av KIF14-overekspresjon og -silencing cellelinjer ble vurdert ved kolonidannelse i myk agar. Feilstolpene representerer standardavvikene tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. (G) KIF14 overekspresjon redusert tumorvekst. Musene ble injisert subkutant i kantene med CL1-5 /vektor og CL1-5 /KIF14 # 2 celler. Venstre panel: Avsluttende svulst bilder 35 dager etter subkutan injeksjon. Høyre panel: Gjennomsnittlig tumorvolum på 35 dager etter subkutan injeksjon ble beregnet, og dyrene ble deretter avlivet. Stolpene representerer middel ± standardavvik av seks mus per gruppe (enveis ANOVA, p = 0,0021).
Manipulering av KIF14 Expression Levels Endrede Migration, Invasion og Klebe Lung adenokarsinom cellelinjer
Fordi uttrykk for KIF14 var negativt korrelert med metastaser hos pasienter, neste undersøkte vi om KIF14 påvirket kreftcelle metastasering. En sårhelende analyse ble anvendt for å detektere migrasjon evnene til KIF14-uttrykkende celler. KIF14 uttrykk redusert migrasjon av CL1-5 celler, mens knockdown av KIF14 protein uttrykk i CL1-0 celler økt celle migrasjon (alle P 0,05, figur 4A og 4B, venstre). For å bekrefte resultatene oppnådd fra CL cellene, vi undersøkte KIF14 uttrykk nivåer i andre lunge adenokarsinom cellelinjer (figur S2B) og overexpressed KIF14 i A549 celler med lav endogen KIF14 protein og brakt til taushet KIF14 i H1299 celler med relativ høy KIF14 protein nivåer. De KIF14 proteinekspresjon og spredningsfrekvenser for disse cellene er vist i figur S3. Lignende resultater ble oppnådd ved bruk av ytterligere cellelinjer sammenlignet med CL-celler (alle P 0,05, figur 4A og 4B, til høyre).
(A) CL1-5 celler med faste KIF14 overekspresjon og A549-celler forbigående infisert med lentivirus som koder for ikke-merket full-lengde KIF14 ble analysert for cellen vandrende evne i et sårhelende analysen. Dataene viser antall trekkende celler, og P-verdier ble beregnet i forhold til vektor bare kontrollene ved hjelp av Student
t
-test. (B) sårhelende analysen av CL1-0 og H1299 celler med KIF14 lyddemping. Det antall trekk celler, ble også beregnet. (C og D) KIF14 overekspresjon redusert celle invasjon. Invasjonen evne til stabilt eller forbigående infisert KIF14 og KIF14-dempede cellelinjer, ble målt ved anvendelse av en modifisert Boyden kammere assay. Invaderende celler ble merket med propidiumjodidfarging og kvantifisert (n = 3). (E) KIF14 overekspresjon forbedret celle adhesjon. En 96-brønners plate ble belagt med laminin og collagen IV. Totalt 3 x 10
4-celler ble sådd ut på en 96-brønns plate, inkubert ved 37 ° C i 1 time og det klebende aktivitet ble beregnet ved hjelp av krystall bryte med farging. Høy absorbans ved 540 nm indikerte økt celle adhesjon.
Vi neste vurdert de invasive egenskapene til disse cellelinjene ved hjelp av modifiserte Boyden kammer analyser. KIF14 overekspresjon i CL1-5 og A549 celler redusert celle invasivitet 11,6 til 64,9% sammenlignet med vektor bare kontroller (P 0,05; Figur 4C). Omvendt, knockdown av endogent KIF14 ekspresjon i CL1-0 og H1299-celler økt celle invasivitet 1,4 til 2,3 ganger (P 0,05, figur 4D).
Generelt er celleadhesjon en kompleks mekanisme som er involvert i en rekke prosesser, inkludert cellemigrering og invasjon [33]. Fordi disse dataene viste at uttrykket av KIF14 kan påvirke trekk og invasive evner lunge adenokarsinom cellelinjer, vi videre undersøkt om celle adhesjon ble påvirket etter moduler KIF14. I samsvar med vår hypotese, dataene viste at overekspresjon av KIF14 økt adhesjon til det ekstracellulære matriksproteiner, laminin og collagen IV, i begge CL1-5 og A549-celler; dessuten stanse KIF14 redusert heft både CL1-0 og H1299 celler (Figur 4E).
KIF14 Kan Reguler Rekruttering av lim Molecule CDH11 til cellemembranen i Lung adenokarsinom cellelinjer
Fordi KIF14 hemmet celle migrasjon, invasjon og heft
in vitro Hotell og kreft metastaser
in vivo
, ønsket vi å finne ut om endringer i motorisk funksjon i cellene kan føre til fysiologiske endringer. Derfor undersøkte vi potensielt assosiert partnere KIF14 bruker String 9,0 protein interaksjon database (https://string.embl.de/) og identifisert de to kjente tilhørende proteiner, PRC1 og CIK [7], og to ekstra proteiner, cadherin 11 (CDH11) og føflekkreft celleadhesjonsmolekyl (MCAM), som ble potensielt assosiert med KIF14 (figur S4). Fordi CDH11 og MCAM er viktige adhesjonsmolekyler tilknyttet tumorigenesis og metastasering [34], [35], hypotese vi at KIF14 kan påvirke celle adhesjon og migrasjon gjennom disse laste molekyler. For å bekrefte denne hypotesen, må vi først undersøkt om KIF14 kunne assosiere med CDH11 og MCAM bruker co-immunoprecipitation. Resultatene viste at HA-merket CDH11 og MCAM forbundet med flagg-taggede KIF14 proteiner (figur 5A). Endogen immunoprecipitation bekreftet også assosiasjoner mellom KIF14 og CDH11
in vivo plakater (figur 5B). Fordelinger av KIF14 og CDH11 eller MCAM proteiner ble undersøkt i H1299 celler ved hjelp av immunfluorescens farging. Resultatene viste at CDH11 og MCAM proteiner kan co-lokalisering i felles kammer med KIF14 protein, og ekspresjonen av CDH11 og MCAM ble hovedsakelig observert i basis periferien når KIF14 ble overuttrykkes (figur 5C). Som KIF14 er en motor proteiner som deltar i transporten av molekyler, vi videre undersøkt hvorvidt ekspresjonen av KIF14 kunne regulere lokalisering av CDH11. Vi isolert membran fraksjon proteiner og analysert uttrykk for CDH11 fra KIF14-overekspresjon og KIF14-forstummet cellelinjer. Mengdene av HA-CDH11 i membranfraksjonen ble kvantifisert gjennom normalisering med mengden i totale cellelysater, og resultatene viste at overekspresjon av KIF14 øket ekspresjon av CDH11 i membranfraksjonen, sammenlignet med kontrollceller (figur 5B, venstre ). I kontrast, uttømming av KIF14 redusert CDH11 uttrykk på celleoverflaten, sammenlignet med ikke-forstummet kontroller (figur 5B, høyre). Vi har også undersøkt fordelingen av endogen CDH11 i CL1-5 /vektor, CL1-5 /KIF14 # 2, CL1-0 /shLacZ og CL1-0 /shKIF14 celler, og resultatene var lik tidligere data (figur S5).
(A) KIF14 forbundet med CDH11 og MCAM. Lysatet av HEK293T celler transfektert med de angitte plasmider ble anvendt i eksogene immunoutfellingsstudier analyser. Immunoblotting ble utført med de angitte antistoffer. Aktin ble anvendt som en intern kontroll. (B) Et lysat av H460-celler ble anvendt i endogene immunoutfellingsstudier analyser. Immunoblotting ble utført med de angitte antistoffer. (C) Fordelingen av CDH11 og MCAM endret med overekspresjon av KIF14. H1299 cellene ble ko-transfektert med HA-CDH11 eller HA-MCAM og GFP-KIF14, fiksert og hybridisert ved anvendelse av anti-HA-antistoffer. Signalet ble fanget ved hjelp av en konfokal mikroskop (original forstørrelse, 1000 ×). (D) HEK293T celler ble ko-transfektert med HA-CDH11 og flagg-KIF14 eller siKIF14 og senere, membranfraksjonen ble isolert. Proteinet i membranfraksjonen og totalt cellelysat ble analysert ved immunblotting. Mengdene av HA-CDH11 i membranfraksjonen ble kvantifisert gjennom normalisering med mengden i de totale cellelysatene. HSP90 ble brukt som en cytosol markør.
Diskusjoner
Resultatene viste at motor protein KIF14 fungerer som en tumor og metastase suppressor i lunge adenokarsinom. Vi har observert flere tap enn vinning nær KIF14 på kromosom 1q32 (figur 1), og funnet at pasienter med lav KIF14 uttrykk oppviste dårligere samlet og metastase overlevelse sammenlignet med pasienter som uttrykker høye nivåer av KIF14 (figur 2). Overekspresjon av KIF14 i lungekreftceller betydelig hemmet forankringsuavhengig vekst
in vitro Hotell og xenograft tumordannelse
in vivo plakater (figur 3). Videre modulere ekspresjonen av KIF14 hemmet cellemigrering, invasjon og adhesjon gjennom assosiere med og øke membranen ekspresjon av lasten protein, CDH11 (figur 4 og 5). Derfor KIF14 kan være et potensielt mål for lunge adenokarsinom behandling.
Kromosom mis-segregering resultater i avvikende cytokinese og Aneuploidy. Dette fenomenet er forhindret i normale celler gjennom cellesyklus og apoptose; Men kreftceller viser økende forekomst av Aneuploidy, som kan være forbundet med dårlige kliniske utfall [36] – [41]. KIF14 funksjoner i kromosom segregering og cytokinese, og dens uttømming kan resultere i en binuclear eller flerkjerne status [4], [5], [7], [8]. Disse resultatene støtter hypotesen om at Aneuploidy utvikler seg til kreftutvikling [9] – [11], [42]. I denne studien overekspresjon eller stanse av KIF14 i celler redusert eller økt henholdsvis forankringsuavhengig vekst
in vitro
, og KIF14 overekspresjon redusert tumorvekst
in vivo plakater (figur 3). Disse resultatene er sammenfallende med de av en tidligere studie hvor det stilnet uttrykk for KIF14 i kreft i bukspyttkjertelen celler resulterte i økt forankringsuavhengig overlevelse [43]. Bortsett fra KIF14, har mange andre cytokinese regulatorer også blitt rapportert som tumorsuppressorgener, inkludert KIF1A, KIF1B, KIF3, KIF4, KIF10, von Hippel-Lindau syndrom protein (pVHL) og BRCA2 [16] – [18], [44] – [47]. Tatt sammen tyder disse resultater på at en KIF14 mangel kan fremme Aneuploidy, noe som resulterer i tumordannelse og at KIF14 kan fungere som en tumor suppressor i lungekreft.
Cancer progresjon er en kompleks prosess som involverer cellevekst, basalmembran degradering, cellemigrasjon, invasjon, heft, og metastase [48], [49]. Resultatene oppnådd i denne studien Resultatene viste at KIF14 ikke bare var involvert i tumordannelse, men også deltatt i celle adhesjon, migrasjon og invasjon (figur 3 og 4). Immun indikerte at uttrykket nivåer av KIF14 ble negativt korrelert med kreftmetastaser hos pasienter (figur 2C og 2D). I CL cellelinjer ble KIF14 protein nivåer omvendt assosiert med celle invasive evner (Figur S2A). Disse observasjonene var lik de av en tidligere rapport hvor KIF14 uttrykket er negativt korrelert med Matrigel og nerve invasjon i bukspyttkjertelkreft [43]. Derfor KIF14 kan fungere som en metastatisk suppressor i lunge adenokarsinom.
Spesielt resultatene av
in vitro
analyser var litt uharmoniske. Resultatene oppnådd i den foreliggende undersøkelse data tyder på at KIF14 lyddemping reduserer celleproliferering (figur 3), eventuelt gjenspeiler M faseforsinkelser og cytokinese feil. Ikke desto mindre, KIF14 overekspresjon ikke i vesentlig grad påvirker celleproliferasjon sammenlignet med kontrollen. Vi har videre undersøkt fordelingen av KIF14 og fenomener av cellene i hver fase, og dataene indikerte at ingen spesifikk feil forekom med KIF14 overekspresjon (upubliserte data). Således, ved å stanse eller overekspresjon av KIF14 redusert eller ikke påvirker celleproliferasjon men øket eller redusert kolonidannelse; slike effekter regnes som celletrans evner. Overekspresjon av KIF14 (KIF14 2 #) i CL1-5 celler sterkt redusert kolonidannelse, cellemigrering og invasjon, og liten ekspresjon av KIF14 (KIF14 1 #) svakt redusert kolonidannelse og sterkt redusert cellemigrering og invasjon (figur 3 og 4). Disse resultatene antydet at KIF14 proteinet påvirker celletransformasjon og invasjon i forskjellig grad. Vi foreslår at svak økning av KIF14 protein uttrykk i CL1-5 /KIF14 # 1 stabile celler fremmer også dramatisk celle migrasjon ved å hemme transporten av flere viktige last proteiner involvert i celle migrasjon og invasjon.
Selv om KIF14 er en viktig motor protein som deltar i cytokinese gjennom samhandling med PRC1 og citron kinase, forblir rolle KIF14 i andre funksjoner uklar [7]. Resultatene oppnådd i denne studien viste resultatene at KIF14 kan regulere cellemigrasjon og heft gjennom assosiasjoner med CDH11 og MCAM; denne økningen i membranen lokalisering av CDH11 i lunge adenokarsinom-cellelinjer er et nytt funn med hensyn til funksjonen av KIF14 (figur 5). Disse resultatene er lik de av en rapport hvor KIF13 deltok i mannose-6-fosfat-reseptoren transport fra cytosol til plasmamembranen [50]. Disse data indikerer at KIFS kan regulere forskjellige cellefunksjoner ved å endre lokaliseringen av forskjellige cargoproteiner.
Disse resultatene støtter hypotesen om at KIF14 fungerer som en tumor suppressor og metastase-inhibitor i lunge adenokarsinom. Rollen til KIF14 i progresjon av kreft har vært diskutert i de senere år. Corson et al., Kim et al. og Wang et al. viste at KIF14 er sterkt uttrykt i retinoblastom, brystkreft, eggstokk-kreft, leverkreft, gliom og noen lungesvulster [28], [51] – [55]. Ved hjelp av CGH rekke analyser, Corson et al. observert en 20% gevinst i lunge- og bronkie tumorer i et stort område av kromosomet 1q31-1q32 [51]; imidlertid, i foreliggende studie, utført vi CGH rekke analyser og det observert en 25% (22,5% og 26,8%) tap av de to probene i KIF14 lokalisering og en 5% (2,9% og 6,5%) gevinst i lunge adenokarsinomer. For å utforske dette avviket, vi også undersøkt mRNA uttrykk for KIF14 i vår studie kohort hjelp av primere og probe fra Corson et al. Studier. I likhet med resultatene vist i figur 1 B, pasienter med lav KIF14 uttrykk oppviste dårligere total overlevelse sammenlignet med pasienter med høyt KIF14 uttrykk. Corson et al. også forstummet KIF14 hjelp siRNA i lungetumorcellelinjer og indikerte at KIF14 stanse redusert celleproliferasjon og kolonidannelse [28]. I denne studien, forstummet vi uttrykk for KIF14 gjennom lentiviral levering av shKIF14 og fått tilsvarende resultater for spredning, men motsatte resultater med hensyn til kolonidannelse. Interessant er det fortsatt uklart hvorfor forskjellige resultater ble oppnådd for det samme genet; Men det er flere mulige forklaringer på disse fenomenene. 1. Forskjell i KIF14 protein tags: Theriault et al. benyttet leie C-terminal EGFP- og Myc-tagget KIF14 i spredning og kolonidannelse analyser, og EGFP-merket KIF14 utstilt mildere effekter enn Myc-merket KIF14 [54]. Derfor genererte vi ikke-merkede villtype KIF14 konstruksjoner og undersøkte effekten på celle invasivitet; Resultatene var lik de i Flag-tagged KIF14 (figur 4C). Vi har også genereres C-terminale Flag-merket KIF14 for å undersøke cellemigrering, og dataene var lik de som ble oppnådd med N-terminal Flag-merket og ikke-merket KIF14 (data ikke vist). 2. Etniske forskjeller: en fersk undersøkelse eksplisitt viste at forekomst, årsak, genmutasjon status, overlevelse, prognose, og lungekreft behandling var annerledes i Asia og USA [56]. 3. En-gen eller ett protein kan spille to eller flere roller i den fysiologiske funksjon. For eksempel, transformerende vekstfaktor beta (TGF-beta) virker enten som en tumor-suppressor eller et tumor-promoter under forskjellige betingelser i løpet av progresjon av kreft [57], [58], og signal transduser og aktivator av transkripsjon 3 (STAT3) har
