Abstract
Bakgrunn
Våre tidligere studier viste en nedregulering av GRIM-19 i primære humane tilfeller av livmorhalskreft, og restaurering av GRIM-19 indusert tumor regresjon. Induksjon av tumor suppressor protein p53 ubiquitinering og nedbrytning av E6 oncoportein av høy risiko-HPV gjennom å danne et stabilt kompleks med E6AP regnes som en kritisk mekanisme for livmorhalskreftutvikling. Målet med denne studien var å fastslå den potensielle rolle GRIM-19 i å redde p53 protein og fremkalle livmorhalskreft celle apoptose.
metodikk /hovedfunnene
Protein nivåer av GRIM-19 og p53 ble påvist i normale livmorhals vev fra 45 pasienter som gjennomgikk hysterektomi for andre enn neoplasier enten mot livmorhalsen eller endometrium, og livmorhalskreft vev fra 60 pasienter med ikke-metastatisk squamous epitelceller karsinomer grunner. Coimmunoprecipitation og GST pull-down analysen ble utført for å undersøke samspillet mellom GRIM-19 med 18E6 og E6AP
in vivo og in vitro
hhv. Konkurransen fra 18E6 med E6AP i bindende GRIM-19 ved å utføre konkurranserullegardin analyser er designet for å undersøke avbrudd av E6 /E6AP kompleks av GRIM-19. Augmentasjonen av E6AP ubiquitinering ved GRIM-19 ble påvist in vivo og in vitro ubiquitinering assay. Virkningene av GRIM-19-avhengige p53 opphopning på celleproliferasjon, cellesyklus, apoptose ble utforsket av MTT, flowcytometri og transmisjonselektronmikroskopi respektivt. Svulsten undertrykkelse ble oppdaget av xenograft mus modell.
Konklusjon /Betydning
Nivåene av GRIM-19 og p53 ble samtidig nedregulert i livmorhalskreft. Restaureringen av GRIM-19 kan indusere ubiquitinering og nedbrytning av E6AP, og forstyrre E6 /E6AP komplekse gjennom samspillet av N-terminalen av GRIM-19 med både E6 og E6AP, som beskyttet p53 fra degradering og fremmet celle apoptose. Tumor xenograft studier avslørte også undertrykkelse av p53 nedbrytning i nærvær av GRIM-19. Disse data tyder på at GRIM-19 kan blokkere E6 /E6AP kompleks; og synergi undertrykke livmorhalstumorvekst med p53
Citation. Zhou Y, Wei Y, Zhu J, Wang Q, Bao L, Ma Y, et al. (2011) GRIM-19 forstyrrer E6 /E6AP Complex å redde p53 og indusere apoptose i livmorhalskreft. PLoS ONE 6 (7): e22065. doi: 10,1371 /journal.pone.0022065
Redaktør: Scott A. Coonrod, Cornell University, USA
mottatt: 18 april 2011; Godkjent: 14 juni 2011; Publisert: 12.07.2011
Copyright: © 2011 Zhou et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Basic Research Program of China (973 Program): 2007CB914503 https://www.973.gov.cn, National Natural Science Foundation of China (No. 81071683, 81001168 81072127 og 91029710) http: //www.nsfc .gov.cn, «Eleventh Five-Year» National Technology Support Programme (2008BAI57B03) https://kjzc.jhgl.org, National Institutes of Health gir CA105005, CA78282 og P30-CA134274 https://grants.nih.gov. Anhui Provincial Natural Science Foundation prosjekt (20090413117, 11040606M178) https://www.ahkjt.gov.cn, og Provincial Natural Science Research Project Anhui Provincial Høyere universitetsutdanning (KJ2010B375) https://www.ahedu.gov.cn/. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Høy risiko menneskelige papillomavirus (HR-HPV), som HPV18 og HPV16, er ikke bare en viktig årsak til livmorhalskreft [1], men også patogener av en undergruppe av andre svulster som leder og nakke plateepitelkreft karsinomer [2], lungekreft [3] øvre aerodigestive veiskreft [4] og anogenital kreft [5]. Uttrykket av virus teinene E6 i HPV-positive livmorhals karsinom [6] kan samhandle med E6-assosiert protein (E6AP) for å danne E6 /E6AP kompleks som spesifikt induserer ubiquitinering og raske nedbrytning av p53, kjernefysisk transkripsjon faktor X-box binding 91 (NFX1-91) og PDZ domene-inneholdende proteiner gjennom proteasom-reaksjonsveien [7], [8], [9], [10]. p53 degradering er en viktig forutsetning for overlevelsen av HR-HPV-infisert svulster; dermed blokkerer E6 /E6AP kompleks medierende p53-degradering kan være en attraktiv metode for behandling av kreft med HR-HPV-infeksjon [11], [12], [13], [14].
GRIM-19 ble opprinnelig identifisert som en svulst-undertrykkende protein som var involvert i celledød [15] gjennom foreningen og undertrykkelse av STAT3 [16], [17]; Dens uttrykk er nedregulert i nyre, prostata og livmorhalskreft [16], [17], [18], [19], [20]. Videre undertrykker GRIM-19 onkogen-indusert ombygging av cytoskjelettet og cellemotilitet [21]; og cellesyklusprogresjon ved å samhandle med tumor suppressor p16INK4a [22]. Således utøver GRIM-19 forskjellige mekanismer i en rekke forskjellige celletyper. Her rapporterer vi at GRIM-19 induserer p53 akkumulering gjennom en forstyrrelse av E6 /E6AP kompleks og en induksjon av auto-ubiquitinering av E6AP i livmorhalskreftceller. Denne studien viser en ny funksjon og en molekylær mekanisme som GRIM-19 hemmer HR-HPV indusert tumordannelse ved å beskytte p53 fra degradering.
Resultater
GRIM-19 og p53 er samtidig nedregulert i livmorhalsen kreft
Vår tidligere studie viste at GRIM-19 induserer livmorhals tumor regresjon i en mus xenograft modell, noe som tyder på en mulig rolle GRIM-19 i tumorvekst regulering [20]. Siden p53 tumor suppressor er også lav uttrykt i livmorsvulster, vi videre undersøkt om det er en sammenheng mellom nivået av GRIM-19 og p53. Nivåene av GRIM-19 og p53 var signifikant (
p
0,01) lavere i tumorene, og direkte korrelert med hverandre i 99% av livmorhals tumorer (Fig. 1). I samsvar med en lav p53 i tumorene, en godt studert p53 målgen, Puma, ble også nedregulert i tumorer sammenliknet med normalt vev (Fig. 1). Resultatene viste at GRIM-19 og p53-nivåer ble samtidig undertrykt, noe som tyder på en mulig sammenheng mellom GRIM-19 og p53 i livmorhalskreft.
(A) Totalt cellulære ekstrakter (50 mikrogram) fra primærlivmorhals svulster (T ) og normale vev i livmorhalsen (N) ble kontrollert for ekspresjon av GRIM-19, p53 og Puma ved Western blotting. De representative resultatene av Western blotting vises. T1-T4 var fra individuelle pasienter med livmorhalskreft. T1 og T2 ble diagnostisert som stadium IIa; og T3 og T4 ble diagnostisert som stadium Ia squamous epitelceller karsinomer. (B) Kvantitativ analyse av protein uttrykk som målt ved den optiske densitet for hvert bånd. Forholdet mellom tetthet fra GRIM-19, p53, Puma over tilsvarende GAPDH (45 tilfeller av normalt vev og 60 tilfeller av tumorvevet) ble beregnet.
GRIM-19 forsterker p53-proteinnivåer i livmorhalskreftceller
for ytterligere å undersøke forholdet mellom GRIM-19 og p53, HeLa celler med enten overekspresjon (pG19) eller knockdown (siG19) av GRIM-19 ble brukt, og nivåene av GRIM-19 og p53 ble vurdert ved Western blotting (figur 2A). Interessant, sammenlignet med tilsvarende kontroll (p /SICON) celler, p53 og dens målgener PUMA og p21 økte i HeLa /pG19 celler (Fig. 2A, venstre panel) og redusert i HeLa /siG19 celler (figur 2a, høyre panel ). I tillegg er to andre cervikale kreftcellelinjer, Siha og CaSki, ble transfektert med enten en GRIM-19 ekspresjonsplasmid eller dsRNA målretting GRIM-19 og sammenlignet med deres respektive kontroller. Resultater tilsvarende de som er observert i HeLa ble oppnådd i disse cellene også (Fig. 2B). Videre tester på andre HPV-free tumorcellelinjer (A549 og HO8910) ikke avsløre de samme resultatene som ble observert i HeLa (Fig S1). Dermed nivåene av GRIM-19 direkte korrelert med de av p53 i livmorhalskreftceller
. (A B) Protein nivåer av GRIM-19 og p53 i primærlivmorhalskreft. Western blotting med de angitte antistoffer ble utført ved anvendelse av lysater fra de angitte cellelinjer. (C) Effekt av GRIM-19 på p53 mRNA uttrykk. MRNA av GRIM-19 (venstre panel) betydelig høy i HeLa /pG19 celler (*
p
0,01), viser den høyre panel p53 mRNA uttrykk. Forskjellene er ikke statistisk signifikant. (D) GRIM-19 påvirket ikke p53-promoteraktivitet. En p53-Luc reporter ble anvendt. Dataene presentert er gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter med triplikate prøver i hver test. (E) GRIM-19 øker halveringstiden av p53. Celler ble behandlet med CHX (100 ug /ml) for de angitte tidsperioder og lysater ble underkastet Western blotting med de angitte antistoffer. Representative resultater fra en av tre uavhengige forsøk er vist (venstre panel). Den gjenværende verdi for p53 ble beregnet som forholdet mellom de densitometriske verdier av p53 i løpet av GAPDH i hver prøve (høyre panel). Gjennomsnittlig gjenværende verdier fra tre uavhengige eksperimenter ble plottet. (F) GRIM-19 hemmet p53 degradering
in vivo
. Før høsting av cellene ble behandlet med MG132 i 4 timer, og immunopresipitering med p53-antistoff ble utført. Western blotting av IP-produkter var med ubiquitin antistoff. GAPDH antistoffer ble brukt til å bestemme sammenlign lasting.
For å undersøke om GRIM-19 økte p53 via transkripsjonsregulering, ble p53 mRNA nivåer undersøkt av kvantitativ RT-PCR og luciferase reporter analysen ble utført i HeLa /pCon og HeLa /pG19 celler. Nivået av p53 mRNA var upåvirket ved overekspresjon av GRIM-19 (Fig. 2C). Dessuten ble ikke p53 promoter-drevet luciferase reporter ikke avslører betydelige endringer i p53 promoter-aktivitet i HeLa /pCon og HeLa /pG19 celler (fig. 2D), noe som tyder på at GRIM-19 ikke er involvert i den transkripsjonelle aktivering av p53.
i cervikale tumorer, er p53 sjelden mutert [23], og den er raskt nedbrutt av E6 /E6AP [6], [24], vi neste undersøkt om økning i p53-nivåer er på grunn av økt halveringstid av proteinet . HeLa /pG19 og HeLa /pCon-celler ble behandlet med cykloheksimid og p53-proteinnivåer ble overvåket over tid. Faktisk, er halveringstiden av p53-protein var signifikant (
p
0,01) forlenget i HeLa /pG19-celler sammenlignet med HeLa /pCon-celler (figur 2E.).
In vivo
ubiquitinering analysen viste også at ubiquitinated p53 i HeLa /pG19 celler ble dramatisk redusert i forhold til HeLa /pCon celler (figur 2F).
Samlet utgjør disse resultatene antydet at GRIM-19 restaurerte p53 nivåer gjennom protein stabilisering fremfor transkripsjonen oppregulering i livmorsvulster.
GRIM-19 stabiliserer p53 protein ved å samhandle med E6 og E6AP proteiner
E6 /E6AP-mediert p53 nedbrytning anses som en viktig mekanisme i initiering og utvikling av livmorhals karsinom [23], [25]. Siden GRIM-19 bindes til 16E6 [26], hypotese vi at GRIM-19 forstyrrer E6 /E6AP komplekse, og dermed beskytter p53 fra degradering. Bruke immunoutfellingsstudier analyser med cellulære lysater fra HeLa-celler, fant vi et samspill av GRIM-19 med E6AP
in vivo plakater (fig. 3A). Vi undersøkte GRIM-19-E6AP interaksjon
in vitro
med GST rullegardin analyser. E6AP koder for tre forskjellige protein isoformer (I, II og III) som er forskjellige i deres N-terminal hale, som alle har evnen til å stimulere E6-mediert ubiquitin-avhengig nedbrytning av p53-protein [27]. Fordi flere funksjonelle domener av E6AP hadde tidligere blitt identifisert [28], genererte vi tre rekombinante plasmider uttrykker Hans-merket E6AP-III isoform-baserte slettinger: pE6AP-Δ1 (1-286 aa), pE6AP-ô2 (287-521 aa) og pE6AP-Δ3 (522-872 aa). E6 bindingssteder ble plassert mellom aa 287-521 av E6AP-III, mens hect domene for ubiquitin bindingsseter ble plassert i segmentet 522-872 aa (Fig. 3C) [29]. Vi fant at bare E6AP-Δ3 bundet til GST-merket GRIM-19 ved GST pull-down-analyse (Fig. 3B-C), men ikke den katalytisk inaktive E6AP inneholdende en mutasjon på Cys i posisjon 840 (fig S2), Disse resultatene støttet vår konklusjon at GRIM-19 kan binde hect domenet E6AP. For å kartlegge nøyaktig samspill regionen GRIM-19 med E6AP, ansatt vi GST-merket GRIM-19 slettinger pGST-G19-Δ1, pGST-G19-ô2 og pGST-G19-Δ3; Og fant at aminosyrene 1-35 til Grim-19 var tilstrekkelig for binding E6AP proteiner (Fig. 3D).
(A) Co-immunoutfellingsstudier analyser ble utført for å bestemme interaksjonen mellom GRIM-19 med E6AP
in vivo
. Cellelysatene fra HeLa celler ble immunopresipitert med normal IgG og anti-GRIM-19-antistoffer og Western utslettet med anti-E6AP. Inngang (preIP) lane utgjør 10% av den ekstrakt som brukes i immunopresipiteringsreaksjon. HC = IgG tung kjede. (B) GST rullegardin eksperimenter ble utført for å undersøke samspillet mellom Hans-merket E6AP slettinger med GST-smeltet GRIM-19 protein
in vitro
. (C) Skjematisk fremstilling av E6AP indikerer ulike funksjonelle domener inkludert bindingssteder for GRIM-19. (D) Samspillet mellom GST-GRIM-19 slettinger med E6AP. * Angir posisjonen av bånd med korrekt molekylstørrelse. (E) Co-immunoutfellingsstudier analyser ble utført for å bestemme interaksjonen mellom GRIM-19 med 18E6. Cellelysatene fra HeLa-celler transfektert med den p18E6-Flag ble underkastet IP med de angitte antistoffer. Inngang (preIP) lane utgjør 10% av den ekstrakt som brukes i immunopresipiteringsreaksjon. LC = IgG lett kjede. (F) Samspillet mellom GST-GRIM-19 slettinger med 18E6. * Angir posisjonen av bånd med korrekt molekylstørrelse. (G) Sletting kartlegging av E6 eller E6AP bindingsseter på GRIM-19.
Vi har rapportert samspillet av GRIM-19 med 16E6 før [26], vi utforsket foreningen av GRIM -19 og 18E6. På grunn av den lave ekspresjon av E6 og dårlig reaktivitet av tilgjengelige E6 antistoffer som har blitt rapportert av en rekke publikasjoner [30], [31], [32], [33], har vi klart å oppnå en tilfredsstillende 18E6 Western blot fra cellelysater. Derfor ble et plasmid p18E6-Flag som uttrykker en Flag-merket 18E6 protein konstruert. Gjennom Immunoutfellingsunder analyser i HeLa celler transfektert med p18E6-Flag, fant vi 18E6 co-utfelt med GRIM-19
in vivo plakater (Fig. 3E). For å kartlegge nøyaktig samspill regionen GRIM-19 med 18E6, ansatt vi bindingsstedet for GRIM-19 med 18E6 ved hjelp av GST-merket GRIM-19 slettinger (pGST-G19-Δ1, pGST-G19-ô2 og pGST-G19- Δ3); Og fant ut at aminosyrene 1-35 av GRIM-19 var tilstrekkelig for binding 18E6 proteiner
in vitro plakater (Fig. 3F).
Vi konkluderte derfor med at GRIM-19 kan binde både 18E6 og E6AP
in vivo og in vitro
, som kan spille en rolle i opphopning p53 protein.
GRIM-19 forstyrrer E6 /E6AP kompleks og forsterke E6AP ubiquitinering og degradering
Gitt at både 18E6 og E6AP-Δ3 kan samhandle med aminosyrer 1-35 av N endestasjonen GRIM-19 (fig. 3G), bestemt vi enten 18E6 konkurrerte med E6AP i bindende GRIM-19 ved å utføre konkurranserullegardin analyser. I nærvær av renset GST-G19 protein og økende mengde E6AP-Δ3, bindingen av 18E6 i Grim-19 gradvis reduseres etter hvert som E6AP-Δ3 økes (fig. 4A). Selv E6AP-Δ2 unnlatt å samhandle med GST-G19, er det velkjent at denne regionen havner E6-bindingssteder [28]. Derfor testet vi om GST-G19 og E6AP-Δ2 konkurrere i binding med 18E6. I nærvær av E6AP-Δ2, GST-G19-bundet 18E6 redusert sammenlignet med 18E6 presenteres alene (Fig. 4B). Videre har vi ikke observere en sammenslutning av E6AP-Δ2 med GST-G19 i nærvær av 18E6, noe som tyder på at proteinene ikke kan danne en heterotrimeric kompleks av 18E6 /E6AP-Δ2 /GST-G19.
(A ) Konkurrerende analyser ble utført for å analysere bindingen av 18E6 til GST-GRIM-19-fusjonsprotein i nærvær av økende mengder av E6AP-Δ3 strekker 0-6 ug. (B) Trekk ned eksperimenter for å bestemme bindingen av 18E6 til GST-GRIM-19 proteiner. Hvor indikert E6AP-ô2 proteiner (10 ug) ble lagt inn i GST Pull-down reaksjon. (C) GRIM-19 utvidet E6AP degradering
in vivo
. Før høsting av cellene ble behandlet med MG132 i 4 timer, og immunopresipitering med E6AP antistoff ble utført. Western blotting av IP-produkter var med ubiquitin antistoff. GAPDH-antistoffer ble brukt til å bestemme den tilsvarende belastning. (D)
In vitro
E6AP ubiquitinering analysen. Menneskelig rekombinant ubiquitin, E1, E2 (UbcH5c), batereria-uttrykt og renset GST og GTS-GRIM-19, ble E6AP (villtype eller katalytisk inaktiv mutant CA) fra hvetekim ekstrakt blandet for
in vitro
E6AP ubiquitinering analysen og immunoblottet med ubiquitin antistoff. (E) Hele cellelysater fra HeLa-celler som uttrykker de indikerte ekspresjonsplasmider var Western strøket med de angitte antistoffer.
Det har vært godt etablert at E6AP kan målrette seg for ubiquitinering, noe som representerer en mekanisme for å kontrollere sin egen halveringstid [7], [34]. Vi utforske deretter om ekspresjonen av GRIM-19 kan påvirke nedbryting av E6AP, i nærvær av overuttrykt GRIM-19, ubiquitinated E6AP signifikant økt sammenlignet med HeLa /pCon-celler (fig. 4C). In vitro ubiquitinering analyse viste at GRIM-19 økte autoubiquitination av villtype E6AP, men ikke dens dominant-negative CA mutant ved å benytte purifed E1 og E2 (UbcH5c), bakterie uttrykt GRIM-19, og villtype E6AP og CA mutant E6AP oversatt i hvetekim ekstrakt system (fig. 4D). Ja, vi fant E6AP protein ble redusert i celler med overekspresjon GRIM-19 (fig. 4E, S1).
I sammendraget, konkluderer vi med at GRIM-19 hindrer p53 nedbrytning av vanskelig E6 /E6AP kompleks formasjon og fremmer ubiquitinering og nedbrytning av E6AP.
GRIM-19 forsinkelser G0 /G1 overgang, hemmer celledeling og induserer apoptose, og fremmet p53 akkumulering in vivo
Gitt at induksjoner av cellesyklus arrest og cellevekst undertrykkelse er de viktigste funksjonene til p53, evaluert vi neste effekten av GRIM-19-avhengige p53 stabilisering av cellesyklus. Cellecyklus fordelings analyser viste en signifikant forsinket G0 /G1 overgang i HeLa /pG19 celler når sammenlignet med HeLa /pCon-celler (tabell 1). I tillegg, som angitt ved MTT-analysen, er celleformering av HeLa /pG19-celler var signifikant (p 0,05). Trykkes på dag 3 og dag 4 (Fig. 5A) sammenlignet med HeLa /pCon celler
(A ) En MTT-analysen ble utført i de angitte celler. MTT-analysen ble utført som i Materialer og Metoder. Hvert datapunkt representerer gjennomsnitt ± SE av 8 prøver. (B) De morfologiske karakteristika for HeLa /pCon og HeLa /pG19 celler ble undersøkt ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi. Chromatin kondens, utvidelse og utvidet kjernefysiske membran hull, vag kjernemembranen struktur, ble brudd i kjernemembranen og endoplasmatiske retikulum utvidelse indikert med piler. ER, endoplasmatiske retikulum; NM, kjernemembranen. (C) Den fulle lengde og spaltet form av kaspase-3 og PARP i HeLa /pCon og HeLa /pG19 celler ble bestemt ved Western blot-analyser. (D) HeLa /Con og HeLa /G19-celler ble transplantert inn i 6-ukers-gamle hunn atymiske nakne mus (10 mus for hver cellelinje) og dyrket i 6 uker. Svulster ble høstet, og vekter ble målt. Dataene presenterer gjennomsnittet av 10 tumorer i hver gruppe. (E) Ekspresjon av GRIM-19, p53, p21, Puma, p27 og E6AP i tumorer avledet fra mus som bestemt ved Western blot analyser, og de representative resultater er presentert. (F) En modell for samarbeid mellom GRIM-19 og p53. Når GRIM-19 er tilstede i et høyt nivå, samvirker den med den E6 /E6AP kompleks, fremmer deres ubiquitinering for derved å forhindre degradering p53. Tapet av GRIM-19 tillater angrepet av E6 /E6AP kompleks på p53 og dens degradering gjennom proteasome.
Fordi fremme celle apoptose er en annen viktig funksjon av p53, vi utførte celle apoptose analyser inkludert transmisjonselektronmikroskopi (TEM) og Western blotting med caspase 3 og PARP antistoffer. En rekke tidlige apoptose egenskaper ble angitt i HeLa /pG19 celler, inkludert kjernefysisk kromatin kondens, utvidet kjernemembranen gap, vag kjernemembranen struktur, brudd i kjernemembranen og endoplasmatiske retikulum utvidelse; Dette vil imidlertid ikke ble observert i HeLa /pCon celler (Fig. 5B-pilene). I tillegg ble spaltingen av caspase 3 og PARP økt i HeLa /pG19-celler sammenlignet med HeLa /pCon-celler (fig. 5C).
Vi fant også tumorvektene i mus transplantert med HeLa-celler /pG19 ble betydelig redusert sammenlignet med en kontrollgruppe, (
p
0,05) (fig. 5D). GRIM-19 og p53, sammen med p21, ble PUMA og P27 proteiner betydelig økt, men E6AP ble redusert i svulstene avledet fra HeLa /pG19 celler sammenlignet med svulster fra HeLa /pCon celler (Fig. 5E).
til slutt, basert på våre observasjoner, ble en modell for GRIM-19 indusert celle apoptose ved å forstyrre E6 /E6AP kompleks og stabilisering av p53 spekulert (fig. 5F). Denne modellen tyder på at tilstedeværelsen av GRIM-19 fremmer auto-ubiquitinering og nedbrytning av E6AP ved å samhandle med disse proteinene og bidrar til p53 stabilisering, vekst og apoptose.
Diskusjoner
Høy risiko menneskelige papillomavirus (HR-HPV), som HPV18 og HPV16, er forbundet med 99,7% av livmorhalskreft [35], som er de vanligste gynekologiske svulster i utviklingsland [36]. De virale oncoproteiner E6- og E7 er uttrykt i HPV-positive cervikale karsinomer [6], mens det virale E2-protein undertrykker transkripsjon av E6 /E7-onkogener og aktiverer viral DNA replikasjon sammen med det virale E1 helikasen [37], [38], [39]. E6 /E6AP mediert degradering av p53 er ansett som en meget viktig mekanisme i initiering og utvikling av livmorhalskreft [6], [11], [12], [25], [40], [41]. Nyere studier antydet at innblanding av E6 /E6AP kompleks kan drepe cervikale tumorer ved å øke nivået av p53-protein [11], [12], [40]. I vår studie presenterer vi en ny tilnærming for å hindre p53 degradering ved restaurering av GRIM-19 som forstyrrer E6 /E6AP kompleks.
Det har blitt rapportert at GRIM-19 kan undertrykke transkripsjonen aktivitet av STAT3 gjennom protein- kreft vekst proteininteraksjon, og inhibere [16], [17]. STAT3 har vist seg å hemme p53-ekspresjon via en transkripsjonen undertrykkelse i src oncogen-induserte signalveier i visse gnagercellelinjer [42]. Noen studier i kreftcellelinjer viste en sammenheng mellom høye konstituerende STAT3 aktivitet og p53 genmutasjoner, selv om årsak og virkning relasjoner ikke ble etablert [43]. I visse hode og nakke plateepitelkarsinom har p53 status vist seg ned regulere NF-kB og STAT3 indusert genekspresjon [44]. Vi har vist i vår forrige publikasjon som GRIM-19 tap korrelerer med høy STAT3 aktivitet i grunnskolen livmorhalskreft [20]. Selv om slike observasjoner tyder på en mulighet for at tap av GRIM-19 fremmer høy STAT3 aktivitet som kan til slutt transcriptionally ned regulere p53 uttrykk, gjorde våre studier ikke avsløre (fig 2C . D) eventuelle endringer i uttrykket av luciferase reporter drevet av menneskelig p53 promoter og av endogent p53 mRNA. Derfor kan STAT3 deregulering ikke har en direkte konsekvens av p53 uttrykk i vår modell. Dermed to GRIM-19 uavhengige veier: 1) en aktivering av STAT3 og 2) en nedregulering av p53 samtidig forekommer i HPV forvandlet livmorhals karsinomer for å fremme tumordannelse etter tapet av GRIM-19 uttrykk. Enda viktigere, Interferens med STAT3 uttrykk ved hjelp av RNA
i
eller dens funksjon ved hjelp av dominerende negative tilnærminger (fig S3) ikke signifikant påvirker GRIM-19 effekter på p53 stabilisering. Derfor p53 protein stabilisering av GRIM-19 ser ut til å forekomme uavhengig av STAT3.
I denne artikkelen har vi også testet om GRIM-19 hemmer p53 degradering i fravær av E6. To HPV-negative celler HO8910 og A549 som begge inneholdende vill-type p53 [45] ble kontrollert for deres p53-ekspresjon etter overekspresjon av GRIM-19. Selv om GRIM-19 var i stand til å øke nedbrytningen av E6AP i disse to cellene, protein nivåene av p53 forble uendret (fig S1), noe som tyder på at GRIM-19 er i stand til å forebygge E6-avhengig p53-degradering.
Nye rapporter har vist at GRIM-19 kan samhandle med noen andre viktige fysiologiske proteiner som HtrA2 [46]; Dessuten kan virusproteiner som U95 og vIRF1 også bindes til GRIM-19 [21], [26], [47]. Vi har tidligere vist en sammenheng mellom 16E6 og GRIM-19 [26]; her, vi også funnet samspillet mellom GRIM-19 med 18E6 og E6AP
in vivo Hotell og
in vitro
, og induksjon av autoubiquitination nedbrytning av E6AP av GRIM-19. I HR-HPV-infeksjon i livmorkreftceller, GRIM-19 var i stand til å indusere akkumulering av p53 protein og for å øke p53 målgener som p21 og PUMA. I tillegg ble det ikke observert signifikante endringer i cellesyklusprofil, celleproliferasjon, og de karakteristiske morfologiske tegn på apoptose i HeLa-celler overekspresjon av GRIM-19. Dermed kan GRIM-19 og p53 synergi undertrykke livmorhalskreft cellevekst.
E6AP er en kritisk regulator av p53 nedbrytning i humane tilfeller av livmorhalskreft i en E6 avhengig måte. Bortsett fromp53 har E6 /E6AP kompleks er rapportert å påvirke flere cellulære funksjoner [48] inkludert transkripsjonsaktivatorer som IRF3, ko-aktivatorer ASP300, apoptose indusere som Bak, GADD34, procaspase-8 og dens adapter FADD, protein kinaser slik som tyk2, celleadhesjon forbundet molekyler som Paxillin, og NFX1-91, noen molekyler som demper telomerase-aktivitet. I de fleste av disse tilfellene E6 /E6AP komplekse mål disse proteinene til degradering å tillate onkogene transformasjon [48]. E6 interaksjon med E6AP har blitt rapportert å være viktig for hud karsinogenese i transgene musemodeller [49], [50]. E6AP rettet også proteiner i en E6-uavhengig måte. Faktisk er flere substrater som for eksempel medlemmer av Src-familien av proteinkinaser [51], polycomb protein Ring1B [52] og promyelocytisk leukemi (PML) protein [53] er blitt rapportert. Naturlig forekommende sporadiske E6AP mutasjoner er assosiert med Angelmans syndrom, en alvorlig form for mental retardasjon, karakterisert ved at akkumuleringen av unedbrutte proteinaggregater er blitt rapportert [52], [54], [55], [56]. Dermed E6AP protein i forbindelse med E6 og i noen situasjoner på sin egen spiller en sentral rolle i protein degradering kontrollere flere menneskelige sykdommer.
Fordi E6AP også fungerer som en dobbel funksjon coactivator for steroidhormonreseptorer (shrs) inkludert progesteron reseptor, estrogen reseptor, androgen reseptor, glukokortikoid reseptor, retinsyrereseptor-α og thyroid hormon reseptor [29], [57], og aminosyrene fra 170 til 680 er aktivering domenet av E6AP [29], interaksjonen av GRIM-19 med E6AP (522-872 aa) kan forutsi at GRIM-19 trolig regulerer SHR-avhengige gentranskripsjon.
i sammendraget, våre studier for første gang viser en ny mekanisme som GRIM-19 blokker E6 /E6AP kompleks; og samarbeidet mellom to forskjellige tumor suppressor proteiner i å regulere cellevekst.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle cervical vev ble oppnådd fra pasienter som gjennomgikk hysterektomi mellom januar 2008 og november 2009 kl Anhui Provincial Hospital tilknyttet Anhui Medical University, Hefei, Kina. Studien ble gjennomgått og godkjent av etisk gjennomgang styret i Anhui Provincial Hospital. Skriftlig samtykke ble innhentet fra hver pasient.
Alle dyr eksperimentelle prosedyrer utført i denne studien er godkjent av Forsøksdyr av Etisk komité Anhui Provincial Hospital Affiliated til Anhui Medical University etter tillatelse nummer 201000179, og var i samsvar med retningslinjene for dyr omsorg fastsatt av denne komiteen.
Svulster
En del av nylig skåret vev ble parafininnstøpte, skåret i 5- til 7-mikrometer tykke seksjoner for patologisk diagnose, og resten av vevet ble frosset ved -80 ° C for videre bruk for å ekstrahere proteiner og RNA. Kliniske faser ble bestemt av en sertifisert gynekologisk patolog ifølge en modifisert International Federation of Gynecology Obstetrics (FIGO) staging system for livmorhalskreft i 2000. De 60 ikke-metastatisk squamous epitelceller karsinom undersøkt i disse studiene var HPV16 eller HPV18 positiv og tilhørte skriver Ia (13 pasienter), Ib (9 pasienter) og IIa (38 pasienter). I tillegg har 45 normale cervical vev fra pasienter som gjennomgikk hysterektomi for andre formål enn neoplasier i enten livmorhalsen eller endometrium grunner ble oppsamlet og anvendt som normale kontroller i denne studien.
Cellekultur og transfeksjon
Humant livmorhalskreft cellelinjer HeLa, Siha og CaSki og den menneskelige lunge adenokarsinom cellelinje A549 fra American Type Culture Collection (ATCC) ble dyrket DMEM med 10% føtalt bovint serum. Den menneskelige eggstokkreft cellelinje HO8910 ble kjøpt fra cellen bank av den kinesiske Academy of Sciences [58], [59] og dyrket i komplett RPMI-1640. Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ble brukt for transfeksjon. Den stabilt transfektert cellelinjer HeLa /pCon og HeLa /pG19 uttrykker kontroll vektor og menneskelig GRIM-19, henholdsvis, ble beskrevet tidligere [20].
tumorxenotransplantater
Dyr ble oppdratt i henhold til standard laboratorium forhold. To grupper (10 i hver gruppe) av 6-ukers-gamle hunn atymiske nakne mus (Beijing forsøksdyr sentrum) ble implantert subkutant i høyre flanke av mus med enten HeLa /pG19 eller HeLa /pCon-celler (1 x 10
7) i 0,1 ml PBS inneholdende 50% matrigel. Alle mus ble plassert i en patogen-fri omgivelser. Ved slutten av eksperimentet (6 uker etter implantasjonen) ble musene avlivet, tumorene ble oppsamlet og veiet. En del av hver tumor ble behandlet for immunhistokjemi og biokjemiske analyser, og resten ble frosset ved -80 ° C inntil bruk.
Plasmider
De plasmider LZRSpBMN-linker-IRES-EGFP-STAT3C (STAT3C) som uttrykker en konstitutivt aktiv mutant STAT3 og LZRS pBMN-linker-IRES-EGFP-STAT3DN (STAT3DN) som uttrykker en dominant negativ mutant STAT3 var gaver fra Dr. Hodge DR som beskrevet tidligere [60]. De tomme vektor Pirès-Puro2-myc (pCon) og Pires-Puro2-GRIM-19-Myc (pG19) uttrykker en Myc-merket GRIM-19 ble beskrevet tidligere [20].
