Abstract
Denne studien er å undersøke forholdet mellom ectonucleoside trifosfat diphosphohydrolase 5 (ENTPD5) uttrykk og lungekreft clinicopathological faktorer, og virkningen av ENTPD5 på lunge kreft celle funksjoner. Lungekreft prøver og passet tilstøtende normale vev ble oppnådd fra pasienter uten noen preoperativ radioterapi eller kjemoterapi. Knockdown av ETNPD5 uttrykk førte til signifikant redusert lungekreft celleveksthastighet, markert øket apoptose og evnen til å reparere, og betydelig redusert invasjon. Gene chip tester viste at knockdown av ENTPD5 uttrykk forårsaket mer caspase uttrykk. Kvantitativ real-time PCR viste at caspase 3 ekspresjon ble betydelig økt etter knockdown av ENTPD5. I tillegg immunohistokjemi viste at svulstvekst markør, prolifererende cell nuclear antigen, var signifikant redusert i knockdown modell. Tumorgenisitet assay og terminal deoksynukleotidyl transferase-mediert dUTP nick-ende-merking analyse viste at apoptose av lungekreftceller ble øket i knockdown modell. Våre resultater tyder på at ENTPD5 påvirker lungecancer apoptose via Caspase 3 vei, og kan potensielt brukes til å overvåke prognose eller for å veilede egnede terapeutiske regimer
relasjon:. Xue Y, Wu L, Liu Y, Ma Y, Zhang L, Ma X, et al. (2015) ENTPD5 induserer apoptose i lungekreftceller via Regulering Caspase 3 Expression. PLoS ONE 10 (3): e0120046. doi: 10,1371 /journal.pone.0120046
Academic Redaktør: Yi-Hsien Hsieh, Institutt for biokjemi og bioteknologi, TAIWAN
mottatt: 23 oktober 2014; Godkjent: 03.02.2015; Publisert: 20 mars 2015
Copyright: © 2015 Xue et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Beijing Science New Star Plan (nr Z11111005450000) og Natural Science Foundation National of China (nr 81101598)
Konkurrerende interesser.: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Lungekreft er en av de vanligste ondartede svulster, er den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis [1]. Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) ca. står for 80% av lungekreft tilfellene [2]. Lungekreft er å anse som en slags genetisk sykdom der avvikende endogene patogene genekspresjon bidrar til genomiske ustabilitet som forbedrer motilitet og invasivitet av kreftceller, som fører til egenskapene til invasivitet. Til tross for vellykket behandling av den primære malignitet, tilbakefall og påfølgende fjernmetastaser forekommer fortsatt i mer enn en fjerdedel av postoperative pasienter [3]. Derfor bør postoperative oppfølging utføres rutinemessig for å søke etter tidlig metastase å redusere dødeligheten. Ifølge nyere forskning har overekspresjon av spesifikke gener i løpet av karsinogenese er påvist i flere lungekreft, så som epidermal vekstfaktor-reseptor [4-6], human epidermal vekstfaktor-reseptor-2 [7], p53 [8] og B-celle- lymfom-2 [9]. Inhibering av apoptose av tumorceller vanligvis innebærer mange viktige gener, som kan være funksjonsmessig forbundet med ubegrenset kreftcelle progresjon, for eksempel proliferasjon, migrering og invasjon. Til slutt, kan kreftceller metastaserer til fjerne organer og true levetid. Gener og proteiner som regulerer tumor aggressivitet kan tjene som prognostiske markører og /eller terapeutiske mål av lungekreft. Derfor er det nødvendig å utvikle svært sensitive og spesifikke diagnostiske gener /biomarkører for å fremme nøyaktighet i tidlig diagnostisering av metastasering. Nå har flere gener blitt rapportert å delta i en rekke patologiske prosesser og i betydelig grad påvirker aggressiviteten av kreftceller, slik som ALK [10], kallikrein-relaterte peptidase 8-genet [11], og RAS [12].
Ectonucleoside trifosfat diphosphohydrolase 5 (ENTPD5) er en slags enzym i det endoplasmatiske retikulum som hydrolyserer UDP til UMP å fremme protein N-glykosylering og folding i det endoplasmatiske retikulum. ENTPD5 protein er forskjellig fra andre NTPDases som det er det eneste medlemmet som er beskrevet som en proto-onco protein [13]. ENTPD5 er rapportert å fremme celleproliferasjon og Warburg effekt [13]. Eksisterende bevis bekrefter at ENTPD5 deltar i flere cellulære funksjonelle prosesser og fremmer invasjon muligheten av prostatacancerceller ved hjelp av protein kinase Cδ [14]. Videre er det identifisert at medikamentresistens av prostatakreft i løpet av platina-basert kjemoterapi er relatert til proteinkinase Cδ-mediert stabil status av B-celle-lymfom-2 [15]. Tidligere studier har også fremheve betydningen av ENTPD5 som er forbundet med tumordannelse og kreft progresjon av prostata kreft cellelinjer. Disse funnene viser at nedregulering av ENTPD5 uttrykk negativt påvirker evnen til kreftceller til å overleve under vanskelige forhold.
Det er mange rapporter om forholdet mellom ENTPD5 og ondartet svulst vekst, men det er nesten ingen rapportere om sammenhengen mellom ENTPD5 og lungekreft. Nylig Curry et al. rapporterte at undertrykkelse av ENTPD5 i PTEN null dyremodell er tilstrekkelig til å redusere insulinlignende vekstfaktor-1-reseptor-nivået og for å sensibilisere tumorceller bronchiolar til serum sult
in vitro
og til kosttilskudd begrensning
in vivo
[16]. Denne studien bekrefter at ENTPD5 kan være relatert til forekomsten av lungekreft i dyreforsøk.
Med tanke på mangel av ENTPD5 forskning på lungekreft og den viktige rollen ENTPD 5 i prosessen med tumorutvikling, vi laget denne studie for å forstå den detaljerte rolle ENTPD5 i lungekreft cellevekst og invasjon prosess. I tillegg ønsker vi å finne ut om ENTPD5 er et lovende mål i terapi for lungekreft.
Materiale og metode
Cells
Alle lungekreft cellelinjer, inkludert A549, PC9, H1650, H1975, H1299 Skmes-1, og GLC82, ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) og dyrket i RPMI-1640 supplert med 10% føtalt bovint serum (Gibco, USA ), 100 U /ml penicillin, og lg /ml streptomycin (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 og 37 ° C.
sekvensene til ENTPD5 siRNA og ikke-støydempere kontroll siRNA var 5’CCUGGGAUUUGGAUUGAAATT -3 «og 5’UUUCAAUCCAAAUCCCAGGTT -3», henholdsvis. De sirnas ble generert av Genepharma (Shanghai, Kina). De sirnas ble transfektert inn i A549 celler og PC9 celler ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) etter produsentens protokoll.
Pasienter
Lungekreft prøver (n = 131) og matchet tilstøtende normalt vev ble oppnådd fra pasienter uten preoperativ strålebehandling eller cellegift i Beijing Cancer Hospital fra 1999 til 2011. Før skrevet og informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter og eller deres familier. Studien ble godkjent av etikkomiteen av Peking University. Clinicopathological karakteristikker av svulster ble definert i henhold til svulsten metastaser iscenesettelse system of the Union for International Cancer Control. Clinicopathological faktorer er vist i tabell 1.
Immunohistochemistry
primær pulmonal kreftprøver ble fikset og parafin-embedded. Seksjoner (5 um) ble rutinemessig behandlet, og farget med et kanin monoklonalt anti-ENTPD5 antistoff (Sigma-Aldrich, Poole, Dorset, UK) i en konsentrasjon på 2 ug /ml, etterfulgt av inkubasjon med pepperrot-peroksidase-konjugert kanin anti -kanin sekundært antistoff (Sigma-Aldrich, Poole, Dorset, UK). Positive flekker områder i hele vev delen var gradert etter hvor mange prosent av positivt fargede celler: 0, for 25%; 1, for 25-49%; 2, for 50-74%; og 3, for 75-100%. I denne studien, 0 ble ansett som negativt eller moderat farging, mens 1, 2 og 3 ble betraktet som positive farging.
Kvantitativ sanntids-polymerase kjedereaksjon (QRT-PCR)
Totalt RNA ble hentet ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) etter produsentens protokoll. For modne miRNA kvantifisering, ble en polyA hale tilsatt til total-RNA (100 ng) av poly A polymerase (New England Biolabs, Beverly, MA, USA), etterfulgt av revers transkripsjon med oligo-dT adapter primere og Moloney murin leukemivirus (Invitrogen, USA). cDNA ble syntetisert ved bruk av 2 ug total-RNA ved hjelp av iScript cDNA syntesesett (Bio-Rad, Hemel Hempstead, UK). Primere for ENTPD5 og GAPDH er oppført i tabell 2. GAPDH ble brukt som lasting kontroll. QRT-PCR ble utført ved hjelp SYBR Grønn PCR Master Mix (Toyobo, Osaka, Japan) om Light-Cycler 480 Real-Time PCR System (Roche, USA). Den relative mengde av mirnas eller gener ble normalisert til GAPDH. Data ble beregnet på grunnlag av 2
-ΔCt hvor ΔCt = Ct (Target) -Ct (Reference). Brett endringen ble beregnet ved hjelp av to
-ΔΔCt metode.
Western blotting
Proteiner ble hentet fra celler ved hjelp av RIPA buffer som inneholder komplett proteasehemmer cocktail (Roche, Mannheim, Tyskland ). Proteiner ble separert ved hjelp av natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese og overført til polyvinylidenfluorid membraner. Membranene ble deretter blokkert med 5% fettfri tørrmelk i TBST (15 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,9% NaCl og 0,05% Tween-20, pH 7,4), fulgt av blot analyser ved anvendelse av angitte antistoffer: kanin-monoklonalt anti-humant ENTPD5 antistoff (Sigma-Aldrich, Poole, Dorset, UK), og kanin-anti-kanin-sekundært antistoff (1: 1000). Immunreaktive bånd ble påvist ved hjelp SuperSignal West Femto kjemiluminescenssubstrat. Eksperimenter ble utført minst to ganger med konsistente resultater.
celleproliferasjonsanalyse
Celleformering ble bestemt ved anvendelse av celletelling kit-8-analyse. Celler (2 x 10
3) ble dyrket i 96-brønners kulturplater. Cellene ble resuspendert i RPMI-1640 medium inneholdende 10% FBS, og inndelt i grupper før de blir dyrket i 0, 24 eller 48 timer. Antall levedyktige celler ble bestemt ved å måle absorbans ved 450 nm ved hjelp FLUOstar OPTIMA (BMG LAB-TECH, Offenburg, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Hvert forsøk ble utført i tre eksemplarer
Flowcytometri
Celler ble høstet og analysert for apoptose ved hjelp Annexin V-FITC PI apoptose deteksjon kit (IMGENEX, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Celler ble analysert i FACSCalibur Analyzer (Becton Dickinson, USA) ved hjelp av Cellquest Pro-programvaren.
Transwell invasjon analysen
Transwell invasjonen analysen ble utført i henhold til produsentens retningslinjer. I korthet, 5 x 10
4 celler dyrket i RPMI-1640 medium supplementert med 0,1% FBS ble sådd ut i 24-brønners plater inneholdende RPMI-1640 medium supplementert med 10% FBS som kjemotiltrekkende. Etter 24 timer ble cellene som migrerte gjennom og festet til den andre siden av innskuddet ble fiksert og farget med 0,5% (w /v) krystallfiolett. Invaderende celler på bunnen av filtrene ble fotografert ved hjelp av fluorescens mikroskopi. Fem høy effekt felt ble telt per filter å score for invasjon. Antall celler ble kvantifisert ved hjelp av ImageJ programvare.
sårtilheling analysen
Celler ble dyrket til konfluens i seks-brønns retter før skrape med en 200 mL pipette tips. Avfallet ble fjernet ved grundig vasking med fosfatbufret saltløsning (PBS), og cellene ble videre inkubert i ytterligere 24 timer eller 48 timer etter skade.
cDNA mikromatriseanalyse
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp TRIzol metode (Invitrogen, Carlsbad, California), renset med RNeasy mini kit (Qiagen, Valencia, CA, USA), behandles ved hjelp av en Genechip Expression 3′-amplifiseringsreagenser Kit (Affymetrix, USA), og avhørt med Affymetrix Primeview Menneskelig Gene Expression Array. RNA ble ytterligere renset ved hjelp RNeasy mini kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) i henhold til Affymetrix introduksjoner. For ekspresjon rekke analyse, ble total RNA (250 ng) som brukes til å generere biotin-merket cRNA ved bruk av Genechip Expression 3′-amplifiseringsreagenser Kit (Affymetrix, USA) i henhold til produsentens protokoll. CRNA ble hybridisert til Affymetrix Primeview Menneskelig Gene Expression Array og skannet Affymetrix Genechip matrise Scanner 3000 7G.
tumorigenitet analysen
Seks uker gamle Balb /c atymiske hårløse mus (Vitalriver forsøksdyr, Beijing, Kina) ble injisert subkutant i høyre flanke med 2,0 × 10
6 celler i 0,1 ml PBS. Når tumorer ble dannet, ble kalibermålinger utføres daglig, og tumorvolum (V) ble beregnet ved anvendelse av formelen V = (L x W
2) /2, hvor L var lengden og W var bredden av svulsten. Når tumorer nådde et gjennomsnittlig volum på 30-69 mm
3, ble musene tilfeldig delt i tre grupper (n = 6) for daglig intratumoral injeksjon av ENTPD5-siRNA og negativ kontroll i 16 dager. For hver injeksjon, ble 15 mikrogram miRNA blandet med 15 mL
in vivo
transfeksjon reagens (Entranster-in vivo, Engreen, Kina). Vekstkurver ble plottet ved bruk av gjennomsnittlige tumorvolumet i hver eksperimentell gruppe på flere tidspunkter. Tumor volumer av musene ble registrert i 16 dager, hvoretter musene ble avlivet. De dissekerte tumorene ble samlet opp og klargjort for etterfølgende analyser. Alle dyreforsøk ble godkjent av dyret midt i Beijing Cancer Hospital.
Terminal deoksynukleotidyltransferase-mediert dUTP nick-end merking (TUNEL) assay
Terminal deoksynukleotidyltransferase-mediert dUTP nick-end merking (TUNEL) assay kit (in situ celledød Detection Kit, Beyotime institutt for bioteknologi, Kina) ble brukt for å vurdere antall apoptotiske celler. Frosne snitt ble fiksert i 4% paraformaldehyd i PBS pH 7,4 i 1 time ved romtemperatur og permeabilisert i PBS med 1,0% Triton X-100 i 2 minutter. De ødelagte DNA-endene av døde celler ble merket ved hjelp TUNEL sensoren ved å følge produsentens protokoll.
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS versjon 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA ). Mann-Whitney-testen ble brukt for analyse av kontinuerlige variabler. Chi-kvadrat-test, Fishers eksakte test eller enveis ANOVA-testen ble anvendt for analyse av kategoriske variabler. P 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
ENTPD5 score er korrelert til kjønn, røyk historie og kreft etapper, med negative uttrykk for ENTPD5 fører til lengre overlevelsestid
Å oppdage ENTPD5 uttrykk i lungekreft vev, ble lungekreftceller farget for immunhistokjemisk analyse. Kreftceller viste sterk og diffus cytoplasma farging av ENTPD5 (Fig. 1A-D). Rekorder av ENTPD5 (1-3) i NSCLC ble funnet i 32 tilfeller (24,4%). Blant alle de tilgjengelige parametre, sex, røyk historie og kreft stadier viste signifikant korrelasjon til ENTPD5 score (P 0,05) (tabell 1). Univariat analyse av virkningen av ENTPD5 uttrykk status på prognosen viste at lengre overlevelsestid var signifikant korrelert med negative uttrykk for ENTPD5 (gjennomsnittlig overlevelsestid, 81 måneder vs 45,6 måneder, P 0,001). Kaplan-Meier overlevelseskurve, basert på ENTPD5 uttrykk score, viste at den kumulative overlevelsestiden for pasienter med ENTPD5 negative uttrykk (poengsum = 0, n = 96) var signifikant lengre enn for pasienter med høye nivåer av ENTPD5 (score = 1- 3, n = 31) (fig. 1E). Disse dataene tyder på at ENTPD5 score er korrelert til kjønn, røyk historie og kreft etapper, med negative uttrykk for ENTPD5 fører til lengre overlevelse tid.
ENTPD5 farging av lungekreft vev med (A) 0 poeng, (B ) score 1+, (C) score 2+, og (D) score 3+. (E) Kaplan-Meier analyse av sammenhengen mellom total overlevelse av lungekreftpasienter og uttrykket status for ENTPD5 protein (P 0,001).
Hemming av ENTPD5 uttrykk reduserer kreft celle lunge vekst og øker deres apoptose hastighet
in vitro
for å teste effekten av ENTPD5 på lungekreft cellevekst og apoptose
in vitro
, vi får bygget transient transfeksjon cellemodeller. Evaluering av ENTPD5 uttrykk nivåer i ulike lungekreft linjer, inkludert H1975, H1650, H1299, A549, GLC82, PC9 og SKMES1, viste at SKMES-en hadde den høyeste relative ENTPD5 uttrykk (Fig. 2A). I tillegg knockdown av ENTPD5 induserte signifikant reduserte ENTPD5 ekspresjonsnivåer i PC9 og A549-celler (Fig. 2B og C). Videre cellevekst analysen på PC9 og A549 celler med moderat uttrykk for ENTPD5 viste at knockdown av ENTPD5 betydelig redusert vekst av lungekreftceller (Fig 2D og E). (P 0,001). Apoptose analyse på PC9 og A549 celler viste at knockdown av ENTPD5 økt celle apoptose hastighet sammenlignet med kontrollgrupper (P 0,05) (figur 2F.). Disse data indikerer at inhibering av ekspresjon ENTPD5 reduserer lungekreft cellevekst og øket sin hastighet apoptose
in vitro
.
(A) Ekspresjon av ENTPD5 i forskjellige lungecancercellelinjer. Relativ ENTPD5 uttrykk i (B) PC9 og (C) A549 celler bestemt ved QRT-PCR og Western blotting. Vekstevne av (D) PC9 og (E) A549-celler etter knockdown av ENTPD5-genet bestemt ved vekstanalyse. (F) Apoptose av PC9 og A549-celler etter knockdown av ENTPD5-genet bestemt ved strømningscytometri. Dataene er midler ± SD. Doble stjernene indikerer verdier som er signifikant forskjellige fra hverandre.
nedregulering av ENTPD5 uttrykk reduserer invasjonen evne og bevegelighet av lungekreft celler
in vitro
for å undersøke effekten av ENTPD5 på lungekreft celle invasjon og motilitet
in vitro
, transwell invasjon analysen og sårtilheling analysen ble utført. Transwell invasjon analyse viste at nedregulering av ekspresjon ENTPD5 vesentlig hemmet invasjon evne PC9 og A549-celler (P = 0.000142 og P = 0,00158, henholdsvis) (fig. 3A). Sårheling assay demonstrert at ned-regulert ekspresjon av ENTPD5 dramatisk redusert motilitet PC9 og A549-celler fra 24 timer til slutten av forsøkene sammenlignet med kontrollceller (fig. 3B og C). Disse data tyder på at nedregulering av ekspresjon ENTPD5 reduserer invasjon evne og bevegelighet hos lungekreftceller
in vitro
.
ENTPD5-KD KD eller angir knockdown av lungekreft cellelinjer. Dataene er midler ± SD. Doble stjernene indikerer verdier som er signifikant forskjellige fra hverandre (P 0,05). (B) Sårtilheling av PC9 og A549-celler etter knockdown av ENTPD5-genet sammenlignet med villtype (WT) og normal kontroll (NC) modeller på 0, 24 eller 48 timer. I løpet av invasjon og sårheling forsøk ble caspase 3 tilsatt for å inhibere celle-apoptose.
Caspase 3 kan spille en viktig rolle i apoptose av lungekreftceller etter knockdown av ENTPD5
for å forstå virkningsmekanismer av proteiner knyttet til lungekreft celle apoptose etter knockdown av ENTPD5 utførte vi genet chip analyse på PC9 og A549 celler, som var hovedsakelig fokusert på tester av celle apoptose veien. For PC9 celler, knockdown av ENTPD5 økt ekspresjon av noen gener med mer enn 1,5 ganger sammenlignet med kontroll, inkludert CASP4, APAF1, BCL2L11, CASP7, og BCL2A1. For A549 celler, knockdown av ENTPD5 økt ekspresjon av noen gener med minst to ganger sammenlignet med kontroll, inkludert CASP7, MDM2, og BIRC3 (fig. 4A). Av notatet, Caspase 7 (CASP7), et medlem av caspase 3 undergruppe, viste signifikant økt uttrykk etter ENTPD5 knockdown i både PC9 og A549-cellelinjer (fig. 4A). Disse dataene tyder på at Caspase 3 kan spille en viktig rolle i apoptose av lungekreftceller etter knockdown av ENTPD5.
(A) Gene brikke test som viser sti-analyse som var assosiert med apoptose. Caspase genet overekspresjon ble observert i PC9 og A549 celler etter knockdown av ENTPD5. (B) QRT-PCR test viser Caspase tre uttrykk i PC9 og A549 celler etter knockdown av ENTPD5. Dataene er midler ± SD. Stjernene viser verdier som er vesentlig forskjellig fra NC-gruppen (P 0,05). (C) Apoptose av PC9 og A549-celler etter knockdown av ENTPD5 i nærvær av Caspase 3 inhibitor.
Caspase 3-inhibitoren forhindrer økning av apoptose hastighet på lungekreftceller indusert ved knockdown av ENTPD5
for å bekrefte betydningen av caspase 3 i lungekreft celle apoptose etter knockdown av ENTPD5, QRT-PCR og flowcytometri ble utført. Resultatene av QRT-PCR viste at den relative ekspresjon av Caspase 3 mRNA ble signifikant øket ved knockdown av ENTPD5 i begge PC9 og A549-celler (Fig. 4B). I tillegg strømningscytometri viste at ENTPD5 knockdown ikke klarte å indusere signifikant økning av apoptose hastighet i PC9 og A549-celler i nærvær av Casepase 3 inhibitor (fig. 4C). Disse data indikerer at Caspase 3-inhibitoren forhindrer økning av apoptose hastighet på lungekreftceller indusert ved knockdown av ENTPD5.
knockdown av ENTPD5 hemmer veksten og fremmer apoptose av lungekreft celler
in vivo
for å validere effekten av ENTPD5 i dyremodeller, tumorigenicity analysen, Western blotting-analyse, immunhistokjemi og TUNEL analysen ble utført. Tumorvekst status i mus injisert med A549 celler viste at ENTP5-KD gruppe mus hadde mindre størrelser av tumor, lavere hastighet av tumorvolumvekst og lavere slutt svulst vekt enn de i WT og NC gruppene (fig. 5A-C). Western blotting-analyse av tumorvev viste at protein ekspresjon av prolifererende cell nuclear antigen og ENTPD5 ble redusert, men den av Caspase 3 ble øket i ENTPD5-KD gruppe mus sammenlignet med kontrollgrupper (fig. 5D).
(B) Tumor volumendring i ulike grupper av A549-celle injeksjoner. (C) Tumorvekt endring i forskjellige grupper. Dataene er midler ± SD. Doble stjernene indikerer verdier som er vesentlig forskjellig fra NC-gruppen (P 0,05). (D) Former cell nuclear antigen, Caspase 3 og ENTPD5 ekspresjonsstatus i forskjellige dyremodellgrupper bestemt ved Western blotting. (E) immunhistokjemi tester viser ENTPD5, Caspase 3 og prolifererende cell nuclear antigen uttrykk status i ulike dyremodellgrupper. (F) apoptose av tumor vevsceller i dyremodeller etter knockdown av ENTPD5 bestemmes in situ ved hjelp av TUNEL-analysen.
Immunhistokjemisk analyse av ekspresjonen av prolifererende cell nuclear antigen, ENTPD5 og Casepase 3 enig i data oppnådd ved Western blotting (fig. 5E). Videre TUNEL assay av tumorvev viste at nivåene av apoptose i tumorceller ENTP5-KD gruppe mus som var høyere enn de i (fig. 5F) kontrollgruppen. Disse dataene antyder at knockdown av ENTPD5 hemmer vekst og fremmer apoptose av lungekreft celler
in vivo
.
Diskusjoner
Lungekreftprognoserelaterte markører spille viktige roller i mange prosesser, slik som tumorcellevekst, apoptose, tumor angiogenese og tumorcelle-invasjon. I lungekreft, har innføringen av målrettede midler hos pasienter som bærer genetiske avvik resultert i bedre kliniske resultater med bedre livskvalitet. Genomisk ustabilitet eller utvalg fører til avvik som kan grupperes i seks viktige veier: i) anskaffelse av selvforsynt eller autonom vekstsignaler; ii) ufølsomhet for vekst-hemmende signaler; iii) motstand for signaler av apoptose; iv) ubegrenset spredning potensial; v) vedvarende angiogenese; og vi) invasjon og metastasering [17]. Kreftceller manifest komplekse genetiske avvik som oppstår under flertrinns carcinogenesen. Noen molekylære aberrasjoner er mer sannsynlig enn andre for å påvirke den kliniske adferd av kreft, inkludert risikoen for metastasering. Slike avvik, en gang identifisert, kan potensielt tjene som prognostiske markører, som er tumor egenskaper som kan påvirke og forutsi klinisk resultat av kreftpasienter.
overekspresjon av noen markører, slik som vaskulær endotelial vekstfaktor [18] , epidermal vekstfaktor-reseptor [4-6], human epidermal vekstfaktor-reseptor-2 [7], p53 [8] og B-celle lymfom-2 [9], har vist korrelasjon med dårlig prognose. I denne studien bekreftet immunhistokjemi analyse spesifikk overekspresjon av ENTPD5 protein i lungekreft vev. Videre undersøkelser på total overlevelse tyder på at økt uttrykk for ENTPD5 er assosiert med dårligere prognose. Disse observasjonene viser potensialet for ENTPD5 som en prognostisk indikator.
ENTPD5 er identifisert som en viktig komponent i Akt /phosphatidylinositol 3-kinase /fosfatase og tensin homolog reguleringssløyfe, i stand til synergizing aerob glykolyse [19,20 ]. Noen forskere viser at overekspresjon av ENTPD5 påvirker veksten av mange tumorer, slik som gliomablastoma [20], brystkreft [21], livmorhalskreft [22], testikkel bakterie celletumor [23], og laryngeal neoplasi [24]. Tumorgenese er en flertrinnsprosess som involverer cellevekst, invasjon, metastase, og angiogenese. Undersøkelse av effekten av ENTPD5 i mobilnettet progresjon prosess viser at ned-uttrykk for ENTPD5 i A549 og PC9 cellelinjer betydelig reduserer grader av celleproliferasjon, apoptose og migrasjon. Til sammen indikerer disse data at ENTPD5 kan fungere som et onkogen å spille viktige roller i regulering av forskjellige cellulære prosesser som fremmer neoplastisk progresjon på flere nivåer. Likevel er de mekanismer som ENTPD5 utøver sin effekt på bestemte signalbaner som trenger videre studier.
NSCLC-celler er apoptose-resistente. Strategier for å de-undertrykke endogene kaspaseinhibitorer i NSCLC foreslår lovende aktivitet i modellsystemer og presentere en rasjonell og helt ny strategi for å bedre behandling av lungekreft. Apoptose er organisert ved sekvensiell aktivering av kaspaser, en familie av cysteinproteaser med spesifisitet for asparaginsyrerester. To veier kan megle apoptose: i) død reseptorer pathway (tumor nekrose faktor, Fas ligand eller TRAIL reseptorer) som aktiverer caspase 8 og 10, og ii) mitokondrie sti som aktiverer caspase 9. Begge veier fører til effektor caspases 3, 6 og 7 [25]. Vår forskning har bekreftet forholdet mellom ENTPD5 og caspase 3 i cellenivå og dyreforsøk. Forståelsen av den molekylære basis for denne fenotype er kritisk, dersom behandlingen for å bevege seg utenfor det terapeutiske platå som er oppnådd med konvensjonell kjemoterapi. Caspase 3 ekspresjon kan være forbundet med følsom prosess av kjemoterapi eller stråling [26]. MacCarthy et al. rapporterte at unormal ekspresjon av ENTPD5 i human colorectal carcinoma-celler kunne påvirke ATP-nivåer og motstanden mot oksaliplatin, en kolorektal cancer-kjemoterapeutiske middel relevant [27]. Villar et al. også funnet sammenheng mellom ENTPD 5 og kjemoterapi respons i prostata kreft 15]. Det ser ut til at ENTPD5 uttrykk ikke bare kan være et kraftig reporter for metabolsk endring i tumorceller, men også en mulig prediktor for tumor-kjemoterapi responser. Denne studien fant at ENTPD5 hemmet apoptose av lungekreft celler gjennom caspase 3. Men forholdet mellom kjemoterapi effekt og ENTPD5 trenger videre forskning i fremtiden. I konklusjonen, er ENTPD5 genet avgjørende i NSCLC. Det kan potensielt brukes til å overvåke prognose eller å veilede aktuelle terapiregimer.
Takk
Dette arbeidet ble støttet av Beijing Science New Star Plan (nr Z11111005450000) og Natural Science Foundation of China National (nr 81101598).
