Abstract
Bakgrunn
Mens den klassiske NF-kB /p65 veien er kjent for å være involvert i prostata kreft progresjon og er assosiert med dårlig pasient utfall, rollen til NF-kB /relB alternativ protein ikke er godt definert. Her analyserte vi aktivering av både NF-kB baner i prostata kreft vev og relatere denne aktiveringen med kliniske trekk ved sykdommen.
Metoder
En flere immunfluorescens teknikk ble ansatt for å samtidig og kvantitativt visual kjernefysiske lokalisering av p65 og relB i 200 parafin innebygd prøver. Epitel ble definert ved hjelp av egnede fluorokromkonjugerte markører og de resulterende Immunofluorescent signalene ble kvantifisert med en automatisert poengsystem.
Resultater
Atom hyppigheten av p65 ble funnet å være signifikant økt i tumorvev sammenlignet med normal tilstøtende vev, mens frekvensen for relB ble redusert (p 0,001, Wilcoxon test). Som tidligere rapportert, var p65 kjernefrekvens forbundet med en risiko for biokjemisk tilbakefall. Selv om relB atom frekvens alene ikke forutsi gjentakelse, tilstedeværelsen av aktiverte relB redusert risiko for tilbakefall forbundet med aktivering av p65.
Konklusjon
For første gang p65 /relB co- distribusjon ble vurdert i prostata kreft vev og foreslo en negativ crosstalk mellom de to NF-kB trasé i prostata kreft progresjon
Citation. Labouba i, Le Page C, Felles L, Kristessen T, du X, Péant B , et al. (2015) Potential Cross-Talk mellom Alternative og klassiske NF-kB Pathways in Prostate Cancer Vev som målt ved et Multi-Farging immunfluorescens samlokalisering analysen. PLoS ONE 10 (7): e0131024. doi: 10,1371 /journal.pone.0131024
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 9 februar 2015; Godkjent: 26 mai 2015; Publisert: 17.07.2015
Copyright: © 2015 Labouba et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir og tilhørende filer
Finansiering:. Chair en Cancer de la prostata (Université de montréal, https://www.recherche.umontreal.ca/en/research-at-udem/our- forsknings-enheter /profil /forene /449 /pid /15 /) CUOG award (https://www.cuog.ca) Réseau de recheche en kreft (https://www.rrcancer.ca/fr/scientifique/biobanques/lister /2). Visiopharm «gitt støtte i form av lønn for forfatteren TK, men ikke har noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Den spesifikke rolle denne forfatteren er formulert i § «forfatter bidrag «
Konkurrerende interesser:. Den tilhørighet forfatteren TK til selskapet Visiopharm ikke endrer forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer .
Innledning
Prostatakreft er den hyppigst diagnostisert kreft i nordamerikanske menn og er den nest største årsaken til kreft dødsfall hos menn etter lunge og tykktarm kreft [1]. Vanligvis forblir prostata kreft lokalisert inne i prostatakjertelen. Det kan imidlertid også vokser aggressivt utover prostata kapselen og føre til metastasedannelse [2]. Mens noen prostata kreftpasienter som bare krever aktiv overvåking av sykdom, andre trenger mer radikale behandlinger [3, 4]. I dag er de fleste pasienter med lokalisert prostatakreft gjennomgå en operasjon, strålebehandling eller androgen deprivasjon terapi som førstelinjebehandling [5]. Men til tross for høy suksessrate oppnådd med disse behandlingene, 25% av pasientene utvikler biokjemisk tilbakefall (BCR) etter hormonterapi behandling og fremgang til en mer aggressiv sykdom [6, 7]. Dermed vil en stor utfordring i prostata kreft er riktig diskriminering av pasienter med latent eller langsom framdrift sykdom fra de med en mer aggressiv form for kreft. Slik diskriminering vil hjelpe skreddersy behandling hensiktsmessig for den enkelte pasient. For å bedre stratify prostatakreftpasienter prognose, vil identifisering av spesifikke molekylære biomarkører i stand til å forutsi utfallet representere et viktig fremskritt i forhold til eksisterende kliniske verktøy. I denne sammenheng har vår gruppe vært den første til å ta den prognostiske potensialet i p65 subenheten av Nuclear Factor (NF) -κB i prostatakreft [8] og merk en potensiell rolle Nuclear Factor (NF) -κB i prostata kreft progresjon [9, 10].
NF-kB familien omfatter fem transkripsjonsfaktorer proteiner preget av sin Rel-homologi domene. Det er delt inn i to hovedgrupper: klasse I (NFκB1 og NFκB2) og klasse II (RELA /P65, relB, og c-Rel). Den NFκB1 og NF-κB2 er omregnet i P100 og P105 proteiner som er behandlet i sine respektive P50 og P52 subenheter [11]. To hovedveier tak NF-kB signale: den klassiske veien, der heterodimeren p65 /p50 er den viktigste aktive dimer, og den alternative reaksjonsvei hvor relB /P52 er aktiv dimer. Under normale forhold, er NF-kB beholdes inaktivt i cytosol av IkB eller P100 proteiner. Under aktiveringen, i den klassiske veien (IKKβ avhengig), fosforylerer ikk-komplekset IkB, indusere dets ubiquitinering og degradering av proteasomet. Dette fører til kjernefysisk translokasjon av p65 /p50 eller p50 /c-rel dimerer. I den alternative reaksjonsveien (IKKα avhengig), regulerer ikk kompleks behandlingen av p100-forløperen, i motsetning til IkB [12-15], som genererer P52 og den nukleære translokasjonen av P52 /relB-dimer.
Tallrike molekylære og biologiske funksjoner, så som inflammasjon [16, 17], angiogenese [18], overlevelse, migrering og invasjon [19] er blitt vist å være assosiert med aktiviteten til de klassiske NF-kB nukleære faktorer i kreftutvikling ( anmeldt i [20]). Selv om betydelig arbeid har fokusert på studiet av den klassiske NF-kB vei, nylig, har oppmerksomheten blitt rettet mot alternative NF-kB vei, og spesielt i forhold til dens innflytelse på betennelse. De biologiske funksjoner av NF-kB også innebære krysstale mellom de klassiske og alternative veier på ulike nivåer, fra oppstrøms signale til atominteraksjoner via dannelsen av ulike NF-kB dimerer. Avhengig av sammenhengen og stimuli, kan de to reaksjonsveier samarbeide, eller blande seg negativt, i reguleringen av genekspresjon. Videre forblir de biologiske funksjonene i regi av crosstalk fra begge veier dårlig forstått, og har aldri blitt undersøkt i prostatakreftceller.
I prostatakreft, har flere studier rapportert at både relB og p65 kan være mulige prognostiske biomarkører forbundet med sykdomsprogresjon. Vi, og andre, har tidligere observert av immunhistokjemi (IHC) i prostata kreft vev, at forhøyede mengder kjernefysisk p65 var assosiert med mer aggressiv sykdom [8, 21]. Deretter ble det vist at den nukleære lokalisering av p65 er meget prediktiv for lymfeknute invasjon [9] og var forbundet med biokjemisk tilbakefall (BCR), enten alene eller i kombinasjon med aktivert ErbB /Akt signale [21-25]. Mer nylig har vi observert en økt tilstedeværelse av kjerne relB i prostata kreftvev sammenlignet med ikke-neoplastiske vev, og derved antyder at den alternative NF-kB veien blir også aktivert i løpet av sykdomsprogresjon [10]. I tillegg ble det vist i en
in vitro modell
at inhiberingen av relB ekspresjon øker proliferasjonen av 22Rv1 kastrering-resistente prostatakreftceller og stimulerer cellulær autofagi [26]. Andre studier har funnet at relB øker Radiosensitivity av de kastrering-resistente celler [27-30] tilsynelatende ved opp-regulering av IL-8 [31]. I tråd med disse første observasjonene, ble det også vist at relB er overuttrykt i prostatakjertler i respons til androgen deprivasjon [32] og strålebehandling [33], og også induserer ekspresjon av av β-galaktosid α2,3-sialyltransferase, et gen involvert i gangliosider uttrykk og progresjon av kreft [34]. Mer nylig, ble en negativ krysstale mellom vist relB og AR, og tilknytning til overlevelse og metastatisk kreft [35].
For å estimere den rolle relB og krysstale mellom den klassiske og den alternative NF-kB stier, innførte vi et flerfarge fluorescens teknikk, slik som for kvantitativt å analysere den samtidige tilstedeværelse av kjerne p65 og relB i samme prostata kreftvev kjerner. Kvantifisering av det fluorescente signalet ble støttet av et automatisk system. For å evaluere biologiske rolle både NF-kB pathway aktiviteter, korrelert vi den kjernefysiske lokalisering av p65 eller relB med kliniske parametre og risikoen for biokjemisk tilbakefall til bedre undrstand den potensielle rolle NF-kB vei crosstalk i prostata kreft progresjon.
Materialer og metoder
Cohort of pasienter
Den aktuelle studien var basert på en retrospektiv kohort av 200 pasienter med prostatakreft som formalinfiksert parafin Embedded (FFPE) primære prostatakreft prøver, var brukes til å konstruere microarray (TMA). Alle pasientene ble operert mellom 1992 og 2006 og ga informert skriftlig samtykke. Alle tillatelser ble sikkert arkivert i et låst sted og skannet samtykker i en passordbeskyttet elektronisk mappe. Inkludering kriteriet for denne retrospektive kohortstudie var fraværet av noen behandling før Radikal prostatektomi (RP). Etter en screening gjennomgang av kliniske data, ble 11 pasienter ekskludert fra studien, som de ikke oppfyller inklusjonskriteriet. Den gjennomsnittlige oppfølging av pasientene var 96 måneder. BCR (Biokjemisk Gjentakelse) ble definert basert på en PSA (prostata spesifikt antigen) tilbakefall over 0,3 ng.ml
-1 etter datoen for kirurgi (RP). Tilbakefall fritt intervall ble definert som tiden mellom RP og dato for første PSA økning over 0,3 ng.ml
1. Den endelige staging, sortering og histologisk diagnose var basert på klinisk patologi rapport fra Hôpital Notre-Dame, (kompis, Montreal, QC, Canada). Etikk godkjenning er innhentet fra den riktige vurdering bord (Comité d’éthique de la recherche du kompis). Skriftlig samtykke ble sikkert arkivert i et låst sted, og elektronisk skannet samtykke ble reddet i en passordbeskyttet elektronisk mappe. Etikk godkjenning er innhentet fra den riktige vurdering bord (Comité d’éthique de la recherche du kompis). De viktigste kliniske parametre av de 189 tilfellene av kohorten er: Mean oppfølging, 95 måneder; 49% Gleason score 7; 44% poengsum Gleason = 7; 7% Gleason score 7; 18 saker med sædblærene engasjement mot 170 uten; 26% med extraprostatic forlengelse, 32% med positiv kirurgisk margin; 3% med lymfeknute invasjonen; 142 med patologisk stadium 2 og 47 med patologisk stadium 3; kreften bestemt hastighet er 3% og biokjemisk tilbakefall er 28%
Tissue microarrays
Fra FFPE- menneskelige vevsprøver, tumor områder ble valgt basert på vurderinger av Hematoxylin /eosin (H . E ) -stained lysbilder av en patolog. FFPE- tumorvev ble deretter vevsprøve ved hjelp av en 0,6 mm diameter vev arrayer nål og de resulterende kjerner ble kledd inn i et rutenett i en mottaker parafin blokk. Hvert TMA sett inneholdt, en kjerne av en tumorprøve og en kjerne av en normal tilstøtende prostatakjertelvevet for totalt 100 pasienter. Disse TMA ble bygget i to eksemplarer til analyse to uavhengige kjerner i hver vevstype per tilfeller. TMA Prøvene ble seksjonert, farget av både H . E-og immunhistokjemi (IHC) for høy molekylvekt Cytokeratin (HMCK), og deretter senere gjennomgikk en uavhengig patologi gjennomgang for å bekrefte og kommentere den histologi av hver kjerne
immunhistokjemi (IHC)
IHC ble utført ved hjelp av en Benchmark XT automatisert Stainer (Ventana Medical System Inc. VMSI), Tucson, USA). Antigen henting ble utført med Ventana Cell Conditioning en reagens (VMSI # 950-124). De primære antistoffene som ble brukt var: anti-p65 (sc-8008), anti-relB (sc-226), anti-cytokeratin (CK) 18 (sc-6259) og anti-PSA (sc-7638), alle oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, California) og anti-CK19 (ms-198-P0) fra Thermo Scientific Lab Vision (Ottawa, ON, Canada). Spesifisiteten av de ovennevnte antistoffer mot p65 og relB tidligere ble bekreftet ved western-blot [26, 36]. Antistoffer ble fortynnet fra 1:25 til 1: 1000 i en antistoff-fortynningsmiddel-buffer (VMSI # ADB250), med unntak av anti-PSA som ble fortynnet i fosfat-bufret saltvann (PBS). Fortynnede antistoffer ble utlevert manuelt på objektglassene og inkubert ved 37 ° C i 60 min. Reaksjonene ble utført ved hjelp av Ultra DAB deteksjon kit (VMSI # 760-500) og lysbilder ble deretter kontra med hematoksylin og bluing reagens (VMSI # 760-2021 og # 760-2037). Alle deler ble skannet med en 20x 0.75NA objektiv med en oppløsning på 0,3225 mm, ved hjelp av VS-110 lysbilde skanner (Olympus, Richmond Hill, ON, Canada) og analysert offside om side med HW cytokeratin flekker å gjøre rede for godartede kjertler.
immunfluorescens (IF)
Vi produserte en epitelial maske ved hjelp av flere konkrete epitelceller antigener å skille stromal og epiteliale komponenter innenfor vev. For å sikre dekning av alle prostata kreft celler, selv i sine mest udifferensiert tilstand, brukte vi en cocktail av CK18, CK19 og PSA som ble alle merket til å slippe ut i den oransje kanal. Lysbilder ble også farget med DAPI (blå) for å identifisere kjerner. Sekundære antistoffer mot p65 og relB ble merket for å slippe ut i de røde og grønne kanaler, henholdsvis. Dette tillot oss å skille spesifikk farging av p65 og relB i kjernen og cytoplasma av epitelceller
Spesifikt antigen gjenfinning ble først gjennomført med Cell Conditioning 1 (VMSI; # 950-124). Bruker Bench Mark XT automatisert Stainer (Ventana Medical System Inc.). De primære antistoffer mot p65 og relB ble fortynnet 1: 125 i PBS, manuelt påført på objektglass, og inkubert ved 37 ° C i 60 min. Følgende tiltak ble gjort manuelt på benken under forhold for å beskytte lysbilder fra lys. Begge sekundære fluorescerende antistoffer ble inkubert samtidig i 45 minutter ved romtemperatur (RT): anti-mus Cy5 (# A10524, Life Technologies Inc., ON, Canada) for p65 og anti-kanin Alexa Fluor 488 (A488) (# A11008, livet Technologies Inc.) for relB, ble begge fortynnet 1: 250 i 1X PBS. Etter to suksessive vaskinger med 1 x PBS, ble TMA slides blokkert i 60 minutter med mus-On-mus blokkerende reagens (en dråpe i 250 ul PBS, MKB-2213, Vector Laboratories, CA, USA) og deretter inkubert i 90 minutter ved romtemperatur med anti-PSA (1: 100 i PBS). Den TMA Objektglassene ble vasket to ganger og inkubert i 45 minutter ved romtemperatur med et sekundært fluorescerende geit-anti-Cy3 (# 705-165-003, Jackson Immunoresearch Laboratories Inc., PA, USA) fortynnet 1: 250 i 1 x PBS. Platene ble deretter blokkert igjen med mus On Mouse-blokkerende reagens over natten ved 4 ° C. Deretter ble de inkubert i 90 minutter ved romtemperatur med en blanding av anti-CK18 og anti-CK19 (begge ved 1: 100 i 1 x PBS) og deretter 45 minutter ved romtemperatur med sekundært fluorescerende anti-mus Alexa Fluor 546 (A546 antistoff) (# A10036, Livet Technologies Inc.). Til slutt ble objektglassene inkubert i 15 minutter ved romtemperatur med en 0,1% (w /v) løsning av Sudan Black, i 70% etanol for å stanse vev auto-fluorescens. Platene ble montert med forlenge Gold Antifade Mountant med DAPI (P-36931, Life Technologies Inc.) for kjerner farging. Mellom hvert trinn, ble TMA objektglass vasket to ganger med 1 x PBS. Slides ble lagret ved 4 ° C og skannet den påfølgende dagen. En negativ kontroll TMA lysbildet ble også gjort parallelt og inkuberes med 1X PBS i stedet for alle primære antistoffer.
Farging kvantifisering
farging og scoring ble utført blindet til studiet endepunktet. De vevssnitt ble skannet med en Olympus mikroskop og VS110 lysbilde skanner koblet til en OlyVia bildeviser programvare (xvViewer.exe). Fluorescerende farging ble deretter kvantifisert med VisiomorphDP programvare (Visiopharm, Danmark) åpner for en automatisert bildeanalyse. Farging via CK18 /CK19 /PSA markører ble brukt til å begrense analysen til epitel områder som regionen av interesse # 1 (ROI # 1), mens DAPI servert å vurdere fluorescens bare i kjerner (ROI # 2) (S1 fig) . Kjerner med definert ROI # 1 og # 2 ble manuelt gjennomgått for å sikre riktig valg av epitelceller og fjerne omkringliggende vev med nekrose eller betennelses soner fra ROI. Kontinuerlige verdier av fluorescens-intensitet for begge ROI # 1 og # 2 ble deretter oppsamlet ved den VisiomorphDP programvare og overført til Excel for å definere epiteliale og atom NF-kB score. De positive og negative signaler var basert på angitte terskelverdier (midlere intensitet + standardavvik) og anvendt for å beregne hyppigheten av positive kjerner pr kjerne. Gjennomsnittet av tumor kjerner fra den samme pasient ble anvendt for analyse. Den intra klasse korrelasjon (ICC) mellom de dupliserte kjernene var 0,68 og 0,70 (
p
0,001, Spearman). For atom p65 og atom relB henholdsvis
Statistiske analyser
Statistiske analyser ble utført med SPSS programvare 16.0 (SPSS Inc. Chicago, IL, USA). En sammenligning mellom normale og tilstøtende passet tumor kjerner ble vurdert ved hjelp av en ikke-parametrisk Wilcoxon test. Korrelasjonen med clinicopathological variabler ble beregnet med en ikke-parametrisk test Spearman korrelasjon. På grunn av den iboende natur av immunfluorescens ble kjernene ansett positiv for atom NF-kB når verdier var minst 5% over bakgrunnsfarging. Vi brukte Mottaker Operativ Karakteristisk (ROC) kurver beregning fra frekvensen for alle kjerner for å bestemme grenseverdien for hver NF-kB-subenhet i Kaplan-Meier-analysen. BCR-frie overlevelseskurver ble plottet ved hjelp av Kaplan-Meier estimatoren og log-rank test ble brukt for å evaluere signifikante forskjeller. Forholdet av p65 /relB ble beregnet fra frekvensen av kjerne p65 i forhold til atom relB. De univariate og multivariate proporsjonale fare modeller (Cox regresjon) ble brukt for å estimere hazard ratio for hver NF-kB som kategorisk variabel, mens manglende verdier ikke ble vurdert. Multivariat analyse ble utført ved hjelp av en Enter trinnvis risikomodell på univariat analyse som var nødvendig for oppføring i modellen. Et utvalg på n = 10k ble ansett før du påfører den multivariate modellen (n = antall hendelser, k = antall variabler). De covariables ble ikke tidsavhengige. Andre clinicopathological variabler inkludert pre-operasjonslys PSA, Gleason score, kirurgisk margin status, ekstra prostata utvidelse og sædvæske engasjement.
Etikk erklæringen
En etisk godkjenning for studien ble hentet fra den aktuelle review board (Comité d’éthique de la recherche du kompis). En skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltakerne.
Resultater
Immunofluorescent multi-farging analyse av p65 og relB
Formålet med studien er å analysere p65 og relB i normale tilstøtende eller maligne epitelial prostata kreftvev på samme TMA lysbilde ved hjelp av en kvantitativ og semi-automatisert prosess. En kvantitativ analyse gir kontinuerlige data, slik at for et bredere spekter av deteksjon og mer nøyaktig bestemmelse av lav og høy intensitet farging. For å forenkle denne prosessen og oppnå maksimal spesifisitet, valgte vi å implementere et multi immunfluorescens-fargingen teknikk (IF).
Først må vi valgt epiteliale områder som skal analyseres. På grunn av dets kjente konstitutiv ekspresjon i prostatiske epitelceller, cytokeratin 18 (CK18) ble valgt for å identifisere epitel-celler i våre prøver [37]. Imidlertid observerte vi at vevsprøver farget av IHC produserte variable CK18 ekspresjonsnivåer og at fargingen var svakere i dårlig differensierte tumorer (data ikke vist), og dermed redusere nøyaktigheten av tumorcelleidentifikasjon i avanserte prostata kreftvev. For å overvinne dette, valgt vi CK19 og PSA som epiteliale antigener, ettersom de er kjent for å være sterkt uttrykt i prostata epitelceller [37, 38]. Visuell kontroll av samtidig farging av CK18, CK19 og PSA med oransje fluorescerende fargestoffer (A546 for CK18 og CK19, og Cy3 for PSA) bekreftet fulle epithelial dekning av denne tri-antigen farging cocktail, gir sensitivitet og spesifisitet for å identifisere prostata epithelial cellene uavhengig av nivået av vev differensiering (S1 figur).
orange epitelial masken ble anvendt med DAPI nukleær farging for å begrense kvantifisering av p65 og relB til epitel kjerner. Den subenheter p65 og relB ble farget med Cy5 (rød) og A488 (grønn) fargestoffer, henholdsvis (Fig 1). Etter dette firemannsrom IF farging, utførte vi en kvantitativ analyse av p65 og relB fra skannede bilder ved hjelp av immunfluorescens bildeanalyseprogram VisiomorphDP. En terskelverdi for fluorescensintensitet ble definert til å diskriminere positive og negative fluorescente signalene, som ble brukt for å bestemme den spesifikke frekvens (%) av p65- eller RelB- positive kjerner i hvert vev kjerne (inkludert doble positive kjerner) (Fig 1).
A. Epitel farging med CK18, CK19 og Ptil definerer epitel maske ved hjelp av oransje fluorokromer (A546, Cy3). B. Identifisering av epitelareal (presentert i grått for optimal kontrast i senere analyser) som ROI # 1 (region av interesse 1 #). Identifisering av atomkjerner (grå omgitt av rød tracing) som ROI # 2 fra forhåndsdefinerte ROI # 1. P65 og relB fluorescens ble senere evaluert separat i ROI # 1 og # 2. C. relB farging med grønn fluorescerende fargestoff (A488) og p65 flekker med rød fluorescerende fargestoff (Cy5). Trinn 1, 2 og 3 tilsvarer fluorescens analyseprosessen fulgt hjelp Visiomorph DP programvare.
Sammenligning av p65 uttrykk ved hjelp av immunhistokjemi og kvantitativ automatisert immunfluorescens analyse
TMA, som inneholder pasient matchet kjerner fra 200 prostatatumor vev og normal tilstøtende epitel var farget, skannet og evaluert for p65 og relB positivt signal. Etter revisjon av kliniske data bare 11 tilfeller ble ekskludert fordi de ikke oppfylte inklusjonskriteriene lenger. Tilstedeværelse av p65 og relB ble hovedsakelig observert i epitel, med både cytoplasmatiske og kjernefysiske avdelinger utviser positiv farging (figur 2A). Bruk av automatiserte måle- program, var vi i stand til å identifisere negative, enkelt p65 (Cy5) eller relB (A488), og dobbel (Cy5 /A488) farget kjerner (Fig 2A).
A. Forstørrelse (40X) fremhever kjertelstrukturer i prostata kreft vev. Slå sammen: lagrede bilder av relB (A488) i grønt, p65 (Cy5) i rødt og kjerner (DAPI) i blått, i normal tilstøtende (øverst) eller kreftvev (nederst). Pilene viser farget kjerner. B. Sammen kvantifisering fra IHC (til venstre) og IF (høyre) farging av p65. Grafene viser frekvensfordelingen av kjernefysisk p65 som vurderes visuelt (IHC) eller automatisk (IF). C. Frekvens av atom p65 (til venstre), relB (i midten) og doble farget kjerner (til høyre) i normale grenser og tumorvev. Sammenligningen mellom tilstøtende normale og kreft kjerner ble utført med en Wilcoxon test.
For å evaluere resultatene av denne IF teknikk, gjennomført for kvantifisering av atom markører i prostata kreft vev, vi sammenlignet kvantifisering resultater fra automatisert analyse med resultatene som er oppnådd ved hjelp av tradisjonell IHC farging. I begge tilfeller ble frekvensen av P65 fargede kjerner evaluert. Vi har oppnådd en signifikant korrelasjon mellom de to datasett (r = 0,410,
p
0,001 Spearman), som er i samme størrelsesorden som korrelasjonen mellom like kjerner innenfor det gitte teknikk. Den tradisjonelle IHC metoden, basert på visuell score, var ikke i stand til å skille mellom lav (eller ingen) flekker, og dermed føre til en overvurdering av negative p65 uttrykk kjerner (Fig 2B). Ved hjelp av Kaplan-Meier-estimerings kurver, vi også sammenlignet overlevelsen sammenhengen mellom kjerne p65 frekvens og risiko for BCR, som tidligere analysert i en rekke andre prostatakreftkullene [21, 22, 25, 39]. Nuclear p65 ble funnet å være like og signifikant assosiert med risiko for BCR i både tradisjonelle IHC og programvare-analysert IF prøver (log rank = 4,38,
p
= 0,036 og Log rank = 4,83,
p
= 0,0028, henholdsvis). Til sammen disse resultatene validere bruk av automatisert analyse av IF for evaluering av NF-kB subenhet lokalisering og kvantifisering i prostata kreft vev.
Analyse av kjernefysisk fordeling av p65 og relB i prostata kreft vev
Mens p65 kjernefysiske lokalisering ble økt i prostatakreft i forhold til normal tilstøtende vev (fig 2C,
p
0.000, Wilcoxon test), relB utviste en høyere uttrykk i normal tilstøtende vev vs. svulstvev (p = 0,001, Wilcoxon test, figur 2C). Prosentandelen av doble farget P65 /relB kjerner viste ingen signifikant variasjon mellom normale og tumorvev (Fig 2C).
I kreft kjerner, aktivering av den klassiske veien, sett av kjernefysisk p65, var signifikant korrelert med aktivering av den alternative reaksjonsvei, som representert ved kjerne relB lokalisering (r = 0,522, p 0,001 Spearman). Å estimere mengden av interaksjon mellom de to NF-kB trasé, sammenlignet vi den kjernefysiske frekvens for hver subenhet i nærvær eller fravær av den andre subenhet. Når atom relB ble uttrykt, var der en samtidig økning i p65 nukleære lokaliserings frekvens i forhold til kjernene uten kjerne relB (27% og 19%, respektivt). På lignende måte ble tilstedeværelse av kjerne p65 assosiert med en økning i kjernefysiske lokalisering av relB (18% og 10%, respektivt).
Korrelasjon av NF-kB variabler med klinisk-patologiske parametre
Neste vi evaluert sammenhengen mellom atom p65 (som representerer aktivering av den klassiske veien) eller relB (som representerer aktivering av alternativ bane) og clinicopathological parametere. Selv om atom ekspresjonen av disse to proteiner ikke ble signifikant korrelert med de fleste prostatakreft aggressivitet parametere, var det en signifikant korrelasjon mellom kjerne p65 og sædblæren engasjement (r = 0,121, p = 0,048, Spearman, tabell 1) .Furthermore, var det en trend mellom atom relB og pasient Gleason score (r = -0,105, p = 0,081, Spearman, tabell 1).
Analyse av co-uttrykk for p65 og relB
å vurdere rollen til hver NF-kB veien i prostata kreft progresjon og potensialet crosstalk mellom begge veier, brukte vi biokjemisk tilbakefall (BCR) som en funksjonell indikator på disse aktivitetene. Atom hyppigheten av p65 var forbundet med generelle BCR (
p
= 0,028, log rank = 4,843, figur 3A). En Cox regresjonsanalyse bekreftet sammenhengen mellom p65 og BCR i univariate (HR = 1,93,
p
= 0,017) og multivariate modeller (HR = 3,15,
p
= 0,003), inkludert clinicopathological parametere slik som Gleason score, ekstra prostata utvidelse, lymfeknute invasjonen, sædvæske engasjement, og kirurgiske marginer (tabell 2). I motsetning til p65, Kaplan-Meier estimat og univariate Cox regresjonsanalyser viste at relB status alene ikke var forbundet med BCR (
p
= 0,301, figur 3B og tabell 2). Overraskende, hyppigheten av p65 /relB dobbel positive kjerner var ikke signifikant prediktiv av BCR men en trend mot en dårligere prognose ble observert (
p
= 0,078, figur 3C).
Kaplan-Meier biokjemiske tilbakefall frie overlevelseskurver A. Høy ( 20%) og lav ( 20%) hyppigheten av atom p65 i epitel av kreft vev. B. høy (mer enn 5%) og lav (mindre enn 5%) frekvens av atom relB i epitel av kreftvev. Betydning (
p
) er angitt med log rank. C. Double atom epitel farging av p65 og relB. D. epithelial og kjernekraft farging av p65 og relB. Den kB negative variabel representerer pasienter uten positive vev kjerner for p65 og relB. Den variable p65 alene eller relB alene representerer pasienter positive for bare atom p65 eller kjernefysisk relB. Den variable p65 + relB er pasienter med tilstedeværelse av begge atom subenheter i samme kjerne. E. Analyse av epiteliale andel av kjernefysisk p65 til relB i vev kjerner innenfor både p65 og relB farging. Forholdet p65 /relB representerer frekvensen av p65 til frekvensen av relB. Den variable p65 RelB representerer et forhold på minst 2 ganger mer enn p65 relB; p65-relB representerer et forhold mellom 0,50 og 2 ganger, og relB p65 representerer en ratio på minst to ganger mer relB enn p65
aktivitet og samhandling mellom p65 og relB. trasé kan variere mye i løpet av en enkelt vev som kan inneholder en blandet mønster av uttrykk med celler som viser kun p65 eller bare relB mens andre blir dobbelt positiv. For å bestemme de enkelte rollene til p65 og relB, sammenlignet vi pasient vev med aktivering av en enkelt bane, representert ved kjernefrekvens på enten p65 eller relB, og pasienter uten NF-kB aktivitet (figur 3D). Pasienter med bare p65 aktivitet viste en betydelig kortere tid for tilbakefall sammenlignet med pasienter uten NF-kB aktivitet (henholdsvis 138 måneder og 98 måneder, Log rank = 8,8,
p
= 0,002,) eller sammenlignet med pasienter med relB bare (
p
= 0,021, log rank = 5.4, figur 3D). Dette bekrefter at den klassiske NF-kB pathway sterkt fremmer utviklingen av prostatakreft. Omvendt, i vår pasient kohort, relB aktivitet alene ble ikke funnet å påvirke tilbakefall sammenlignet med pasienter uten NF-kB aktivering
(p
= 0,741, figur 3D). Interessant, atom tilstedeværelse av både p65 og relB i samme kjernen ble ikke signifikant assosiert med BCR (
p
= 0,252), noe som tyder på at relB kan motvirke den biologiske effekten av p65.
Å definerer den potensielle av rollen til relB på p65 aktivitet, undersøkte vi effekten av hver bane på den andre i varierende mengdeforhold. Forholdet mellom kjerne p65 og relB ble anvendt for å oppdele pasientens vev med dobbel farging av p65 og relB (figur 3E). Tre kategorier ble gjort: pasienter med en høyere andel av kjernefysisk p65 enn relB (større enn 2 ganger), pasienter med en høyere andel av kjernefysisk relB enn p65, og pasienter med relativt likt antall p65- og relB-positive kjerner (opptil 2 gangers forskjell).
